沉默HerpUD1基因表达提高人肝L-02细胞对放射处理的敏感性

目的:利用RNA干扰技术沉默人肝L-02细胞内可诱导的同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域1(homocysteine-inducible,endoplasmic reticulum stress-inducible,ubiquitin-like domain member 1,HerpUD1)基因表达,探讨其对人肝L-02细胞的辐射增敏作用。方法:根据HerpUD1基因序列设计shRNA片段,构建靶向HerpUD1基因的shRNA表达载体,稳定转染L-02细胞,采用real-time PCR和Western blotting检测转染后细胞中HerpUD1 mRNA及蛋白的表达。以8 Gy X射线照射转染后细胞,Hoechst荧光染色观察细胞的凋亡情况。结果:成功构建靶向HerpUD1的真核表达干扰载体,并建立稳定转染shHerpUD1的L-02细胞株。在稳定转染的L-02细胞中,shHerpUD1-1420干扰片段干扰效果最好,与pGPU6-NC组(阴性对照组)相比,shHerpUD1-1420组HerpUD1 mRNA表达显著下降[(0.15±0.05)vs(1.00±0.08),P<0.05],其蛋白水平的表达也显著降低[(0.19±0.01)vs(1.62±0.08),P<0.01]。转染后细胞经8 Gy X射线照射后24 h,L-02-shHerpUD1-1420组细胞凋亡率显著高于L-02-NC组(阴性对照组)[(10.23±3.37)%vs(6.89±1.49)%,P<0.01],而L-02-NC组与L-02-Neo组相比则无显著差异(P>0.05)。结论:HerpUD1基因表达沉默显著增加X射线辐射引起的L-02细胞凋亡,具有辐射增敏作用。

Herpud1蛋白在同型半胱氨酸诱导的血管平滑肌细胞表型转化中的作用

目的探讨同型半胱氨酸诱导内质网应激诱导的泛素样结构域1蛋白(Herpud1)在同型半胱氨酸(Hcy)诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用.方法取雄性SpragueDawley大鼠胸主动脉,改良组织贴块法分离VSMC并进行培养,取第4~7代的VSMC用于实验.为明确Hcy能否诱导VSMC发生表型转化,将VSMC分为4组,即对照组以及Hcy100、500和1000μmol/L组.为明确内质网应激(ERS)是否参与VSMC表型转化,将VSMC分为3组,即对照组、Hcy500μmol/L组(Hcy组)和Hcy+4-苯基丁酸钠盐(4-PBA)2mg/ml组(Hcy+4-PBA组).为进一步验证Herpud1在VSMC表型转化中的作用,将VSMC分为对照组、Hcy组、Hcy+siRNA阴性对照(scrambled)组和Hcy+Herpud1siRNA组.免疫荧光法观察VSMC形态学变化和Herpud1蛋白改变.Westernblot法检测VSMC表型转化相关标志蛋白骨桥蛋白、钙调节蛋白(Calponin)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC),ERS相关蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶/内切核糖核酸酶肌醇需要酶1(IRE-1)、葡萄糖调节蛋白质78(GRP78)以及Herpud1蛋白的表达水平.实时荧光定量PCR法检测VSMCHerpud1mRNA的表达水平.结果(1)不同浓度Hcy对VSMC表型转化的影响:免疫荧光结果示,对照组VSMC成长梭形,肌丝明显,成束状分布,极性明显;干预24h后,Hcy100μmol/L组可见VSMC不同程度地变成椭圆形,肌丝分布紊乱,但仍具有一定极性;干预24h后,Hcy500μmol/L组VSMC肌丝不明显、极性缺失,而Hcy1000μmol/L组VSMC改变则与Hcy100μmol/L组类似.Westernblot结果显示,Hcy100μmol/L组VSMC骨桥蛋白表达水平高于对照组,SM-MHC表达水平则低于对照组(P均<0.05);Hcy500μmol/L组VSMC骨桥蛋白表达水平高于Hcy100μmol/L组,Calponin和SM-MHC表达水平则低于Hcy100μmol/L组(P均<0.05),而Hcy1000μmol/L组以上改变趋势不如500μmol/L明显.(2)ERS在VSMC表型转化中的作用:干预24h后,Hcy100、500和1000μmol/L组VSMCCHOP、IRE-1和GRP78蛋白表达水平均高于对照组(P均<0.05).Hcy+4-PBA组VSMCCHOP、IRE-1和GRP78蛋白表达水平低于Hcy组(P均<0.05).而且,Hcy+4-PBA组VSMC骨桥蛋白表达水平亦低于Hcy组(P<0.05),Calponin和SM-MHC蛋白的表达水平则高于Hcy组(P均<0.05).(3)Herpud1在Hcy诱导的VSMC表型转化中的表达:干预24h后,Hcy100、500和1000μmol/L组VSMCHerpud1蛋白表达水平均高于对照组(P均<0.05),且具有浓度依赖性.干预12h后,Hcy(500μmol/L)组VSMCHerpud1升高最为明显,干预48h后开始下降.Hcy组VSMCHerpud1mRNA表达水平在0.5、1、2、6、12、24h均高于对照组(P均<0.05),且具有一定的时间依赖性,以12h最为明显;Hcy+4-PBA组VSMCHerpud1mRNA表达水平在上述各时点均低于Hcy组.免疫荧光染色显示,对照组、Hcy组和Hcy+4-PBA组Herpud1均主要分布在细胞浆中的内质网,细胞核也有少量分布.Hcy组VSMCHerpud1蛋白表达水平高于对照组(P<0.05),Hcy+4-PBA组则低于Hcy组(P<0.01).(4)抑制Herpud1对Hcy诱导的VSMC表型转化的影响:Hcy+Herpud1siRNA组VSMC骨桥蛋白表达水平低于Hcy+siRNA阴性对照组(P<0.05),Calponin和SM-MHC蛋白表达水平则均高于Hcy+siRNA阴性对照组(P均<0.05).结论Herpud1在Hcy诱导的VSMC表型转化具有重要作用.

