雏鸡在感染IBDV后红细胞免疫功能变化的研究

在经ＩＢＤ弱毒苗免疫和未免疫的３０～５９日龄ＡＡ鸡研究了感染ＩＢＤＶ后红细胞免疫功能的变化。结果表明：从以ＩＢＤＶ攻毒前１天到攻毒后头５天内，未免疫攻毒鸡（Ａ组）和免疫攻毒鸡（Ｂ组）ＲＢＣ－ＣＲ１花环率降低或显著降低，而未免疫未攻毒鸡（Ｃ组）没有类似变化，高于Ｂ组，明显高于Ａ组，以后Ａ和Ｂ组逐渐回升到攻毒前水平。Ａ和Ｂ组ＲＢＣ－ＩＣ花环率在ＩＢＤＶ攻毒后第５天明显降低，均显著低于Ｃ组水平，以后Ａ组仍处于较低水平上变动，Ｂ组即逐渐回升，三组比较，Ａ组仍低于Ｃ组，同时也低于Ｂ组。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的

IBDV强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞的凋亡及调控机制

为探究IBDV强毒BC6 / 85株感染SPF鸡后 1～ 9d内法氏囊淋巴细胞中Bcl 2和Bax蛋白的动态表达与淋巴细胞凋亡的关系 ,通过透射电镜观察及TUNEL法检测凋亡的淋巴细胞 ,用免疫组织化学方法检测Bcl 2和Bax蛋白。研究结果表明 :感染后 3～ 5d可见到大量凋亡的淋巴细胞 ,Bcl 2和Bax蛋白表达量显著高于同时点的对照组 (P <0 0 1) ;Bcl 2 /Bax(Bcl 2与Bax比率 )显著低于同时点的对照组 (P <0 0 1)。BC6 / 85株感染SPF雏鸡3～ 5d后法氏囊淋巴细胞会发生大量凋亡 ,Bcl 2 /Bax能准确反映淋巴细胞的凋亡程度。

硫酸化黄芪多糖对CEF生长及抵抗IBDV感染的影响

采取一步醇沉和分步醇沉法提取4种黄芪多糖APSt、APS40、APS50和APS60,用氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰,得到4种硫酸化黄芪多糖(sAPS)sAPSt、sAPS40、sAPS50和sAPS60,用MTT法比较了4种硫酸化黄芪多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的生长及抵抗鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)感染的影响,以未修饰的APSt为对照。结果显示,APSt显著促进CEF生长,细胞毒性较低,但抵抗鸡传染性法氏囊病毒感染细胞的作用较弱;sAPS抵抗鸡传染性法氏囊病毒感染的作用显著增强,显效浓度降低,但安全浓度也降低。表明通过硫酸化修饰可以提高黄芪多糖的抗病毒活性,但高浓度sAPS的细胞毒性增强。

雏鸡混合感染IBDV与CAV的研究

实验分为 4组 :空白对照组、CAV感染组、IBDV感染组、IBDV_CAV混合感染组。选择IBDV发病严重期 (6日龄 )与CAV发病严重期 (13日龄 )测定并计算各组鸡的法氏囊、胸腺和体重的比值 ;分离外周血、法氏囊和胸腺中的淋巴细胞 ,加入适量的刀豆蛋白 (ConA)和商陆凝集素 (PAM)作为有丝分裂刺激原 ,利用MTT法检测实验鸡免疫细胞的功能变化 ;统计死亡率 ,绘制死亡曲线。研究发现 ,IBDV与CAV的混合感染较单独感染严重降低了感染鸡免疫活性细胞的增殖功能 ,并同时增强了IBDV或CAV的致病力 ,出现两次死亡高峰 ,病死率达 10 0 %。

