基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

小麦及其祖先物种Hsp70基因家族鉴定与表达分析

热激蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)在植物发育过程以及响应生物和非生物胁迫中起着重要作用。为探究小麦Hsp70基因家族进化关系、功能以及表达模式,本研究对乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草、二粒小麦、粗山羊草以及普通小麦的Hsp70基因进行全面的生物信息学分析,并通过RT-qPCR方法分析其部分Hsp70基因在不同外源激素和环境胁迫条件下的表达模式。结果表明,从乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草、二粒小麦、粗山羊草和普通小麦5个物种中,分别鉴定出30、41、60、28和94个Hsp70基因;系统发育分析表明5个物种Hsp70家族成员分为5个亚家族组,每组成员数量不相等,其中大部分成员分布在第Ⅰ组,且同一亚家族中大多数的Hsp70成员具有相似的基因结构和保守基序;进一步综合分析5个物种Hsp70基因的染色体定位和重复事件,发现Hsp70基因在5个物种的各染色体上分布不均匀,此外从5个物种中共发现12个串联重复事件和110个片段复制事件,表明片段复制事件促进了小麦Hsp70基因家族的扩张;顺式作用元件分析表明,5个物种Hsp70基因的启动子区域存在多种光响应元件、逆境响应元件、激素响应元件以及生长发育调节元件;此外RT-qPCR结果表明,5个物种部分Hsp70基因在不同激素处理和逆境胁迫下具有不同程度的响应,在高温和干旱胁迫下,所选8个Hsp70基因均上调表达。小麦及其祖先物种Hsp70基因的鉴定及其进化过程为进一步研究Hsp70基因在小麦生长发育过程中的功能以及在逆境胁迫下的响应机制提供理论基础。

白背飞虱Hsp70基因的克隆及其对非生物胁迫的响应

【目的】探明热休克蛋白Hsp70基因在白背飞虱适应非生物[杀虫剂、高温/低温和紫外线A(UV-A)]胁迫中的作用,为白背飞虱绿色防控提供参考。【方法】基于白背飞虱的基因组和转录组数据,克隆白背飞虱热休克蛋白Hsp70基因并对其进行鉴定,同时采用RT-qPCR测定其在杀虫剂、高温/低温和UV-A胁迫下的转录水平。【结果】克隆获得1个Hsp70基因,命名为SfHsp70-1,其全长序列为2322 bp,开放阅读框为2001 bp,编码666个氨基酸残基,分子量为72.91 kDa,理论等电点为5.11。SfHsp70-1氨基酸序列中包含3个Hsp70家族蛋白的保守结构域,且在C端具有内质网Hsp70的保守序列“HDEL”。噻虫嗪亚致死浓度表现出显著的剂量效应,LC_(10)胁迫能够诱导SfHsp70-1基因的转录水平显著升高,为对照(丙酮处理)的2.59倍;而LC_(25)胁迫对SfHsp70-1基因的转录水平无显著影响。10℃(30 min)、20℃(30,60 min)和40℃(10,30,60 min)胁迫均能诱导SfHsp70-1基因的转录水平显著提高,依次较对照(25℃)显著提高77.24%、62.00%、85.89%、138.96%、75.67%和61.10%。UV-A(300μW/cm~2)胁迫显著抑制SfHsp70-1基因的转录水平,分别较对照(照射0 min)显著降低87.85%、88.74%、91.91%、89.78%、93.04%和91.16%,且随处理时间延长其表达水平呈逐渐降低趋势。【结论】SfHsp70-1基因的过表达有助于白背飞虱对噻虫嗪和高温/低温胁迫的适应。研究结果可为进一步明确Hsp70基因在白背飞虱适应非生物胁迫中的作用奠定基础,并为制订白背飞虱绿色防控措施提供参考。

