B7联合HSV-TK基因对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的 :探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV- TK)和共同刺激因子 B7基因联合使用对乳腺癌动物模型的体内治疗作用。方法 :应用基因重组技术 ,构建分别携带 HSV- TK,B7及 HSV- TK/B7双基因的逆转录病毒载体。以 SHZ- 88细胞株建立乳腺癌动物模型 ,随机分为对照组、TK组、B7组及 TK/B7组 ,每组 2 0只。 2周后于瘤体内分别注射转染有空载体及不同的重组载体的乳腺癌细胞 ,3d后于腹腔内连续注射无环鸟苷 (GCV) 15 d(5 0 mg· kg- 1· d- 1 ) ,观察肿瘤体积、荷瘤生存时间的变化和组织病理改变。结果 :B7组、TK/B7组肿瘤内淋巴细胞浸润明显增多。与对照组相比 ,TK组、B7组肿瘤生长减缓 ,体积减小 ,荷瘤生存期延长 ,两组间均有显著差异 (P<0 .0 5 ) ,而 TK /B7组尤为显著 (P<0 .0 1) ;TK组与 B7组相比则无显著差异。 结论 :HSV- TK,B7基因联合治疗乳腺癌动物模型 ,能直接杀伤肿瘤 ,抑制肿瘤生长 ,延长荷瘤动物的生存期。

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的 :探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV- TK)基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 :应用 PA317细胞包装的逆转录病毒介导的 HSV - TK基因系统 ,在体外以逆转录病毒上清感染法将 TK基因导入 MKN2 8人胃癌细胞 ,并初步观察更昔洛韦 (GCV )对转染 TK基因的 MKN2 8胃癌细胞的杀伤作用。 结果 :TK基因可成功转导入MKN2 8细胞 ,且对细胞的生长状态无明显影响 ,但对 GCV的敏感性却显著增加 ;同时还观察到显著的“旁观者效应”。结论 :逆转录病毒介导的 HSV- TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率 ,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显著的杀伤作用。

hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察

目的 :观察转染有人端粒酶逆转录酶基因 (humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因的人卵巢癌细胞的部分生物学特性。方法 :构建hTERT启动子调控的HSV tk基因重组逆转录病毒载体 ,筛选携带该载体的包装细胞 ,测定包装细胞产生的逆转录病毒滴度 ,并用病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞 (SKOV3/tk细胞 )并经RT PCR方法鉴定。然后倒置显微镜下观察SKOV3/tk细胞形态 ,MTT法研究细胞生长特性 ,并观察转染细胞裸鼠体内的成瘤能力。结果 :包装细胞产生的病毒滴度可达 2× 1 0 3 cfu·ml-1 。SKOV3/tk细胞扩增出 770bp的tk基因片段 ,形态与SKOV3细胞无明显差异 ;倍增时间 72h ,无明显变化 ;裸鼠体内的成瘤能力较SKOV3细胞下降。结论 :hTERT调控的HSV tk基因逆转录病毒载体构建成功 ;

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的 构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果 酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论 成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。

利用HSV-TK基因治疗肝癌的离体研究

利用ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ－ＴＫ基因克隆至逆转录病毒载体（ＸＭ－６／ＴＫ）。经ＰＡ３１７细胞包装后，转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２。结果显示，ＸＭ－６／ＴＫ转染ＨｅｐＧ２细胞与野生型相比，其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物－环氧鸟苷（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）后，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。细胞学检查证实，ＧＣＶ处理后，转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示。

包载携有HSV-TK基因腺病毒PLG微球的制备

目的探讨载病毒生物降解微球作为肝癌基因靶向治疗载体的可行性。方法用挥发溶媒聚合法制载重组病毒聚乳酸乙二醇〔poly(lactic/glycolic),PLG〕微球,观测其包封率、释放规律及释放病毒的活性。结果PLG微球包封率为19.3%,载病毒微球在100h内释放病毒量接近50%,总的释放时间超过200h,释放出来的病毒保持活性。结论用PLG微球包载重组腺病毒,病毒释放出来后具有很高的活性,其作为肝癌的基因治疗载体具有较好的研究前景。

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV -TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK ;采用DOTAP将其转入PA3 17细胞中进行包装 ,筛选 ,并进行病毒滴度测定、收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS73 2和SAOS -2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒 ,HSV -TK基因已整合到宿主细胞基因组中 ,并获得表达。MTT比色法测定结果显示GCV对OS73 2TK和SAOS -2TK细胞均有明显的杀伤作用 ,且前者强于后者。旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度 ,在SAOS -2细胞中的作用强于OS73 2。结论 HSV

膀胱灌注逆转录病毒载体HSV-TK基因治疗大鼠膀胱癌

目的：研究膀胱内灌注逆转录病毒载体单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSVtk)基因治疗膀胱癌的作用。方法：用 N-甲基-亚硝基脲(MNU)膀胱灌注诱导建立大鼠原位膀胱肿瘤模型，该肿瘤与人类膀胱肿瘤病理特点非常相似。随后经尿道膀胱灌注逆转录病毒载体 HSV-TK 基因，腹腔内注射羟基无环鸟苷(ganciclovir，GCV)，连续6天。结果：经尿道膀胱灌注逆转录病毒 HSV-TK 基因后48小时，RT-PCR 检测出膀胱肿瘤中 HSV-TK 基因表达。GCV 处理后，肿瘤体积以及膀胱总重量检测表明膀胱肿瘤的生长被显著抑制。肿瘤细胞 DNA 电泳显示诱导凋亡可能是 HSV-TK/GCV 系统治疗肿瘤的重要机制。结论：经尿道膀胱灌注重组逆转录病毒载体可以向肿瘤转导 HSV-TK 基因。HSV-TK/GCV 系统能抑制鼠原位膀胱肿瘤的生长。

