HPV18E7重组质粒的构建及在大肠杆菌中的表达优化

目的构建HPV18E7基因重组质粒,并探索其在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法以提取的HeLa细胞株中的DNA为模板PCR扩增HPV18E7基因;将HPV18E7基因与载体pET-32a(+)连接为重组质粒pET-32a(+)-HPV18E7;将该重组质粒转入大肠杆菌BL21-DE3-pLysS细胞中,探索优化表达的条件,以获得大量HPV18E7致癌蛋白。结果 PCR扩增的目标基因大小序列与HeLa细胞中的HPV18E7基因的大小序列一致。用LB培养基,IPTG和乳糖诱导表达显示不同浓度、不同温度、不同诱导起始量等表达量均不高,尝试用ZYM-5052自动诱导培养基诱导,HPV18E7融合蛋白的表达量远远高于用异丙基-β-D-硫代吡唃半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导表达的表达量。结论测序正确的HPV18E7重组质粒在自动诱导培养基ZYM-5052中获得远远高于用异丙基-β-D-硫代吡唃半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导表达的HPV18E7融合蛋白。

乳腺浸润性导管癌中HPV18、HPV16感染的研究

目的 :了解乳腺浸润性导管癌中HPV18、HPV16的感染情况 ,分析其是否是乳腺癌发生的危险因素及与临床病理的相关性。方法 :根据HPV16、HPV18的DNA序列 ,合成相应特异的寡核苷酸片段 ,用加尾标记法制备地高辛标记探针 ,用原位杂交法检测 5 1例乳腺浸润性导管癌、10例相应正常乳腺上皮及 15例良性乳腺病变中HPV18、HPV16的感染 ,并分析其与患者发病年龄、肿块大小及淋巴结转移的相关性。结果 :浸润性导管癌中HPV18或 16的总阳性率达 70 6 % ,其中HPV18与HPV16的阳性率分别为 5 8 8%、4 5 1% ,均明显高于正常乳腺上皮的感染率 (30 0 %、10 0 % ;P <0 0 5 ) ;乳腺良性病变的HPV18、16阳性率分别是 6 0 0 %、6 0 % ,其中HPV18的阳性率亦显著高于正常乳腺上皮 (P <0 0 5 )。结论 :(1)HPV16和18可能是乳腺浸润性导管癌发生的致病因子 ,HPV18尚可能与乳腺良性病变的发生有关。 (2 )HPV的感染与患者年龄、肿块大小及淋巴结转移无相关性。

siRNA抑制HPV18E6基因及其对HeLa细胞凋亡的影响

目的研究特异小干扰RNA(sm all interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞中人乳头瘤病毒(hum an pap-illom avirus,HPV)18型E6基因的抑制及其对细胞凋亡的影响。方法针对HPV18E6基因设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,利用L ipofectam ineTM2000脂质体转染HeLa细胞,在U6启动子的作用下于细胞内转录siRNA。针对转染后不同时间点采用四唑盐(MTT)比色法测定细胞活力,流式细胞仪PI染色法检测细胞凋亡率,RT-PCR测定HPV18E6 mRNA变化。结果转染siRNA后细胞活力受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,72 h的凋亡率达到55.8%。RT-PCR结果显示,细胞转染24、48和72 h后HPV18E6 mRNA分别减少了57%、78%和40%,而siRNA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论siRNA可特异有效的干扰宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达,从而可诱导肿瘤细胞凋亡。

HPV18 E6 siRNA对宫颈癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响

目的探讨HPV18 E6siRNA联合紫杉醇应用对宫颈癌细胞生长的影响。方法用RNAi抑制HeLa细胞中HPV18 E6蛋白的表达。Western blot检测E6、P53和P21的蛋白表达量,MTT法检测细胞的增殖活性及细胞对紫杉醇的敏感性。结果抑制HPV18 E6的表达后,P53和P21的表达量均显著升高,HeLa细胞的生长受到抑制(P<0.01)。加入紫杉醇后,细胞增殖速度较对照组明显降低(P<0.01)。结论HPV18 E6siRNA可有效沉默HeLa细胞中E6基因的表达,抑制细胞增殖,并提高细胞对化疗药物的敏感性。

