HSPA5通过抑制铁死亡调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡

目的:探讨热休克蛋白70蛋白5(heat shock 70 kDa protein 5,HSPA5)通过铁死亡对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测HSPA5和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)在宫颈癌和癌旁组织中的表达情况,通过TCGA数据库分析所有宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌(CESC)中HSPA5与患者总生存率间的相关性。体外培养人宫颈癌HeLa和SiHa细胞系,分别感染shHSPA5和shCtrl慢病毒,构建稳定的宫颈癌HSPA5敲低株,用qRT-PCR和WB检测HSPA5敲低之后铁死亡相关蛋白GPX4的表达情况。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)或激活剂Erastin处理细胞后,采用CCK-8和EdU检测细胞增殖情况;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH含量;还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒分别测定GSH和MDA含量;流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧(ROS)的情况。结果:与癌旁组织相比,宫颈癌组织中HSPA5与GPX4的表达显著升高,HSPA5高表达与患者预后不良有关;在HeLa和SiHa细胞中敲低HSPA5能够抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡;同时细胞内ROS、MDA和LDH的水平上调;HSPA5敲低后GPX4的mRNA和蛋白表达水平同时降低,此外细胞内GSH的含量降低;铁死亡抑制剂Fer-1逆转了HSPA5敲低导致的ROS和LDH的含量升高并抑制细胞凋亡;铁死亡激活剂Erastin和HSPA5敲低联合增加了细胞凋亡并抑制细胞增殖。结论:HSPA5在宫颈癌组织中表达上调,通过敲低HSPA5可激活铁死亡从而抑制宫颈癌细胞的增殖和促进细胞凋亡。

HSPA5 CD44v6在子宫内膜癌的表达及临床价值

目的探讨热休克蛋白5(HSPA5)和CD44v6在子宫内膜癌中的表达及临床价值。方法选取2018年1月至2020年12月上海市长宁区妇幼保健院手术切除的93例子宫内膜癌标本,用免疫组织化学方法作HSPA5和CD44v6的表达检测,结合其临床病理指标,进行统计学分析。结果在93例子宫内膜癌中,HSPA5、CD44v6表达的阳性率分别为71.0%(66/93)和65.6%(61/93)。HSPA5在子宫内膜癌的不同病理分期、是否绝经及肿瘤浸润子宫壁深度不同(浸润子宫壁深度<1/2组;浸润子宫壁深度≥1/2组)的表达结果差异无统计学意义(均为P>0.05);而HSPA5在子宫内膜癌的不同组织学类型、淋巴结有无转移组的表达结果差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.005)。CD44v6在子宫内膜癌的不同临床分期、是否绝经及不同组织学类型的表达结果差异无统计学意义(均为P>0.05);而CD44v6在肿瘤浸润子宫壁不同深度(浸润子宫壁深度<1/2组;浸润子宫壁深度≥1/2组)、淋巴结有无转移组的表达结果差异均有统计学意义(P<0.001,P<0.005)。结论HSPA5、CD44v6在子宫内膜癌中存在高表达,二者与子宫内膜癌的生物学行为有关,在子宫内膜癌的发生、发展中有着重要的调控作用。同步进行HSPA5、CD44v6在子宫内膜癌的表达检测,在判断其预后和指导其临床治疗上有重要价值。

共沉默Birc5和Hspa5的双干扰siRNA质粒载体构建及鉴定

目的构建共沉默Birc5和Hspa5的双干扰siRNA质粒,为进一步以Birc5和Hspa5作为肿瘤生物治疗靶点研究提供基础。方法使用Ambion Target Finder设计Birc5和Hspa5mRNA的干扰序列;挑取酶切鉴定正确的质粒转化菌液Birc5-siRNA和Hspa5-siRNA测序鉴定;采用分子克隆技术构建特异性沉默Birc5和Hspa5的双干扰siRNA质粒,命名为pgsiRNA-Birc5+Hspa5,酶切鉴定;将pgsiRNA-Birc5+Hspa5转染HepG2细胞48h后采用Real-time PCR检测Birc5和Hspa5的mRNA表达水平。结果经酶切鉴定正确的质粒转化菌液Birc5-siRNA和Hspa5-siRNA测序结果显示均为插入正确的克隆质粒;经酶切鉴定分析显示pgsiRNA-Birc5+Hspa5符合酶切鉴定结果;转染pgsiRNA-Birc5+Hspa5 48h后HepG2细胞Birc5和Hspa5mRNA表达均显著下降,未转染组Birc5和Hspa5mRNA的相对表达量均为1.0,pgsiRNA-Birc5+Hspa5组Birc5为0.15(P<0.05),Hspa5为0.37(P<0.05),表明双干扰载体构建成功。结论成功构建了Birc5和Hspa5双干扰siRNA质粒,为进一步同时靶向沉默肿瘤Birc5和Hspa5基因研究提供了工具和基础。