重组含HSV-TK基因腺病毒的构建及对肿瘤细胞的杀伤作用

构建含CMV启动子和HSV-TK基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(AdCMVTK),用PCR及Southern杂交筛选鉴定阳性空斑,证实AdCMVTK含HSV-TK基因。纯化的Ad-CMVTK滴度达10^(12)pfu/ml。GCV对经Ad-CMVTK感染(M.O.I.=100)的HeLa等3种肿瘤细胞的IC50<4μmol/L,同时观察到明显的旁杀伤效应。AdCMVTK/GCV系统的建立为肿瘤基因治疗的研究提供了新的手段。

CEA启动子控制HSV-TK基因表达对人结直肠癌细胞的杀伤作用

构建了以CEA启动子控制的HSV-TK基因表达质粒pCEA-TK。转染pCEA-TK的人结肠癌细胞LoVo对GCV的敏感性提高了1300倍。同样条件下,人宫颈癌细胞HeLa对GCV的敏感性仅提高8倍,且对低于血药浓度(20μmol/L)的GCV不敏感。以上结果显示在GCV存在时,CEA启动子控制下HSV-TK基因的表达使CEA阳性的人结直肠癌细胞获得专一性杀伤。此外,DNA片段分析和电镜观察表明GCV诱导转染pCEA-TK的LoVo细胞发生凋亡可能是这个系统杀死肿瘤细胞的机制之一。本工作还讨论了癌胚抗原(CEA)基因启动子用于人结直肠癌专一性自杀基因治疗的可能性。

阳离子脂质体介导HSV-TK基因治疗人脑胶质瘤的实验研究

颅内恶性肿瘤以胶质瘤最为多见,胶质瘤的预后较差,一直困扰着神经外科医师。本文旨在观察阳离子脂质体介导的HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法:本文将新近克隆并构建的含HSV-TK基因真核表达载体用阳离子脂质体介导转染至人脑胶质瘤细胞中,筛选出阳性克隆,通过MTT、FCM及AgNOR检测转染了HSV-TK基因的FJ905胶质瘤细胞对不同浓度的ACV的反应情况。结果:转染了TK基因的胶质瘤细胞在给予ACV后,细胞发生明显的肿胀、变性,以致形成碎片,而未转染TK基因的胶质瘤细胞变化不明显。转染TK基因和未转染TK的肿瘤细胞经ACV作用后,DNA的含量分别为65.81和109.43,两者之间差异显著(P<0.05)。AgNOR嗜银染色测定结果,转染了TK基因和未转染TK基因的肿瘤细胞经ACV作用后,两者测定结果分别为6.67±1.03和14.83±1.47,两者之间差异极显著(P<0.01)。结论:转染了TK基因的胶质瘤细胞对ACV的敏感性明显提高,ACV能明显抑制转染TK基因细胞的DNA合成;HSV-TK/ACV治疗后,人脑胶质瘤细胞的增殖活性降低了。提示HSV-TK/ACV系统可为胶质瘤的基因治疗提供一种可探索的方法。

HSV-tk基因转导对涎腺腺样囊性癌细胞生物学特性的影响

目的:检测单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因的转导对高转移性涎腺腺样囊性癌细胞(ACC-M)生物学行为的影响。方法:对基因转导细胞作生长曲线测定、电镜观察、细胞周期检测、细胞表面组织相容复合物(MHC)类和类分子表达变化的测定。结果:HSV-tk基因转导组和亲本肿瘤细胞组无明显差别。

HSV-tk基因特异性杀伤大肠癌细胞的实验研究

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ｔｋ）基因在大肠癌组织细胞中特异地表达，以达到靶向基因治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动ｔｋ 基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡｔｋＮａ，然后以重组逆转录病毒上清感染法将重组组织特异性载体及非组织特异性载体分别转导入高分泌ＣＥＡ 的大肠癌ＬｏＶｏ 细胞中，以Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后给予前药更昔洛韦（ＧＣＶ）进行敏感试验。结果：转导组织特异性ｔｋ 基因的ＬｏＶｏ 细胞较转导非组织特异性ｔｋ 基因的ＬｏＶｏ 细胞对ＧＣＶ的敏感性显著增高（Ｐ＜ ０．０１，ｎ＝ ９）。体外实验中还观察到明显的“旁观者效应”。结论：ＣＥＡ ＴＲＳ可调控ＨＳＶ－ｔｋ 基因在ＣＥＡ阳性分泌大肠癌细胞中特异性表达，达到了靶向杀伤肿瘤的目的。

HSV-tk基因对实验性血管成形术后再狭窄的抑制作用

为探讨转染单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶｔｋ）基因联合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）治疗方案用于治疗冠状动脉成形术后再狭窄的可行性，构建了携带ＨＳＶｔｋ基因的复制缺陷型逆转录病毒，利用该病毒将ＨＳＶｔｋ基因转染至体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）和大鼠腹主动脉再狭窄模型的损伤动脉中，并均给予ＧＣＶ，分别观察上述处理对ＶＳＭＣ的增殖和新生内膜的形成是否有抑制作用。结果：该方案使培养的ＶＳＭＣ增殖受抑制，抑制程度对ＧＣＶ有剂量依赖关系；既往在恶性肿瘤中发现的旁观者效应，在培养的ＶＳＭＣ中也存在。同时，该方案使大鼠腹主动脉再狭窄模型的新生内膜面积减少。但单纯转染ＨＳＶｔｋ基因或单纯应用ＧＣＶ无论在体外还是在体内均无上述抑制作用。提示本基因治疗方案对人类冠脉成形术后再狭窄有治疗价值。