雏鸡在感染IBDV后血浆cAMP、cGMP和IL-2水平变化

在经ＩＢＤ弱毒苗免疫和未免疫的３０～５９日龄ＡＡ鸡研究了感染ＩＢＤＶ后血浆ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ和ＩＬ２水平动态变化。结果表明：未免疫攻毒鸡（Ａ组）、免疫攻毒鸡（Ｂ组）和未免疫未攻毒鸡（Ｃ组）在ＩＢＤＶ攻毒前１天血浆ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ水平Ｂ组明显高于Ａ和Ｃ组，ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值同样是Ｂ组高于或明显高于Ａ和Ｃ组，ＩＬ２水平三组之间无明显差异。在攻毒后的头５天内，Ｂ和Ｃ组ｃＡＭＰ明显升高，而Ａ组没有类似的变化，第５天明显低于Ｂ和Ｃ组，以后Ｂ和Ｃ组仍高于或显著高于攻毒前和同期Ａ组水平。在攻毒后Ａ和Ｂ组ｃＧＭＰ均呈波动性上升趋势，第７天明显高于攻毒前水平并高于Ｃ组，以后Ａ、Ｂ、Ｃ三组均下降，但Ａ组比Ｂ和Ｃ组下降更快。在攻毒后２８天内，Ａ组ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值无明显变化，Ｂ组波动上升，Ｃ组处于高水平上，Ｂ和Ｃ组均高于或明显高于Ａ组。血浆ＩＬ２水平Ａ和Ｂ组在ＩＢＤＶ攻毒后的头７天内呈逐渐下降趋势，但Ａ组下降的更剧烈，Ｃ组无明显差异性变化，三组相比，Ｂ和Ｃ组均高于或明显高于Ａ组，以后Ａ和Ｂ组逐渐回升。

IBDV逆转录-聚合酶链反应和核酸杂交检测方法的研究

以建立的传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和核酸杂交检测方法，检测了细胞培养物、病理组织、粪便和饲料中的ＩＢＤＶ，并与ＩＢＤＶ夹心ＥＬＩＳＡ、琼脂扩散试验（ＩＤ）和病毒分离方法进行了平行比较试验。结果表明，ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交检测方法具有高度的敏感性和特异性，是深入研究ＩＢＤ流行病学。

感染IBDV雏鸡血液激素水平和ANAE阳性淋巴细胞动态变化

为探讨内分泌活动及细胞免疫反应在鸡抗传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）感染中的调节作用机制而进行了本研究。结果表明，攻毒后１～５ｄ内，未免疫攻毒鸡（Ａ组）、免疫攻毒鸡（Ｂ组）血浆皮质酮均明显上升，而未免疫未攻毒鸡（Ｃ组）则否。Ａ、Ｂ、Ｃ３组血浆Ｔ４水平攻毒前后无明显变化，Ｔ３除在攻毒后第３天Ａ组明显高于Ｂ、Ｃ组外，其他时间无明显差异性变化。血液ＡＮＡＥ阳性淋巴细胞（％）在攻毒后的１～５ｄ内，Ａ组和Ｂ组明显下降，以后回升，至２８ｄ回复到攻毒前水平，并接近于Ｃ组。Ａ组的ＡＮＡＥ阳性淋巴细胞（％）与皮质酮呈显著负相关，与Ｔ３和Ｔ４无明显相关性。

高亲和力抗IBDV单克隆抗体的产生与免疫学鉴定

目的：生产高亲和力的抗IBDV不同抗原决定簇的单克隆抗体，为IBD的快速检测准备试剂。方法：用IBDV抗原诱导Balb/c小鼠产生最强最适当的反应，将免疫脾细胞与NSO瘤细胞融合，通过对大量的杂交细胞培养上清进行检测和鉴定，筛选出分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果：获得分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤21株，其中4株YNZ-1、YNZ－12、YNZ-8和YNZ-26的间接ELISA效价分别为：1：2560、1：1280、1：2560、1：640；腹水间接ELLSA效价分别为：1×10－6、5×10－5、1×10－6和1×10-5。结论：单抗YNZ－1和YNZ-18、YNZ－12和YNZ－26亲和力高，识别IBDV不同的抗原决定簇，可作为制备快速诊断IBD的特异单克隆抗体。