植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的重叠PCR合成

目的以重叠PCR方法合成植物偏爱密码子优化后的人乳头瘤病毒18L1全长基因。方法自GenBank获取国内外所发布的HPV18L1全长基因序列,经生物信息学分析后选定目标序列,经Synthetic Gene Designer及JCat(JavaCodon Adaptation Tool)分析软件将此序列原始密码子改造为植物偏爱密码子,在C端加入蛋白纯化标签His-tag,获得改造后的HPV18L1全长序列(mHPV18L1)。结合酶切位点分析将mHPV18L1设计为204～477bp的五个大片段LS1-LS5,再将每个大片段分割成57～59bp的5～11个寡聚核苷酸短链,设计合成5对内引物和1对外引物,经重叠PCR扩增获得mHPV18L1全长基因,纯化后将其克隆入pMD18T载体,酶切、测序鉴定插入子。结果以重叠PCR成功扩增获得mHPV18L1全长,pMD18T-mHPV18L1重组质粒经酶切、PCR鉴定均得到预期1749bp大小的片段,并经测序验证。结论获得以植物偏爱密码子进行序列优化的mHPV18L1全长基因及其重组质粒pMD18T-mHPV18L1,为后续mHPV18L1的植物转化研究奠定了一定的工作基础。

肛周HPV18阳性鲍温病1例

患者男,58岁,肛周红斑,逐渐隆起,伴糜烂、渗液、疼痛1年。肛周见一类圆形暗红色斑块,边界清楚,大部分不规则隆起,部分疣状增生,呈鲜红色,表面湿润,少许糜烂。触之较硬。皮损处活检组织病理示:肛周原位鳞状细胞癌(鲍温病)。人乳头状瘤病毒分型检测:HPV18阳性。治疗:广泛的病灶切除。

应用DNA芯片鉴定HPV18 E6-siRNA诱导HeLa细胞凋亡的分子机制

高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的E6基因在宫颈癌的发生中起关键作用,特异siRNA能有效抑制宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.为进一步探讨HPV18E6-siRNA诱导HeLa细胞凋亡的分子机制,针对HPV18E6基因设计siRNA序列,利用人源U6启动子为模板,经PCR表达框架法体外扩增,转染宫颈癌HeLa细胞抑制HPV18E6基因表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡.对转染前后HeLa细胞总RNA样品进行荧光标记后,与Agilent Human1A寡核苷酸芯片杂交、扫描、数据分析及标准化处理,确定表达差异的基因并经荧光定量PCR对部分基因进行验证,结合PANTHER数据分析系统,将这些基因按照生物学功能进行归类,查阅GenBank数据库及相关文献,对其结果进行深入分析及讨论.在检测的18 716个基因和EST中,共筛出差异表达基因359个,其中307个基因表达上调,52个基因表达下调,主要包括细胞周期相关基因CCNG1、p21;凋亡相关基因CASP4、CASP6、IGFBP3、DFFA;泛素蛋白酶解途径相关基因E6-AP、UBE2C;角化细胞分化相关基因KRT4、KRT6E、KRT18;抑癌基因RECK、VHL等.研究结果表明,HPV18E6基因抑制引起的细胞凋亡效应主要是通过P53信号途径和泛素蛋白酶解信号途径调节细胞周期相关基因和凋亡相关基因的表达,从而抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡.同时,抑癌基因的激活,角化细胞分化和免疫相关基因的表达上调,都说明了E6抑制后肿瘤细胞恶性转化程度的下降.

HPV18E2基因在宫颈癌及癌前病变组织中的表达及其临床意义

目的观察HPV18 E2基因在宫颈癌及癌前病变组织中的表达及探讨其临床意义。方法应用RT-PCR法检测39例患者的宫颈组织HPV18 E2基因的表达,以光镜下病理学诊断作为CIN分级标准。结果HPV18 E2基因主要在宫颈癌前病变组织表达,其中CINⅠ中E2基因表达率最高占60%,CINⅡ中为33.3%,CINⅢ中为28.6%,而癌组织及慢性炎症中没有表达。结论提示以HPV18 E2蛋白为靶点来研制多肽疫苗,能在HPV18所致疾病的早期及时阻断病变的进一步发展。