烟草Hsp70基因家族的鉴定及NtHsp70Chl基因的表达分析

为探明烟草热激蛋白70(Hsp70)基因家族的特征及烟叶主脉中NtHsp70Chl基因在烘烤条件下的表达模式,对Hsp70基因家族进行了亚细胞定位、系统进化、基因结构、染色体定位,并对NtHsp70Chl基因进行了烘烤条件下实时荧光定量表达PCR分析。结果表明,烟草基因组中Hsp70基因家族共有61个成员,蛋白序列长度不等,等电点在4.52~9.75范围内,各成员蛋白分别定位于细胞质、内质网、细胞外基质、叶绿体和线粒体中;烟草Hsp70基因家族分为6组,定位于叶绿体的成员均存在Ⅵ-a亚组;61个NtHsp70基因分布于18条染色体上,经亚细胞定位于叶绿体的基因分别位于6、17和19号染色体上;烟草Hsp70家族中具有10个基因重复和5个旁系同源基因;经RT-q PCR检测分析,定位于烟草叶绿体中的NtHsp70Chl基因对高温诱导的敏感性较弱。本研究为深入研究烟草Hsp70的功能奠定了基础。

罗非鱼感染链球菌后hsp70基因表达研究

采用实时荧光定量RT-PCR检测吉富罗非鱼感染链球菌后脑和脾脏中热休克蛋白70(hsp70)基因表达情况,并按2-△△CT分析方法、使用7500 Software v2.0.1进行分析。结果表明,罗非鱼感染链球菌48 h内,hsp70 mRNA在脑组织表达变化不明显,而在脾脏中表达升高,攻毒感染24 h后hsp70 mRNA表达量是正常脾脏组织的5.5倍多,说明hsp70在罗非鱼链球菌感染的免疫反应中具有重要作用。研究结果为进一步分析hsp70在罗非鱼感染链球菌过程中所行使的功能奠定基础。

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4(GenBank登录号为EU977182)。该基因全长2182bp,包含1959bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激(4℃)和热激(40℃)1h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。

壳聚糖对香鱼溶菌酶活性和hsp70基因表达的影响

壳聚糖是一种理想的水产动物免疫增强剂和饲料添加剂。为了研究壳聚糖对香鱼非特异性免疫机能的影响,探讨其调节机体免疫功能的机理,以香鱼为研究对象,在基础饲料中分别添加0%、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的壳聚糖,连续投喂35 d后测定香鱼肝脏、脾脏和肾脏组织中溶菌酶活性和免疫相关基因hsp70基因表达的影响。结果表明,基础饲料中添加1.0%壳聚糖可使香鱼肝脏、脾脏和肾脏组织中溶菌酶活性显著提高,溶菌酶活性与对照分别提高了0.8倍、3.1倍和5.2倍。定量PCR分析结果表明,添加1.0%壳聚糖可显著促进肝脏、脾脏和肾脏中hsp70基因的表达量,且hsp70基因表达量与溶菌酶活性表现出一定的相关性,表明壳聚糖可通过调节免疫相关基因的表达来调节香鱼的免疫功能。

维氏气单胞菌感染对西伯利亚鲟血清指标和hsp70基因表达的影响

为研究西伯利亚鲟Acipenser baerii在维氏气单胞菌Aeromonas veronii感染过程中的生理免疫反应,进行了维氏气单胞菌攻毒试验,将体质量为(260.2±37.8)g的西伯利亚鲟从背部肌肉注射菌液浓度为2.0×107cfu/mL的维氏气单胞菌,注射后40h后开始死亡,62h后停止死亡,累积死亡率为46.7%。结果表明:40h对照组和53h处理正常鱼组中的血清皮质醇含量最低,与不再出现死亡后的处理组和对照组无显著性差异(P>0.05),与处理患病鱼各组有显著性差异(P<0.05);62h处理组血清超氧化物歧化酶(SOD)活力最低,与40h对照组、53h处理组、53h处理正常鱼组、93h对照组、93h处理组有显著性差异(P<0.05);93h处理组血清丙二醛(MDA)含量最低,与40h处理组、44h处理组、53h处理正常鱼组、62h处理组有显著性差异(P<0.05),其他各组之间无显著性差异(P>0.05);各处理组血清溶菌酶(LZM)活力从44h开始升高,直到62h,各个处理组均显著高于40h的处理组和对照组以及93h和168h的对照组和处理组(P<0.05);实时定量了肝、鳃、脾、肠组织中hsp70基因表达的变化。研究表明:西伯利亚鲟感染维氏气单胞菌后,血清皮质醇含量和溶菌酶活力升高可作为机体免疫状态的参考指标;热休克蛋白hsp70基因的诱导表达较血清指标变化更为灵敏,hsp70基因在鳃组织最先有较高的诱导表达。