消岩汤通过HSPA5逆转肺腺癌耐药的研究

目的分析肺腺癌耐药细胞株A549/DDP在中药复方消岩汤作用后细胞的差异蛋白并寻找相关耐药靶点。方法通过Label-free蛋白组学筛选出两组关于耐药方面的差异蛋白,利用GO富集分析,PPI蛋白相互作用网络图的构建筛选核心蛋白,Western blot及qRT-PCR方法验证核心蛋白及基因的表达;利用CCK8法检测A549/DDP细胞增殖活力情况,利用流式细胞术检测A549/DDP细胞凋亡情况。在上调HSPA5蛋白表达的基础上,检测消岩汤对A549/DDP细胞增殖及凋亡的影响,以及A549/DDP细胞对顺铂耐药性的影响。结果在中药复方消岩汤作用后的A549/DDP细胞蛋白质谱中找到29种耐药相关差异蛋白质,其中14种上调,15种下调。通过PPI蛋白网络互做分析得出核心蛋白,选择HSPA5进行体外实验验证,结果显示与对照组相比,中药复方消岩汤可以降低A549/DDP细胞中HSPA5蛋白及基因的表达,与蛋白组学结果一致。CCK8及细胞凋亡实验显示,消岩汤可以抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,增强耐药细胞对顺铂的敏感性;上调HSPA5蛋白表达,消岩汤抑制细胞生长及增强细胞对顺铂敏感性的能力减弱。结论HSPA5可作为肺腺癌临床治疗中的一个潜在靶点,消岩汤可以通过下调HSPA5的表达抑制肺腺癌细胞的生长,并逆转其对顺铂的耐药性。

HSPA5基因3′UTR区多态性与肝细胞癌的相关性

目的调查70kDa热休克蛋白5(HSPA5)基因3′非翻译区(UTR)的多态性与HCC发病风险之间的关系。方法从576例肝细胞癌患者和539例在性别和年龄上匹配的健康对照者外周血中提取DNA,采用TaqMan检测HSPA5基因3′UTR区的rs16927997、rs1140763和rs12009。结果连锁不平衡的分析确定了3种单倍型和6种双倍型。等位基因、基因型、单体型和双体型在肝癌患者和正常对照组之间的分布没有显著差异。结论本研究表明,HSPA5基因3'UTR的多态性不是有效预测肝细胞癌风险的诊断标志物。

HSPA5基因3′非翻译区多态性与肝细胞癌预后的关系

目的调查70 kDa热休克蛋白5(HSPA5)基因3′非翻译区的变异与肝细胞癌预后的关系。方法从288例肝细胞癌患者外周血中提取DNA,采用TaqMan检测HSPA5基因的rs16927997、rs1140763和rs12009。Kaplan-Meier方法和Log-rank检验用于评价总生存率。结果 HSPA5单体型的分布与临床特性不相关。单变量分析显示等位基因、基因型、单体型和双体型不影响生存。多重比较结果显示临床特征与病人总的预后无关(P>0.05)。结论中国人HSPA5基因3′非翻译区的变异对HCC的预后没有明显影响。

HSPA5和CD44v6在乳腺癌组织中的表达及其诊断价值

目的探讨热休克蛋白-5 (HSPA5)和细胞粘附分子CD44V6在乳腺癌组织中的表达及其诊断价值。方法收集上海市长宁区妇幼保健院2014年6月至2016年12月收治的乳腺癌手术患者91例,采用免疫组化二步法对其不同病理组织类型的乳腺癌组织进行HSPA5和CD44V6的表达检测,并对表达结果做统计学分析。结果 HSPA5、细胞黏附分子CD44V6在乳腺癌组织的阳性表达率分别为74.7%(68/91)和62.6%(57/91);不同组织学类型及不同肿瘤直径的乳腺癌组织中HSPA5的阳性表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而在组织学不同分级和淋巴结有、无转移的乳腺癌组织中,HSPA5的阳性表达比较差异均有显著统计学意义(P<0.01);不同乳腺癌类型、临床分期、不同肿瘤直径及不同组织学分级的乳腺癌组织中,CD44V6的阳性表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05),而在肿瘤淋巴结转移阳性组和阴性组之间的阳性表达比较,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论 HSPA5和CD44V6对于乳腺癌的发生、发展起到重要的调控作用;HSPA5和CD44V6的阳性表达和乳腺癌的生物学行为有关,将HSPA5和CD44V6同时在乳腺癌进行表达分析,对判断乳腺癌的预后和指导其临床治疗有着重要的意义。