抗HPV16E_6与抗HPV18E_6核酶的设计、表达与活性鉴定

获得特异性抗人乳头瘤病毒（Ｈｕｍ ａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍ ａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）１６ 型和１８ 型Ｅ６ 基因的核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍ ｅ），用以在基因调控水平防治ＨＰＶ相关性肿瘤。采用计算机软件针对ＨＰＶ １６Ｅ６ 基因和ＨＰＶ １８Ｅ６ 基因，设计相应的ｒｉｂｏｚｙｍ ｅ；体外合成核酶基因后，克隆于原核表达质粒中。将ＨＰＶ１６Ｅ６ 、ＨＰＶ１８ Ｅ６ 基因片段也克隆入原核表达质粒中，体外转录而得到核酶和病毒ｍ ＲＮＡ，进行体外切割实验以鉴定核酶的活性。抗ＨＰＶ１６Ｅ６核酶与抗ＨＢＶ１８Ｅ６ 核酶（抗１６ＨＲｚ和抗１８ＨＲｚ）被装入ｐＲＧ５２３载体中，体外转录后能将核酶独立地释放出来。体外切割实验证明抗１６ＨＲｚ和抗１８ＨＲｚ分别能准确、有效地识别和切割靶ＲＮＡ片段。所获得的抗１６ＨＲｚ和抗１８ＨＲｚ核酶能特异性切割靶ｍ ＲＮＡ。

p16^(INK4A)和HPV16 E7/HPV18 E6在ASCUS中的表达及临床意义

目的:探讨p16 INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6在宫颈细胞学诊断为非典型性鳞状细胞不明确意义型(ASCUS)中的表达及筛查潜在宫颈病变的价值。方法:对150例ASCUS患者行阴道镜检查并取活检,同时对该150例患者的TCT标本进行免疫细胞化学染色检测p16INK4A的表达和RT-PCR法检测其中HPV16型E7蛋白和18型E6蛋白(HPV16 E7/HPV18 E6)mRNA的表达。结果:p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA在ASCUS中表达的阳性率分别为37.33%和46.67%,随着病理级别的增加,p16INK4A和HPV16E7/HPV18 E6 mRNA表达的阳性率也随之增加;p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA筛查ASCUS中宫颈病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为0.88、0.95、0.91、0.93和0.81、0.75、0.67、0.86,在p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA阳性的样本中,宫颈病变发生率分别为91.07%和67.14%,均明显高于阴性样本中的发病率7.45%和13.75%(P<0.001);ASCUS中宫颈病变样本中p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA呈高表达,且具有较高的一致性(κ=0.6475)。结论:p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA在ASCUS中病理诊断为宫颈病变的样本中均呈高表达,对筛查潜在的宫颈病变具有重要意义,其中p16INK4A的筛查效能优于HPV16E7/HPV18E6mRNA;p16INK4A能间接反映HPV的转录活性,在ASCUS的分流中有重要意义,且可视性的p16INK4A免疫染色比HPV检测更直观。

HPV18晚期蛋白L1在毕赤酵母菌中的表达及鉴定

目的:用毕赤酵母胞内表达载体构建含人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1基因质粒,诱导表达并进行鉴定。方法:按照毕赤酵母密码子偏爱性原则,合成全长L1基因,然后克隆到pAO819表达载体上,在体外分别构建含一个拷贝和二个拷贝的L1基因载体。线形化后转化到GS115酵母细胞,经G418抗性筛选,获高拷贝重组子并经甲醇诱导表达,表达产物采用化学发光Western blot鉴定,一抗为抗HPV18L1蛋白鼠抗血清。结果:在55kDa处有诱导蛋白免疫印迹出现,并在电镜下观察到HPV18的病毒样颗粒(VLPs),证明该表达系统能表达出HPV18 L1蛋白。结论:本实验构建的毕赤酵母表达菌株,可经甲醇诱导表达HPV18L1晚期蛋白,为进一步研制人乳头瘤病毒18型基因工程疫苗打下基础。