牛磺熊去氧胆酸通过调节内质网应激抑制转化生长因子β1所诱导的心肌成纤维细胞纤维化

目的探讨牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)对转化生长因子β1(TGF-β1)所诱导的心肌成纤维细胞(CFs)活化的作用及相关机制,为TUDCA治疗糖尿病心肌纤维化提供新的治疗目标。方法提取原代SD乳鼠CFs和心肌细胞,通过免疫荧光法鉴定CFs的纯度。分别将高糖培养下的CFs用不同时间的TGF-β1干预,用Western blot检测内质网应激(ERS)通路相关蛋白和纤维化指标的表达,探讨TGF-β1对CFs活化及ERS相关通路的影响。用Western blot检测CFs和心肌细胞内同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域1(Herpud1)的表达情况。通过沉默Herpud1的表达及用Transwell和Western blot检测沉默Herpud1后CFs纤维化指标的表达,探讨Herpud1在TGF-β1诱导的CFs活化中的作用。用CCK-8检测不同浓度的TUDCA处理下CFs的活力。用免疫荧光和Western blot检测TUDCA对TGF-β1诱导的CFs中Herpud1、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录激活因子6(ATF6)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)表达的影响。为进一步明确Herpud1在TUDCA抑制CFs活化中的作用,用Western blot检测过表达Herpud1后相关蛋白的表达情况。结果在成功构建CFs纤维化模型的基础上,TGF-β1能够诱导CFs活化及ERS通路相关蛋白的表达;Herpud1在CFs中的表达高于心肌细胞;敲除Herpud1可抑制TGF-β1所诱导的CFs活化;TUDCA能显著降低TGF-β1诱导的CFs中GRP78、ATF6、α-SMA、Vimentin和CollagenⅠ的表达水平;此外,过表达Herpud1还可逆转TUDCA对TGF-β1诱导的CFs活化的抑制。结论下调Herpud1基因的表达是TUDCA抑制TGF-β1诱导的CFs纤维化的机制之一。

Herpud1在盆底肌萎缩模型中的表达研究

目的探讨内质网膜蛋白Herpud1在盆底肌萎缩模型中的表达与作用。方法分别各取10只4月龄未生产过的野生型C57BL/6J小鼠(WT组)和盆底肌萎缩模型基因小鼠(T型钙离子通道编码基因CACNA1H敲除小鼠:Cacna1h-/-mice/TH-null组),异氟烷麻醉小鼠后,电生理记录仪对小鼠进行尿动力学指标的检测;处死小鼠后取盆底肌行免疫组化染色和Western-blot实验,分析Herpud1蛋白和mRNA水平的表达变化。选择鼠源C2C12成肌细胞分化4d形成肌管后,予以T型钙离子通道抑制剂NNC55-0396水合物(NNC)处理24h和48h,构建肌管萎缩细胞模型,Western-blot法检测Herpud1蛋白表达。结果小鼠尿动力学检测结果显示,与WT组小鼠相比,TH-null组小鼠膀胱漏尿点压(bladder leak point pressures,BLPP)值[(46.54±1.102)cmH_(2)O vs(31.55±2.177)cmH_(2)O]、最大膀胱容量值(0.1145±0.003023 vs 0.0691±0.004423)均显著降低,差异有统计学意义(P<0.0001);免疫组化染色、Western-blot检测结果均显示TH-null组小鼠盆底肌中Herpud1表达下降。C2C12分化肌管萎缩模型显示NNC处理以时间依赖的方式降低了Herpud1蛋白的表达水平。结论①Cacna1h-/-基因小鼠盆底肌萎缩模型中存在尿动力学指标的异常,说明盆底肌萎缩与压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)等盆底功能障碍病症发生相关;②Cacna1h-/-基因小鼠盆底肌萎缩模型和肌管细胞萎缩模型中Herpud1表达水平均下降,Herpud1在盆底肌萎缩过程中可能具有重要调节作用。

Herpud1对后肾间充质细胞的作用及其机制的探讨

为初步探讨Herpud1在肾脏发育中的生物学作用,过表达Herpud1载体及敲低Herpud1载体被构建。载体被转染进后肾间充质细胞,通过RT-PCR和蛋白质免疫印迹检测了上皮间质的转换过程（EMT）的标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail蛋白及内质网应力的标志蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、真核起始因子2α（e IF2α）的表达变化,通过EDU细胞增殖实验检测了Herpud1对细胞增殖的作用,同时利用细胞划痕实验验证了细胞的迁移能力。结果显示,与空白对照组相比,在Herpud1过表达的实验组中,E-cadherin的表达在mRNA和蛋白质水平均是降低的,而Snail和Vimentin的表达则是上升的,并伴随着细胞增殖活性的降低和细胞迁移能力增加,同时内质网应力相关蛋白GRP78和e IF2α是升高的。在Herpud1敲低的实验组,E-cadherin的表达在mRNA和蛋白质水平均是升高的,而Snail和Vimentin的表达下降,细胞迁移能力是降低并且细胞增殖活性升高,同时内质网应力相关蛋白GRP78和e IF2α也是降低的。这些结果证明Herpud1可以促进MK3细胞EMT过程,提高细胞的迁移能力,抑制细胞的增殖活性,其机制可能与细胞的内质网应力相关。