Hedgehog通路相关分子SMO、Gli-1在放疗诱导HeLa-229细胞株的激活研究

目的:研究Hedgehog(Hh)通路相关分子SMO、Gli-1在放疗诱导宫颈癌HeLa-229细胞株中的变化。方法:采用多次不同分割剂量照射技术方法对HeLa-229细胞株进行放疗处理,照射剂量及次数分别为0Gy(T-1组)、2Gy×12次(T-2组)、4Gy×6次(T-3组)和6Gy×4次(T-4组)。采用克隆形成实验测定细胞克隆能力,流式细胞学检测细胞周期分布情况,实时荧光定量PCR(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)检测细胞中SMO、Gli-1在Hh通路中的表达情况。结果:T-1、T-2、T-3和T-4组中HeLa-229细胞的克隆形成率分别为(15.3±3.5)%、(89.3±5.1)%、(52.0±4.4)%和(55.0±15.0)%,S期细胞比例分别为(23.7±5.5)%、(23.6±2.7)%、(20.2±2.1)%和(20.0±2.5)%,增殖指数分别为(36.9±5.0)%、(34.1±3.5)%、(30.0±2.3)%和(30.1±4.1)%。RT-PCR检测结果显示,与T-1比较,T-2组中SMO表达上调(P<0.05);T-2及T-4组中Gli-1表达均显著上调(P均<0.05)。Western blot检测结果显示,与T-1比较,T-2组中SMO表达显著上调(P<0.05);T-2组中Gli-1表达上调(P<0.05)。结论:小剂量诱导照射对HeLa-229细胞株的Hh通路中SMO与Gli-1表达影响最显著。

黄芩茎叶总黄酮对人宫颈癌Hela细胞株体外生长的影响

目的探讨黄芩茎叶总黄酮(SSTF)治疗人宫颈癌的可行性。方法配制含人宫颈癌细胞的细胞悬 液(4×105个／ml),取96孔板,每孔接种细胞悬液100μl,阴性对照组设6个孔均不点药,阳性对照药为5-氟尿嘧 啶(5-Fu),取0.01、0.1、1、10、100μg／ml5个浓度,SSTF选取浓度与5-Fu相同,每个浓度点3个孔,37℃5％CO2 培养48-72小时后采用MTT法在酶标仪上以570nm波长测定吸光度(A),计算SSTF和5-Fu抑制Hela细胞 株体外生长的抑制率和半数抑制浓度(IC50)。结果 SSTF、5-Fu均可明显抑制肿瘤细胞的生长,其IC50分别为 20.5、10.5μg／ml。结论SSTF能抑制人宫颈癌Hela细胞体外生长,具有一定细胞毒性作用,可作为临床治疗宫 颈癌的药物进一步深入研究。

RUNX2在宫颈鳞癌组织中的表达及其siRNA对Hela229细胞RUNX2表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨RUNX2蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况及RUNX2 siRNA对宫颈鳞癌Hela229细胞RUNX2基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用免疫组化技术检测50例宫颈鳞癌、30例宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)及30例正常宫颈黏膜组织中RUNX2蛋白的表达情况,并分析宫颈鳞癌组织中RUNX2蛋白表达与临床病理特征的关系。设计合成RUNX2 siRNA,通过脂质体将其转染至Hela229细胞,同时设立空白对照(不转染)和阴性对照(转染非特异性siRNA)细胞组。转染24、48、72 h后,采用MTT法检测各组细胞增殖,计算增殖抑制率;转染72 h后,采用RT-PCR及Western blot技术检测细胞中RUNX2 mRNA及蛋白的表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:宫颈鳞癌组织中RUNX2阳性表达率高于HSIL及正常宫颈组织(P<0.001);宫颈鳞癌组织中RUNX2蛋白的表达与肿瘤的临床分期有关(P=0.004)。与空白对照组和阴性对照组比较,RUNX2 siRNA组Hela229细胞增殖抑制率、RUNX2 mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论:RUNX2基因的高表达与宫颈鳞癌细胞的增殖关系密切。