抗原肽HPV18 E7_(7-15)诱导产生特异性细胞毒T细胞的实验研究

目的探讨HLA-A2限制性表位HPV18 E77-15的免疫原性。方法对抗原肽HPV18 E77-15进行T2结合分析;通过体外细胞培养技术抗原肽诱导特异性CTL扩增;采用RPE标记的表位特异性五聚体和FITC标记的CD8+抗体通过流式细胞仪检测抗原肽所诱导产生的特异性CTLs。结果抗原肽HPV18 E77-15可将T2细胞表面HLA-A*0201分子的表达提高2.6倍;在流式细胞仪检测中,抗原肽HPV18 E77-15刺激诱导产生CD8+五聚体+双阳性的抗原肽特异性CTLs为1.87%。结论抗原肽HPV18 E77-15能够诱导HLA-A2阳性正常人外周血淋巴细胞产生特异性CTLs,表明HPV18E77-15具有一定的免疫原性。

HPV18 E77-15免疫原性的实验研究

目的鉴定抗原肽HPV18E77-15能否诱导HLA—A2＋健康供者的外周血淋巴细胞（PBL）产生抗原肽特异性细胞毒性T细胞（CTL），判断其是否具有免疫原性。方法通过体外细胞培养技术分为两组，实验组：负荷抗原肽为HPV18 E77-15，对照组：负荷的抗原肽为HBVc17-28，采用抗原肽负荷外周血单个核细胞（PBMC）及T2细胞作为抗原呈递细胞，重复刺激HLA—A2阳性健康供者的外周血淋巴细胞（PBLs），1周1次，共3次；分别在第1轮刺激后和第3轮刺激后，采用RPE标记的抗原肽特异性五聚体和FITC标记的CD8＋抗体通过流式细胞仪检测抗原肽所诱导产生的抗原肽特异性CTL的频率。结果在流式细胞仪检测中，实验组第1轮刺激后所选淋巴细胞群中CD8＋五聚体＋双阳性的抗原肽特异性CTL为（1．87±001）％，第3轮刺激后抗原肽特异性CTL增至（15．73±2．47）％；而对照组中未检出抗原肽特异性的CTL细胞增殖。结论抗原肽HPV18E77-15能够诱导产生抗原肽特异性CTL增殖，具有良好的免疫原性，可能成为针对HPVl8感染的治疗性多肽疫苗的候选表位。

负载HPV18E7基因树突状细胞瘤苗抗食管癌细胞的体外实验

目的对食管癌细胞EC-109的HPV类型进行测定,检测活化后CTL抗肿瘤的细胞毒活力。方法斑点杂交技术检测食管癌细胞EC-109的HPV类型,MTT方法检测细胞毒活力。结果 LAK、DC、E7-DC细胞均能有效地杀伤食管癌EC-109细胞,细胞毒活性分别为17.72%、32.93%、49.67%,但以E7-DC杀伤力最强。与DC组相比较有显著统计意义。结论负载HPV18E7的DC与未转染的DC比较具有更强的杀伤食管癌细胞活性。

HPV18 E7基因的原核表达及其在宫颈癌患者血清抗体中的检测

目的研究人类乳头瘤病毒18型E7全长基因(HPV18 E7)在原核表达系统中的表达,及其作为特异性抗原在宫颈癌血清抗体检测中的意义,为HPV感染与肿瘤相关的血清学诊断研究奠定基础。方法PCR法扩增HPV18 E7全长基因,构建重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7,转化表达HPV18 E7融合蛋白后经纯化、SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。再以该融合蛋白作为诊断抗原,间接ELISA法检测宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照三组血清特异性IgG抗体水平。结果HPV18 E7融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的35.00%;宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照组的血清特异性抗体均值分别为0.604±0.328,0.287±0.202和0.342±0.225,三组间差异有显著性意义(F=32.771,P<0.01);宫颈癌组与尖锐湿疣组及健康对照组的HPV18E7均值比较,差异均有显著性意义(P均<0.01),而尖锐湿疣组与健康对照组抗体均值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论HPV18 E7融合蛋白具较强的抗原性,对宫颈癌诊断试剂的研究具有应用价值。