高碳水化合物日粮对异育银鲫血浆皮质醇含量和HSP70基因mRNA表达的影响

为了探讨高碳水化合物饲料是否会引起异育银鲫(Carassius auratus gibelio)的应激反应,选用体质量为(35.60±1.11)g的异育银鲫168尾,随机分成2组,一组设为对照组(NS),投喂碳水化合物水平为35%的日粮;另一组设为高碳水化合物实验组(HS),投喂碳水化合物水平为50%的日粮,每组3个重复。在控温的循环水系统中饲养35 d和70 d后,测定异育银鲫血浆皮质醇激素含量及其肝、心脏、脾、肾中HSP70基因mRNA的表达量。结果显示,高碳水化合物实验组35 d时血浆皮质醇激素与对照组相比较显著升高(P<0.05),肝和心脏HSP70基因mRNA表达较对照组明显增强(P<0.05);70 d时血浆皮质醇激素含量升高,且70 d时高碳水化合物组肝、心脏、脾和肾HSP70基因mRNA表达与对照组相比全部增强。各组饲养70 d后,饥饿24 h后重新投喂的0 h、6 h、12 h、24 h、48 h,高碳水化合物实验组(HS)皮质醇含量在6 h、48 h显著高于对照组(P<0.05),在6 h、12 h、48 h肝HSP70基因mRNA表达与对照组相比均增强(P<0.05),说明异育银鲫对50%碳水化合物含量的饲料的耐受性比较差,鱼体产生了应激反应。结果说明,当异育银鲫血清皮质醇激素含量升高时,其肝中HSP70基因mRNA的表达量却降低,反之亦然。本研究旨在为水生动物营养应激及营养免疫的相关研究提供新的思路,为开辟鱼类应激的营养调节提供科学依据。

黄瓜CSHSP70基因内含子结构分析

【目的】探明黄瓜CSHSP70基因的内含子数目及其结构特点。【方法】根据黄瓜CSHSP70基因cDNA序列设计引物,应用PCR技术从gDNA中克隆CSHSP70基因,采用RT-PCR技术验证内含子的存在。【结果】经测序与拼接,得到长度为4056bp的黄瓜CSHSP70基因,它包含7个内含子。经分析发现这些内含子富含A·T,具有类似启动子和HSE核心结构的序列存在。对黄瓜、甜瓜和丝瓜CSHSP70基因部分序列的比较分析表明,该基因在这3个葫芦科作物中具有很强的保守性。【结论】内含子存在的特殊结构表明其可能对该基因表达具有调控作用。

热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡及其对HSP70基因表达的影响

为探讨热应激对乳腺上皮细胞凋亡的影响,以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,取对数生长期的乳腺上皮细胞分别置于39℃和41℃热处理1 h(以37℃正常培养的细胞为对照),在37℃恢复培养0、6、12 h后收集细胞,采用MTT法检测细胞生长抑制率,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,比色法分析Caspase-3活性,荧光定量PCR检测HSP70基因的表达水平。结果表明,39℃热应激组细胞生长抑制率和死亡率高峰期均发生在热修复6 h,细胞死亡率为15.42%,而41℃热应激组发生在热修复12 h,细胞死亡率高达23.18%;高温处理后,Caspase-3活性呈上升趋势;39℃热应激组在热恢复6 h,HSP70基因表达量显著高于对照组,41℃热应激组在热恢复0、6、12 h,HSP70基因的表达量分别为对照组的3.53倍、5.61倍和2.93倍。综上可知,高温应激激活了Caspase-3活性,从而诱导乳腺上皮细胞凋亡,并随高温强度的增加而作用增强,同时高温诱导了HSP70基因过表达,协助细胞获得热耐受性。