中药提取物对IBDV感染SPF鸡的防治效果

为了确定中药提取物对IBDV感染的防治效果,将150羽SPF雏鸡随机分为对照组、模型组和中药提取物高、中、低剂量组,中药提取物高、中、低剂量组分别在饮水中添加10.0、5.0、2.5 g/L的中药提取物,连续添加7 d,对照组和模型组不添加任何药物。给药后,除对照组外,其余组雏鸡分别通过滴鼻接种IBDV,攻毒后连续观察2周。统计雏鸡的成活率,荧光定量PCR检测IBDV在组织中的载量,分析病毒在脏器中的分布。结果显示:中药提取物能提高雏鸡成活率,高、中、低剂量组雏鸡成活率分别为86.67%、93.33%和70.00%,高剂量组雏鸡脾脏和法氏囊指数显著降低,中剂量组的胸腺和法氏囊指数显著降低。高、中剂量组脾脏、胸腺、法氏囊病毒载量极显著低于模型组,脾脏、胸腺病毒载量极显著低于低剂量组,法氏囊病毒载量显著低于低剂量组。表明中药提取物能提高雏鸡的成活率,促进IBDV核酸转阴,改善脾脏、胸腺、法氏囊等免疫器官状况,降低病毒在脾脏、法氏囊、胸腺的载量,且中剂量组效果优于其他剂量组。

中药复方提取物对IBDV感染SPF鸡抗氧化和抗炎能力的影响

将150羽SPF雏鸡随机分为5组,即对照组(CK)、病毒感染模型组(MC)、中药提取物高、中、低剂量组(T1、T2、T3),T1、T2、T3组试验鸡分别按照10.0、5.0、2.5g/L的剂量在饮水中添加中药提取物(由2∶2∶1∶1质量比的女贞子、黄芪、枸杞子、菟丝子组成),连续添加7d,CK和MC不添加任何药物,给药完成后,对照组滴鼻生理盐水,其他各组雏鸡分别通过滴鼻接种IBDV,攻毒后连续观察7 d,检测抗氧化指标(T-SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA)和炎性因子(NO、TNF-ɑ、IL-1β、IL-6)的分泌量,检测脾淋巴细胞i NOS、NF-κB、MCP-1基因m RNA表达量。结果显示:T1和T2试验鸡抗氧化能力均提高,血清中GSH-Px活力和T-AOC极显著高于MC的(P<0.01),MDA含量显著低于MC的(P<0.05),T2试验鸡血清中T-SOD活力显著高于MC的(P<0.05);T1和T2试验鸡炎症反应明显减少,血清中NO、TNF-ɑ、IL-1β含量均极显著低于MC的(P<0.01),NO和TNF-ɑ含量显著低于T3的(P<0.05),IL-1β含量显著或极显著低于T3的,IL-6含量显著高于T3和MC的(P<0.05);T1和T2试验鸡脾淋巴细胞中i NOS m RNA表达量显著低于MC的(P<0.05),NF-κB和MCP-1 m RNA表达量极显著低于MC的(P<0.01)。表明中药提取物可能通过增强雏鸡的抗氧化能力,促进炎性相关因子的分泌和调节基因表达实现抗炎效果来抵抗IBDV。

复方中药对蛋雏鸡感染IBDV后免疫器官的形态学影响

２００只３０日龄健康海兰蛋雏鸡随机分为四组，每组５０只。Ａ组饲料中添加复方中药，接种ＩＢＤＶ；Ｂ组饲料中添加中药，接种ＩＢＤＶ；Ｃ组不添加中药，接种ＩＢＤＶ；Ｄ组不作任何处理为对照组。在接种后７ｄ剖检、取材作石蜡切片，观察鸡免疫器官的形态学变化。结果表明，传染性ＩＢＤ野毒可使鸡免疫器官发育不良，主要导致法氏囊的淋巴细胞变性坏死，抑制免疫活性细胞的生成，导致免疫抑制；中药促进免疫器官发育及免疫活性细胞生成，提高免疫活性，调节免疫抑制，使免疫器官的组织结构保持或恢复正常水平；复方中药抗ＩＢＤＶ感染的效果优于中药。