氯丙嗪对体外培养人宫颈癌Hela细胞株的生长抑制作用

目的:探讨氯丙嗪对人宫颈癌Hela细胞株的体外抑制作用。方法:采用MTT测定法,观察不同浓度氯 丙嗪(0μmol/L,3.0μmol/L,6.0μmol/L,12.5μmol/L,25.0μmol/L,50.0μmol/L,100.0μmol/L)作用后体外培养 的人宫颈癌Hela细胞的细胞增殖抑制率,并于用药后不同时间点观察细胞形态学变化。结果:不同浓度的氯丙嗪 对Hela细胞生长均有抑制作用,随药物浓度的增加,抑制作用加强。氯丙嗪浓度为3.0μmol/L即呈现明显的生长 抑制作用,抑制率为7.91%;浓度为100.0μmol/L时抑制率最高,达59.39%。用药4h后镜下即可见部分细胞贴 壁性降低,肿胀呈球形,核膜溶解,不见核的轮廓;部分细胞裂解呈碎片状;用药8h后碎片明显增多。结论:氯丙嗪 对人宫颈癌Hela细胞株具有体外生长抑制作用。

p65 siRNA联合顺铂对宫颈癌HeLa229细胞增殖及侵袭力的影响

目的通过RNA干扰(RNAi)阻断宫颈癌细胞HeLa229中核因子(NF)-κB信号通路,观察其单独或与顺铂(DDP)联合对HeLa229增殖、耐药性和侵袭力的影响。方法利用RNAi技术,将HeLa229分为未转染组(A组)和转染p65小干扰RNA(siRNA)组(B组),用MTT法检测转染p65 siRNA 24、48、72 h时HeLa229的增殖情况;加入不同浓度DDP,观察其对HeLa229细胞增殖的影响。用Boyden chamber体外侵袭实验检测A、B组及p65siRNA与DDP(8.6 mg/L)联合组(C组)细胞侵袭力的变化。结果B组细胞存活率较A组明显下降;加入DDP后,A、B组细胞的存活率均随DDP浓度的增加而下降。siRNA与DDP联合应用可明显提高HeLa229对DDP的敏感性。与A组相比,B、C组穿越Matrigel胶的细胞数明显减少(P<0.05)。结论应用RNAi技术可有效阻断HeLa229内NF-κB信号通路,抑制其增殖和体外侵袭力,增强其对DDP的敏感性。

aFGF和genistein对大肠癌细胞株CCL229 PKC及ERK活性的影响

目的:观察aFGF及TPK抑制剂genistein对大肠癌细胞株CCL229细胞内PKC及ERK活性的影响,探讨其信号传导途径.方法:以不同浓度的aFGF(0.15 mg/L,0.30 mg/L,0.60mg/L,1.20 mg/L)和genistein(6.00mg/L,12.00mg/L,24.00mg/L,48.00mg/L)诱导CCL229细胞,利用[γ-^(32)P]ATP掺入外源性底物的方法,液体闪烁测定PKC及ERK活性.结果:随着aFGF浓度的增加,PKC及ERK活性随之升高,与aFGF浓度呈显著正相关(P<0.05).当aFGF浓度为1.20mg/L时,PKC(胞质),PKC(胞膜)和ERK活性分别为对照组的2.60,2.79,1.77倍.genistein抑制细胞内PKC及ERK活性,且与 genistein 浓度呈剂量依赖效应(P<0.05).当genistein浓度为48.00mg/L时,PKC(胞质),PKC(胞膜)和ERK活性分别为对照组的0.41,0.36,0.50倍.genistein对aFGF诱导的PKC及ERK活性抑制更显著.结论:大肠癌细胞株CCL229中aFGF受体具有TPK活性,TPK激活后促进蛋白质和酶磷酸化,导致PKC和ERK活性升高,进一步证明PKC及ERK确是TPK的下游信号分子.

沙眼衣原体抑制etoposide诱导的HeLa229细胞凋亡的研究

目的探讨沙眼衣原体D血清型感染对宿主细胞凋亡的影响。方法用凋亡诱导剂依托泊苷(e-toposide)作用于沙眼衣原体(D血清型)感染的和未感染的Hela229细胞,Hoechst33258染色后荧光显微镜观察核浓缩和凋亡小体,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果未感染CT的Hela229细胞经etoposide作用后,用荧光显微镜观察到明显的核浓缩和凋亡小体;流式细胞仪检测的凋亡率为90.64%,与未经诱导剂作用的Hela229细胞比较差异有显著性(P<0.05)。而CT感染24h的Hela229细胞,经etoposide作用后未观察到核浓缩和凋亡小体;流式细胞仪检测的凋亡率为11.50%,与未感染CT的Hela229细胞诱导后的凋亡率比较差异有显著性(P<0.05);而与未经诱导的CT感染Hela229细胞比差异较无显著性(P>0.05)。结论沙眼衣原体感染Hela229细胞后能抑制etoposide诱导的细胞凋亡。