芝麻全基因组Hsp70基因的鉴定与生物信息学分析

利用隐马可链夫模型(HMM)对芝麻全基因组Hsp70基因进行了系统分析,共鉴定出21个Hsp70基因,其中17个属于Dnak基因亚家族,4个属于Hsp110/SSE基因亚家族。根据系统进化树分析和亚细胞定位结果,将芝麻21个Hsp70基因分为6个亚组,其中I亚组3个,定位于叶绿体;II亚组2个,定位于线粒体;III亚组5个,定位于内质网;IV亚组6个,定位于细胞质基质;V亚组4个,属于Hsp110/SSE基因家族;VI亚组1个。芝麻Hsp70基因启动子区域顺式作用元件功能预测结果显示,Hsp70基因参与芝麻的生长发育和逆境胁迫响应等生理过程。

野生花生Hsp70基因家族的全基因组鉴定及生物信息学分析

热激蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)是细胞应对高温和其它胁迫环境时所产生的一类分子伴侣类型应激蛋白。本研究以Arachis duranensis和Arachis ipansis基因组数据库为基础,利用生物信息学方法对Hsp70基因家族进行鉴定分析。结果表明,A.duranensis含有34个Hsp70基因成员,A.ipansis含有35个Hsp70基因成员,两者的直系同源基因大部分分布于两套染色体相近的位置。Ad Hsp70和Ai Hsp70基因家族根据亚细胞定位结果可分4种类型,各类型的Hsp70基因结构相对保守。根据系统进化分析Hsp70基因家族可分为ClassⅠ(Hsp70)和ClassⅡ(Hsp110)两个亚家族,其中ClassⅠ亚家族进一步分为3个小家族,同时揭示Hsp70基因家族成员产生于单双子叶分化之前。GO分析预测表明,Ad Hsp70和Ai Hsp70基因家族功能类别完全一致,各功能类别数目比例变化相似。本研究结果有助于了解花生属植物Hsp70基因家族功能,以期为深入研究花生逆境生理过程中的分子调控机理提供基础。

中国荷斯坦牛HSP70基因3＇-非翻译区多态性与耐热性的关联分析

用PCR-SSCP和测序技术研究了541头中国荷斯坦奶牛热休克蛋白70(HSP70)基因的3'-非翻译区的多态性,并研究了多态性对奶牛产奶性状和耐热性状的影响。设计引物扩增片段大小549 bp,通过PCR-SSCP技术发现参与试验的奶牛出现了3个复等位基因:A、B和C,6种基因型:AA、AB、AC、BB、BC和CC基因型。测序发现复等位基因是由3个新的突变引起的,第6 400、6 600和6 601位碱基分别发生了G/C、C/T和G/A突变。χ2适合性检验表明,该群体在这三个位点的突变没有达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)。中国荷斯坦牛BB基因型个体红细胞钾含量和产奶量下降率显著低于其他基因型个体(P<0.05),表明BB型的中国荷斯坦牛耐热性能优于其他类型。BB基因型个体305 d产奶量高于其他5种基因型的个体,进一步说明BB基因型可能在选育高产抗热应激奶牛中得到应用。

奶牛HSP70基因多态性与生产性能的关系

采用PCR-SSCP方法,对娟姗牛和荷斯坦奶牛HSP70基因5′-侧翼区多态性进行了检测。结果初步显示:A基因可能为抗热应激基因,AB型个体的生产性能与BB型个体差异不显著,耐热性能与生产性能的相关性可能不大。