超强毒IBDV细胞克隆化毒回归鸡后的致病性与VP_2基因高变区的分子变化

为了研究超强毒鸡传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的致病性及其VP2基因高变区的分子变化,以vvIBDVGX8/99株囊毒为研究对象,将该毒在SPF鸡胚连传10代后,再在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续盲传。该病毒在CEF上传至22代时开始引发CEF细胞病变,随之在96孔细胞培养板上用无限稀释法连续克隆2次后获得了4个病毒克隆,再将该4个病毒克隆分别连续回传3～5周龄SPF鸡10代。分别比较4个克隆毒及其回传SPF鸡后不同传代毒,对4～6周龄SPF鸡的致病性及VP2高变区氨基酸分子的变化,结果表明,4个克隆化毒的细胞培养毒对SPF鸡只有0～6 7%的致死率,不同克隆毒的SPF鸡传代毒对SPF鸡的致病性却都逐渐增强,但程度差异很大,其中克隆#5在回鸡1、5和10代后的致死率从0分别增加到10%、20%和27%;克隆#4从6 7%增加至13%、17%和23%;但克隆#1和#3的致病性变化相对较小。相对于原始囊毒及鸡胚毒,4个克隆化毒在测序的VP2高变区的约145个氨基酸中,有10个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致,在回鸡传代导致对鸡毒力增强的过程中,这10个位点中大多数氨基酸不再变化,只有第253位和256位氨基酸从囊毒的Q和I变为细胞适应毒的H和V后,有些病毒克隆回鸡至第10代时又变为原囊毒的Q和I。

IBDV强、弱毒VP2诱饵载体构建及在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

采用Gateway技术将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)Gx株和Gt株vp2基因分别克隆到载体pDEST-32构建诱饵载体,通过酶切和PCR鉴定并测序正确后,用醋酸锂法转化酵母菌株MaV203,通过缺陷型平板筛选和X-gal颜色筛选检测诱饵载体有无自激活作用。结果表明,成功构建了诱饵载体pDEST-32-Gxvp2和pDEST-32-Gtvp2,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用。为下一步利用酵母双杂交方法从鸡法氏囊B淋巴细胞和鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库中筛选与强、弱毒VP2诱饵载体作用的分子奠定了基础。

可阻断IBDV感染的抗CEF膜蛋白单克隆抗体的筛选

【目的】利用细胞融合技术及细胞免疫组化方法,筛选可特异性阻断鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的抗鸡胚成纤维细胞(CEF)膜蛋白单克隆抗体,为进一步研究IBDV的CEF受体奠定基础。【方法】用CEF细胞免疫Balb/c小鼠,经细胞融合获得杂交瘤细胞上清。单层CEF用杂交瘤细胞上清孵育2h后接种IBDV,病毒感染后固定细胞,先后与F22-EA6-Biotin及Streptavidin-HRP进行反应,最后用AEC染色,显微镜下计数,统计感染细胞减少的百分率以判定单抗上清阻断IBDV感染的效果。【结果】利用细胞组化的方法,共计检测了768株杂交瘤细胞上清,6株(1A5、1H11、2B12、3G1、4D10和4B8)显示有阻断IBDV感染的效果,其中4B8可完全阻断IBDV对CEF的感染,该单抗针对的CEF膜蛋白很有可能是IBDV的细胞受体。【结论】筛选到的抗CEF膜蛋白的单抗可以阻断IBDV感染CEF,表明所建立的方法具有较高的敏感性和特异性。这些单抗可以用于进一步研究IBDV的CEF细胞受体。