HPV18 L1基因重组DNA构建及其免疫小鼠体内特异抗体的测定

目的：人类乳头瘤病毒18型（HPV18）感染与宫颈癌的发生高度相关。其晚期基因L1编码的L1结构蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原。利用HPVL1基因重组质粒进行DNA疫苗的初步免疫学实验研究。方法：从HPV18－pBR322质粒中扩增HPV18L1基因，测序证明扩增片段的可靠性，构建了两个真核表达重组质粒HPV18L1-pcDNA3和HPV18L1－peEP4。将提纯的质粒DNA直接免疫小鼠，用HPV18L1抗原经ELISA检测小鼠血清相应抗体。结果：HPV18L1-pcDNA3和HPV18L1-pcEP4质粒DNA均能在小鼠体内表达并诱导产生HPV18特异性抗体。结论：HPV18L1重组质粒DNA直接注射小鼠可以刺激机体产生抗体。

HPV18E6基因沉默对宫颈癌Hela细胞生长和凋亡的影响

目的:观察RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达对宫颈癌Hela细胞生长和凋亡的影响,探索宫颈癌基因治疗的新途径。方法:针对HPV18E6 mRNA序列合成一对60bp的编码siRNA的DNA模板和一对60bp的非特异性对照DNA模板,构建pSUPER-siRNA和pSUPER-con重组质粒,瞬时转染Hela细胞;采用RT-PCR法检测质粒转染后细胞HPV18E6基因表达的变化,用蛋白免疫印迹法检测转染后Hela细胞p53、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达变化,以细胞计数法检测细胞生长情况,Hoechest/PI双荧光活细胞染色法检测细胞凋亡。结果:pSUPER-siRNA质粒转染能有效降低HPV18E6在mRNA水平的表达,转染后48小时,抑制效率达70%以上;转染后细胞p53、p21和Bax蛋白表达显著增加,Bcl-2蛋白表达减少。RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达后,Hela细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加。结论:pSUPER-siRNA质粒转染可有效抑制HPV18E6在人宫颈癌Hela细胞中的表达,抑制Hela细胞生长并促进其凋亡。以HPV18E6为靶点的RNA干扰技术可望成为宫颈癌基因治疗的新途径。

靶向HPV18E6基因siRNA对HeLa细胞p21、VEGF、Bax和Bcl-2基因的影响

目的探讨针对人乳头瘤病毒18型E6基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对宫颈癌HeLa细胞p21、VEGF、Bax和Bcl-2基因的影响。方法采用脂质体法将特异性siRNA瞬时转染HeLa细胞,半定量RT-PCR检测siRNA转染后HeLa细胞中p21、血管内皮生长因子(VEGF)、Bax和Bcl-2mR-NA的变化,免疫组化检测HeLa细胞中p21和VEGF蛋白的变化。结果RT-PCR检测结果显示转染后24、48、72hp21和BaxmRNA的表达与转染前比较均有升高。转染后24、48、72hVEGF和Bcl-2mRNA的表达与转染前比较均有降低。免疫组化检测结果显示转染后48、72hp21蛋白的表达与转染前比较均有升高。转染后48、72hVEGF蛋白的表达与转染前比较均有降低。结论靶向HPV18E6基因的siRNA可有效干扰宫颈癌HeLa细胞中p21、VEGF、Bax和Bcl-2基因的表达,从而抑制细胞增殖。

高危型人乳头瘤病毒HPV18 E6和E7基因的克隆与表达

目的:HPV18 E6和E7是两个病毒癌基因,存在于宫颈癌He La细胞中。采用双酶切和同源重组两种不同的策略克隆HPV18 E6、HPV18 E7和HPV18 E6-E7串联表达质粒,研究两者在细胞癌变中的作用。方法:首先,从He La细胞中提取RNA,RT-PCR获取E6和E7编码序列,分别用双酶切连接法或同源重组的方法连入不同载体质粒。然后,从He La细胞中提取DNA,PCR法扩增E6-E7编码序列,酶切连接法构建重组表达质粒。结果:经测序正确的质粒转染He La细胞,使用RT-PCR法或者Western-blot法检测目的基因转录与表达均显著升高。结论:HPV18 E6、E7和E6-E7三个表达质粒构建成功,均可在He La细胞中正确表达。