人食管癌及宫颈癌组织中HSP70基因的表达

目的 了解HSP70基因在不同癌组织中的表达情况。方法 采用人的HSP70基因探针P1 7与从人食管癌及宫颈癌组织中提取的RNA进行Northernblot。结果 食管癌和宫颈癌组织中出现的杂交信号均比正常组织强。结论 HSP70基因在癌组织中有高表达。HSP70可能在癌变过程中起着重要的作用。

嗜热四膜虫五个hsp70基因的表达分析

鉴定得到嗜热四膜虫13个含有完整保守结构域的hsp70基因,对其中5个高度相似且无内含子的hsp70基因进行表达分析。在37、39和41℃热激条件下,实时荧光定量PCR结果表明,hsp70-2基因对热激响应最敏感。在四膜虫生长、饥饿和接合生殖这3种生理或发育状态下,Microarray结果显示,hsp70-4基因恒定且高表达;在热激条件下,hsp70-4基因的表达水平随着温度的升高而略微增加,证实hsp70-4基因为热休克相关蛋白hsc70基因;克隆的hsp70-4基因全长2208bp,开放阅读框长1959bp,编码653个氨基酸。Microarray结果提示,hsp70-3可能参与四膜虫饥饿早期(0～12h)的耐受和接合生殖后期(6～10h)的新大小核形成,老大核凋亡等事件;hsp70-5可能参与四膜虫饥饿晚期(12～15h)的耐受和接合生殖早期(0～6h)的小核减数分裂、小核交换和原核(pronuclear)融合事件。Blast2GO分析表明,与hsp70-3和hsp70-5共表达的基因分别参与不同的生物学过程,进一步反映了hsp70-3和hsp70-5这两个基因在功能上是存在差异的。

牛环形泰勒虫HSP70基因的克隆表达、特性分析及互作蛋白网络构建

为了表达牛环形泰勒虫(Theileria annulata)截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点(pI)为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。

谢氏宽漠王HSP70基因cDNA片段的克隆及热激条件下的表达

谢氏宽漠王Mantichorula semenowi Reitter是一种沙漠指示性甲虫。本研究由该种甲虫体内克隆到两种不同的HSP70基因片段,分别为MsHSP70和MsHSC70。同源性发现表明这两个基因片段与已报道的其他昆虫的热休克蛋白核苷酸序列高度同源。半定量RT-PCR分析显示：经42℃热激1h后立即诱导MsHSP70表达至最高峰;在恢复到室温的1～4h内MsHSP70表达量逐渐降低,但仍然高于未热激对照组。而MsHSC70在42℃热激1h后表达受到抑制,但在恢复2h和4h时有少量的表达,分别仅为未热激对照组的0.25和0.28倍。结果提示MsHSP70和MsHSC70在保护细胞方面具有不同的作用。本实验结果为谢氏宽漠王在极端的沙漠环境胁迫下的抗逆适应性研究提供了理论基础。

两种缘毛类纤毛虫胞质Hsp70基因序列的克隆及其系统发育分析

克隆得到 2种缘毛类纤毛虫———钟形钟虫 (Vorticellacampanula)和螅状独缩虫 (Carchesiumpolyp inum)的胞质Hsp70基因部分序列 ,长度均为 4 38bp ,编码 14 6个氨基酸。以细菌为外类群 ,利用最大似然法和邻接法构建包括其他 5种纤毛虫在内的共 2 6个物种的Hsp70基因氨基酸序列系统发育树 ,其拓扑结构显示 :V campanula和C polypinum聚在一起 ,并与另 2种寡膜纲的嗜热四膜虫 (Tetrahymenathermophila)及草履虫(Parameciumtetraurelia)聚为姊妹枝 ,提示了缘毛类纤毛虫为单系 ,且隶属于寡膜纲的系统发育地位。