小白菊内酯对人宫颈癌Hela细胞株生长与迁移的影响及其相关分子机制的研究

目的探讨小白菊内酯对人宫颈癌Hela细胞株生长与迁移的影响及其相关分子机制，为小白菊内脂的进一步抗肿瘤药物研发提供实验基础。方法应用CCK-8检测细胞活性，HE染色观察细胞形态学变化，细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化；细胞免疫化学染色检测BCL-2和NF—κB基因在细胞内表达，Western—blot方法检测细胞迁移相关蛋白Twist—relatedprotein1（Twistl）表达的变化。结果小白菊内酯作用后的Hela细胞的生长受到抑制，并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的迁移能力受到明显的抑制，实验组和对照组差异显著（P〈0．05），但是24h和48h差别并不明显；BCL-2和NF—κB基因在细胞内表达明显下调，Twistl表达明显下调，和Oh比较区别显著（P〈0．05），但是24h和48h并无明显区别。结论小白菊内酯能够抑制Hela细胞株生长与迁移能力，可能和抑制BCL-2，NF—κB基因与Twistl表达有关。

千金子对宫颈癌细胞株Hela增殖作用影响及对PTEN蛋白影响研究

目的：探讨中药千金子对宫颈癌细胞株Hela增殖作用的影响及对PTEN蛋白影响研究。方法：选用宫颈癌细胞株Hela,分为A组（空白对照）、B组（千金子水溶液5 mg/m L）、C组（千金子水溶液10 mg/m L）、D组（千金子水溶液20 mg/m L）,各组分别处理Hela细胞株。采用MTT比色法检测细胞增殖抑制率,采用Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡形态,采用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期变化,采用Western Blot法检测细胞Fas、Caspase3、Caspase7、PTEN蛋白表达水平,采用RT-PCR法检测细胞PTEN m RNA表达水平。结果：（1）与A组比较,各浓度千金子水溶液在24 h、48 h、72 h对Hela细胞增殖抑制率较高,差异有统计学意义（P〈0.05）,且浓度越高、作用时间越长,对细胞增殖的抑制作用越强。（2）与A组比较,B、C、D组细胞核均有明显的凋亡形态学变化。（3）与A组比较,C、D组细胞凋亡率较高（P〈0.05）,C、D组G1期细胞比例较高（P〈0.05）,C、D组S期及G2期细胞比例较低,差异有统计学意义（P〈0.05）。（4）与A组比较,B、C、D组Caspase3、Caspase7蛋白表达水平较高（P〈0.05）,C、D组Fas蛋白表达水平较高,差异有统计学意义（P〈0.05）。（5）与A组比较,B、C、D组PTEN m RNA及PTEN蛋白表达水平较高,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：中药千金子对宫颈癌细胞株Hela增殖有明显的抑制作用,其机制为上调PTEN抗原及Fas、Caspase3、Caspase7蛋白表达,促进细胞发生G1期阻滞,引起Hela细胞凋亡。

用Hela229细胞培养法研究呼吸道肺炎衣原体感染

本文用Ｈｅｌａ２２９细胞培养与单克隆抗体免疫荧光法对９４０例咽拭子及２２４例纤支镜取材标本进行肺炎衣原体分离鉴定。结果正常组、上呼吸道感染组、下呼吸道感染组、肺部肿瘤组的咽拭子标本分离率分别为０％（０／２４８），２．１３％（１０／４６８），２．１％（３／１４６），１．２８％（１／７８）。上呼吸道感染组和下呼吸道感染组的分离率均高于正常组和肺部肿瘤组。前二组与正常组的差异有显著性意义（Ｐ＜０．０５），与肿瘤组的差异无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。下呼吸道感染组、肺部肿瘤组的纤支镜取材分离率分别为１０．９６％（１６／１４６）和５．１３％（４／７８），其差异无显著性意义。本结果说明本实验用Ｈｅｌａ２２９细胞培养法可从呼吸道感染患者及肺部肿瘤患者中分离出肺炎衣原体，并用单克隆抗体免疫荧光法加以鉴定。证明我国呼吸道感染病原中同样存在肺炎衣原体感染。