IBDV强毒株与弱毒株对SPF鸡侵染过程的研究

用DIG标记PS19探针和异硫氰酸荧光素标记的鸡抗IBDVIgG,对人工接种IBDV强毒株Hrb和弱毒细胞适应株Ts后不同时间段的法氏囊、盲肠扁桃体、脾、肾、肝、胸腺、大腿及胸部肌肉的石蜡切片分别进行原位杂交和荧光抗体检测。同时将各时间段每种组织的石蜡切片进行HE染色以观察组织破坏情况。结果发现,用原位杂交和荧光抗体两种方法首先分别于接种Hrb后8h和16h在法氏囊中检测到IBDV的阳性信号,然后依次是盲肠扁桃体、脾、肾、肝、胸腺。侵害程度以法氏囊最重。实验结果表明:Hrb毒株在组织中复制速度快,并迅速在SPF鸡体内传播。Ts毒株侵染较轻,对器官组织无损伤。

CAV基因工程亚单位苗与IBDV二联灭活疫苗的研究

IBDV为自行分离的 VVIBDV COB-C1组织毒 ,毒价为 CEL D50 1 0 5.6 / 0 .2 m L ,CAV为 VP1和 VP2基因克隆进家蚕杆状病毒转基因载体质粒中 ,后经重组 ,筛选后获得的重组VP1和 VP2基因产物。IBDV经甲醛灭活后与CAV按适当比例混合。 1∶ 4与白油佐剂研制成油包水型乳化剂二联疫苗 ,经安全试验、免疫保护试验证明该二联灭活疫苗安全有效 ,免疫种鸡群后可使其后代产生 IBDV和 CAV抗体 。

IBDV野毒株主要结构蛋白基因RT─PCR方法的建立

借助计算机软件，在分析比较了９个传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片段结构蛋白基因的基础上，设计并合成了２对ＶＰ２和ＶＰ３基因ＰＣＲ引物，经ＲＴ－ＰＣＲ反应条件优化选择，成功地建立了ＲＴ－ＰＣＲ方法，用于扩增ＩＢＤＶＶＰ２和ＶＰ３基因，经琼脂糖凝胶电泳和分子杂交鉴定，获得４个ＩＢＤＶ野毒株ＶＰ２和ＶＰ３基因。

感染IBDV雏鸡血液ANAE^+—淋巴细胞比例和IL-2水平的动态变化研究

研究了经ＩＢＤ弱毒苗免疫和未免疫的３０～５９日龄ＡＡ鸡在感染传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）后血液ＡＮＡＥ＋－淋巴细胞比例和白细胞介素－２（ＩＬ－２）水平动态变化。结果表明，血液ＡＮＡＥ＋－淋巴细胞（％）在攻毒后的头５ｄ内未免疫攻毒鸡（Ａ组）和免疫攻毒鸡（Ｂ组）明显下降，且Ａ组比Ｂ组下降的更快，第５天Ａ组明显低于未免疫未攻毒鸡（Ｃ组），Ｂ组也较Ｃ组低，Ｃ组没有明显的变化，以后Ａ和Ｂ组均回升，但Ｂ组比Ａ组回升的快，至２８ｄ时Ａ和Ｂ组均达到或接近攻毒前水平，并接近或高于Ｃ组。血浆ＩＬ－２水平Ａ和Ｂ组在ＩＢＤＶ攻毒后的头７ｄ内呈逐渐下降趋势，但Ａ组下降的更剧烈，Ｃ组无明显差异性变化，三组相比，Ｂ和Ｃ组均高于或明显高于Ａ组，以后Ａ和Ｂ组逐渐回升。

复方中草药“毒菌杀”对感染IBDV雏鸡白细胞数量及淋巴细胞ANAE^+百分率的影响

试验观察了复方中草药“毒菌杀”对感染法氏囊病毒(IBDV)雏鸡的外周血液白细胞及α-醋酸萘酯酶(α-acid naphthyl acetate esterase,ANAE)阳性淋巴细胞百分率的影响。结果发现,“毒菌杀”可以使感染IBD V的雏鸡维持外周血白细胞数量的相对稳定,提高ANAE阳性淋巴细胞的活性水平,具有明显的免疫保护作用。