Hspa5和E-cadherin在B6-Co小鼠胚胎后期眼睑中的表达研究

目的:检测遗传性角膜混浊突变系小鼠(B6-Co)与B6小鼠在胚胎后期眼睑组织中Hspa5、E-cadherin基因及蛋白的表达变化,探讨两者与B6-Co小鼠EOB表型形成的内在联系。方法:取B6、B6-Co胚胎期16.5天(E16.5d)、E18.5d小鼠眼睑,用Realtime PCR法和Western Blot法检测眼睑中Hspa5、E-cadherin的m RNA和蛋白表达情况。结果:E16.5d,B6-Co小鼠眼睑中Hspa5表达显著降低,E-cadherin表达显著升高;E18.5d,B6-Co小鼠Hspa5表达显著升高,E-cadherin表达显著降低。结论:Hspa5、E-cadherin的基因和蛋白在B6-Co突变系小鼠眼睑中的表达出现明显异常,提示B6-Co小鼠胚胎发育后期Hspa5、E-cadherin表达变化与EOB表型的形成有密切关联。

基于HSPA5/GPX4信号通路探讨针刀干预膝关节骨关节炎兔软骨细胞铁死亡的作用机制

目的:观察针刀疗法对膝关节骨关节炎(KOA)兔膝关节软骨细胞热休克蛋白A家族成员5(HSPA5)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路的影响,探讨针刀干预KOA软骨细胞铁死亡的作用机制。方法:将27只新西兰兔随机分为正常组、模型组和针刀组,每组9只。采用改良Videman法连续固定兔左侧后肢6周建立KOA模型。造模后,针刀组给予针刀干预,每周1次,连续3周。运用奎森功能障碍指数(Lequesne MG评分)评估兔膝关节局部症状、体征及功能;HE染色法与番红-固绿染色法分别观察兔软骨细胞与组织形态;透射电镜观察兔软骨细胞线粒体结构;运用铁离子试剂盒检测兔软骨组织铁含量;流式细胞仪检测兔软骨组织线粒体膜电位(Δψm)和活性氧(ROS)水平,并计算线粒体损伤率;实时荧光定量PCR检测兔软骨组织HSPA5、GPX4、Ⅱ型胶原α1链(COL2A1)、基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP13 mRNA表达;Western blot法检测兔软骨组织HSPA5、GPX4、Ⅱ型胶原蛋白(COL-Ⅱ)、MMP3、MMP13蛋白表达;免疫荧光法检测兔软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度。结果:干预前,与正常组比较,模型组和针刀组兔膝关节Lequesne MG评分升高(P<0.01);干预后,与模型组比较,针刀组兔膝关节Lequesne MG评分降低(P<0.01)。与正常组比较,模型组兔膝关节软骨细胞数量减少且排列紊乱,软骨结构层次不清,潮线紊乱、模糊不清,线粒体皱缩、线粒体嵴减少甚至消失;与模型组比较,针刀组软骨细胞数量较多,软骨结构层次清楚,潮线恢复,线粒体数量较多,结构正常,有较多的嵴。与正常组比较,模型组软骨组织铁含量增加(P<0.01),细胞呈低Δψm,线粒体损伤率增高(P<0.01),ROS平均荧光强度升高(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4、COL2A1 mRNA及相应蛋白表达降低(P<0.01),软骨组织MMP3、MMP13 mRNA及蛋白表达升高(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度降低(P<0.01);与模型组比较,针刀组软骨组织铁含量减少(P<0.01),软骨细胞Δψm升高,线粒体损伤率降低(P<0.01),ROS平均荧光强度降低(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4、COL2A1 mRNA及相应蛋白表达升高(P<0.01),软骨组织MMP3、MMP13 mRNA和蛋白表达降低(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度升高(P<0.01)。结论:针刀干预能够缓解KOA模型兔膝关节软骨损伤,其机制可能与调节HSPA5/GPX4信号通路维持关节软骨铁稳态,从而抑制软骨细胞铁死亡,缓解细胞外基质(ECM)降解有关。

热休克蛋白A5对雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤的作用研究

目的探讨热休克蛋白A5(HSPA5)对雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤的作用。方法分别用高浓度(1×10^-5 mol/L)、低浓度(1×10^-11 mol/L)的雨蛙肽建立胰腺腺泡细胞损伤模型。分别将pcDNA3.1-HSPA5、pcDNA3.1、shHSPA5和shCon以脂质体法转染胰腺腺泡AR42J细胞,用qRT-PCR法检测细胞中HSPA5 mRNA的表达,MTT法检测细胞活力,Western blot检测细胞中HSPA5的蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果与对照组相比,高浓度和低浓度的雨蛙肽均能造成胰腺腺泡细胞损伤,且HSPA5在其中高表达。敲减HSPA5可加重胰腺腺泡细胞的损伤,过表达HSPA5可减轻胰腺腺泡细胞损伤,还可以逆转雨蛙肽对胰腺腺泡细胞的损伤作用。结论 HSPA5可修复雨蛙肽对胰腺腺泡细胞的损伤,这将为胰腺炎的治疗提供新方向。