沙眼衣原体感染HeLa229细胞Bim表达及抑制凋亡研究

研究沙眼衣原体(D血清型)感染的HeLa229细胞中Bim蛋白质的表达及凋亡诱导剂作用后的凋亡情况。Western-blot检测沙眼衣原体感染和未感染的HeLa229细胞Bim蛋白质的表达水平。凋亡诱导剂etopo- side作用HeLa229细胞后,经Hoechst33258染色用荧光显微镜观察核浓缩和凋亡小体;流式细胞仪检测凋亡率。HeLa229细胞在未感染及感染沙眼衣原体6 h后可检测到Bim的表达;在感染24、48 h后均未检测到Bim的表达。经etoposide作用后,未感染的HeLa229细胞观察到明显的核浓缩和凋亡小体;流式细胞仪检测的凋亡率为90.64%。感染24 h的HeLa229细胞,未观察到核浓缩和凋亡小体;流式细胞仪检测的凋亡率为11.50%,与未感染的HeLa229细胞诱导后的凋亡率比较有统计学意义(P<0.05)。沙眼衣原体感染HeLa229细胞后可降低Bim蛋白质的表达;并能抑制etoposide诱导的细胞凋亡。

塞来昔布抑制宫颈癌细胞株Hela体外迁移效应的研究

目的观察选择性COX-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)抑制宫颈癌细胞株Hela体外迁移的效应。方法选用宫颈癌细胞株Hela作为研究对象。选择适当浓度的Celecoxib,设置对照组(C)、药物组(D)、单纯照射组(R)和药物+照射组(R+D),细胞划痕试验观察Hela细胞的体外迁移力,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶(MMP)-2的含量。结果 D组较C组,D+R组较R组的细胞迁移力均明显下降,且随药物浓度增加,抑制细胞迁移力增强,R组较C组的细胞迁移力无明显改变;ELISA检测发现细胞培养上清液中MMP-2的含量D组较C组、R+D组较R组均明显下降(P<0.05),但R组与C组对细胞分泌MMP-2的抑制效应并无明显统计学差异。结论塞来昔布可能通过抑制宫颈癌细胞株Hela分泌MMP-2,从而抑制细胞体外迁移力。

人白介素17信号途径真核融合表达质粒的构建及稳定共表达Hela细胞株的筛选

细胞因子介导的自身免疫是引起自身免疫性疾病的一种重要的机制。白介素17（IL-17）是目前新发现的细胞因子,IL-17与自身免疫病和炎症性疾病关系密切。衔接蛋白ACT1是活化核转录因子NF-κB的重要蛋白分子。

大葱在体外对Hela细胞株的抗增殖作用

大葱在体外对Ｈｅｌａ细胞株的抗增殖作用韩正高，赵萍，王丽君（天津胸科医院营养科，天津３０００５１）关键词：大葱；Ｈｅｌａ细胞株；抗增殖作用ＨａｎＺｈｅｎｇｇａｏ；ＺｈａｏＰｉｎｇ；ＷａｎｇＬｉｊｕｎＴｈｅＡｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅＥｆｆｅｃｔ...

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株

目的 :利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株。方法 :设计3个单导向RNA(singleguide RNA,sg RNA),分别靶向OSBPL2基因的第2、3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体。分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,Cruiser TM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率。选出靶向效率最高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,最后用Western blot鉴定敲除效果。结果:sg RNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达。结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功。

人宫颈癌紫杉醇耐药细胞株Hela/PTX的建立及其生物特性研究

目的:建立人宫颈癌紫杉醇耐药细胞株Hela/PTX,并考察其生物学特性。方法:以人宫颈癌Hela细胞为亲本细胞,采用低浓度持续诱导法建立紫杉醇耐药细胞株Hela/PTX。在显微镜下观察细胞形态学的变化;采用CCK-8法检测耐药细胞株对不同化疗药物的耐药性;采用高效液相色谱法测定细胞中药物的蓄积;采用Western blot法和实时荧光定量PCR技术分别检测细胞中P糖蛋白(P-gp)、Survivin蛋白和mRNA表达。结果:成功建立Hela/PTX多药耐药细胞株,其对PTX的耐药数是58.40,且对多西他赛和氟尿嘧啶有交叉耐药,耐药指数分别为8.11,4.62。Hela/PTX细胞中P-gp和Survivin的mRNA表达水平分别是Hela细胞的(9.93±0.90)倍(P<0.05)、(3.02±0.57)倍(P<0.05)。在耐药细胞中P-gp和Survivin的蛋白表达水平明显高于亲本细胞。结论:成功构建了人宫颈癌耐药细胞株Hela/PTX,具有多药耐药的基本生物学特性,可做为紫杉醇耐药机制研究的体外模型及为宫颈癌多药耐药机制的研究提供实验基础。