比较热休克蛋白A5和3-甲基腺嘌呤和介导小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的:比较研究热休克蛋白A5(HSPA5)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)介导小鼠脑缺血再灌注(I/R)损伤性自噬的保护作用。方法:成年雄性BALB/c小鼠30只,分为6组:sham组、缺血再灌注组(I/R组)、vehicle+I/R组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+I/R组、scramble siRNA+I/R组和HSPA5 siRNA+I/R组,每组5只。采用大脑中动脉阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h制作小鼠I/R模型。Vehicle+I/R组和3-MA+I/R将5μl 0.9%Na Cl或3-MA(30 mg/ml)在MCAO前30 min侧脑室注射;scramble siRNA+I/R group组和HSPA5 siRNA+I/R组将5μl scramble siRNA或HSPA5 siRNA(2μg/μl)在MCAO前24 h侧脑室注射。通过小鼠I/R后神经功能评分确定运动功能障碍程度。小鼠神经细胞内自噬体形成用透射电子显微镜测定,再灌注24 h缺血大脑皮层(LC3)-II/LC3-I表达用Western Blot方法检测。小鼠I/R后缺血大脑神经细胞损伤用Nissl染色进行观察。结果:HSPA5和3-MA可以影响I/R小鼠行为学改变并使脑缺血性损伤和神经症状加重(P<0.05)。透射电子显微镜检测可见,sham组小鼠大脑皮层神经细胞形态正常,I/R组小鼠缺血大脑皮层神经元胞质中细胞器减少,形成自噬体。与sham组小鼠比较,I/R组小鼠缺血大脑皮层LC3-II蛋白表达水平显著增高(P<0.05);3-MA+I/R或HSPA5 siRNA+I/R小鼠缺血大脑皮层LC3-II蛋白表达水平明显低于I/R小鼠(P<0.05)。结论:HSPA5和3-MA在介导小鼠脑缺血再灌注损伤导致的自噬可发挥相同的保护作用,并且促进神经细胞凋亡。

热休克蛋白A5基因多态性与乙肝病毒侵袭的关系

目的探讨热休克蛋白A5基因(HSPA5)与乙型肝炎病毒(HBV)侵袭的关系。方法对210例HBV携带者和194例性别年龄匹配的健康者标本的PCR产物进行基因测序分型。酶联免疫吸附试验(ELISA)或临床化学方法检测HBV感染的血清学标志物。结果病例组的等位基因和基因型分布与对照组相比差异无统计学意义。此外,HBV感染的个体中,ALT/HBeAg和HBV-DNA均与等位基因或基因型的变异无相关性。结论 HSPA5基因的-86 bp T/A多态性与HBV侵袭的临床风险和急性恶化没有相关性。

S100钙结合蛋白A16通过内质网应激促进HepG2细胞脂肪合成

本研究旨在探讨S100钙结合蛋白A16 (S100 calcium binding protein A16, S100A16)在肝细胞脂质代谢中的作用及可能的生物学机制。用脂肪酸培养HepG2细胞(人肝癌细胞系)以建立脂肪酸培养模型,对照模型不加脂肪酸培养,每一模型分成3组细胞,分别用S100a16过表达质粒、shRNA质粒、Vector质粒转染。用试剂盒检测细胞甘油三酯浓度,用油红O染色观察脂滴聚集情况,用免疫沉淀和质谱分析寻找和S100A16相互作用的兴趣蛋白,并用免疫共沉淀验证,用Western blot和qRTPCR进行相关机制研究。结果显示,和对照模型相比,脂肪酸培养模型细胞内脂肪和甘油三酯浓度显著增加。S100a16过表达组细胞内脂肪积累显著高于Vector质粒转染组。热休克蛋白A5 (heat shock protein A5, HSPA5)与S100A16之间存在相互作用。S100a16过表达可上调内质网应激的HSPA5/肌醇依赖酶1α-X结合蛋白1 (inositol-requiring enzyme 1α-X binding protein 1,IRE1α-XBP1)通路相关蛋白(HSPA5、IRE1α和pIREα1)表达水平,并上调脂肪合成相关基因Srebp1c、Acc和Fas mRNA表达水平,而转染S100A16 shRNA质粒可使上述蛋白和mRNA水平低于Vector质粒转染组。以上结果提示,S100A16可能通过内质网应激HSPA5/IRE1α-XBP1通路促进HepG2细胞脂质合成。