靶向白介素-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系的构建

目的:构建针对IL-1α基因的shRNA表达载体,筛选能够抑制Hela229细胞内源性IL-1α表达的shRNA,建立无内源性IL-1α表达的Hela229稳定细胞系。方法:根据shRNA的设计原则,以IL-1αcDNA oligo为模板设计一段21 bp核苷酸目标序列,构建成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制IL-1α基因的重组shRNA质粒,转染Hela229细胞,经G418筛选后获得单克隆稳定细胞株,用ELISA方法在蛋白水平上检测IL-1α基因的沉默效果。结果:经酶切鉴定和测序分析确定IL-1α-shRNA重组质粒构建正确,ELISA筛选出能够显著抑制内源性IL-1α表达的shRNA,获得沉默内源性IL-1α表达的单克隆稳定的Hela229细胞株。结论:靶向IL-1α基因的重组shRNA表达质粒可显著抑制Hela229细胞内源性IL-1α的表达,成功构建靶向IL-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系。

HeLa细胞系中核转录因子-κB与Bcl-2的表达

目的:分析宫颈鳞癌HeLa229细胞中核转录因子(NF-κB)的激活状态及其与抗凋亡基因Bcl-2表达的相关性。方法:采用免疫细胞化学法和Western Blot法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中NF-κB亚单位p50和p65及其下游调控基因Bcl-2的蛋白表达,RT-PCR法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中p50和p65 mRNA的表达。EMSA法检测HeLa229细胞核中NF-κB与DNA的结合活性。结果:宫颈鳞癌HeLa229细胞质中NF-κB的亚单位p50和p65均有表达,p50/p65在细胞核中具有较高的DNA结合活性。RT-PCR结果表明,p50和p65的mRNA在细胞质中也存在表达,并且在HeLa229细胞中也检测到Bcl-2蛋白的表达。结论:在宫颈鳞癌HeLa229细胞中存在有NF-κB及其下游基因Bcl-2的表达,提示激活的NF-κB信号通路可能在宫颈鳞癌发生发展及抗凋亡中起重要作用。

抑制NF-κB的表达对射线诱导HeLa细胞株凋亡的影响

背景与目的:TNF、某些化疗药物以及电离辐射可以活化NF-κB,从而抑制细胞凋亡。NF-κB的活化可以通过特异性抑制剂吡咯二硫氨基甲酸脂(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)得到抑制。本实验的目的在于探讨抑制NF-κB的表达在宫颈癌HeLa细胞对射线诱导的细胞凋亡中的影响。方法:将HeLa细胞分为实验组加入PDTC(100μmol/L)及对照组不加PDTC。两组均给予直线加速器照射,剂量分别为0、2、4、6Gy,均作用2 h。用Western blot法来观察细胞核内NF-κB含量的变化,用TUNEL法来检测细胞的凋亡,用MTT法测细胞增殖。结果:辐射可以使HeLa细胞内NF-κB的表达增多,PDTC可以抑制由射线介导的NF-κB的增加。抑制了由射线介导的NF-κB的增加,不仅使得HeLa细胞的增殖受到明显的抑制(P<0.05)也使凋亡指数大大增加(P<0.001)。结论:在宫颈癌HeLa细胞中抑制NF-κB的表达可以增加由射线介导的细胞凋亡,增加了细胞对射线的反应。

掌叶半夏有效提取物单独或与顺铂联合对体外培养宫颈癌HeLa细胞的作用

目的观察中药掌叶半夏有效提取物(PE)对体外培养宫颈癌HeLa细胞的作用,以及PE对HeLa细胞对顺铂(DDP)敏感性的影响,以期寻找药物治疗宫颈癌更完善的途径。方法体外培养宫颈癌HeLa细胞,分别用PE、DDP及DDP+PE处理细胞;用倒置相差显微镜观察细胞生长及摄影,MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡。结果PE及DDP对宫颈癌HeLa细胞的生长均表现出明显的抑制作用,低剂量PE可加强DDP对HeLa细胞的抑制作用;流式细胞术检测结果显示PE作用后HeLa细胞呈现出凋亡,且随着作用时间的延长,凋亡细胞的比例明显增加。结论PE对宫颈癌HeLa细胞有明显的抑制生长和促凋亡作用,同时能提高HeLa细胞对顺铂的敏感性。