抗ICAM-1单克隆抗体的制备及其活性

目的制备具有生物活性的抗人细胞间黏附分子-1（ICAM-1）单克隆抗体。方法以人ICAM-1为抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术并经HAT选择培养和克隆化，筛选出稳定分泌抗人ICAM-1 McAb的杂交瘤细胞株，并对McAb进行纯化。用ELISA间接法测定效价并鉴定其亚类，Westerm blot鉴定其抗原特异性，细胞黏附试验检测其中和活性。结果筛选出1株可稳定分泌抗人ICAM-1抗体的杂交瘤细胞株3F2，杂交瘤染色体众数为98～104。纯化后的单抗蛋白浓度为1．253mg／ml，纯度达83．6％，效价可达2．56×10^5。其分泌的抗体亚型为IgG1，腹水效价达5．12×10^5，可与ICAM-1特异性结合，可抑制ICAM-1与淋巴瘤细胞间的黏附，具有明显的中和ICAM-1的活性。结论已成功制备出抗ICAM-1的McAb，为其进一步的研究和应用奠定了基础。

抗ICAM-1单克隆抗体的生物学功能研究

本研究通过体外细胞试验和体内动物试验,对已制备的抗细胞间粘附分子1(ICAM-1)单克隆抗体(MAb)4F1和2C5的生物学活性进行检测。间接免疫荧光试验表明:这两株ICAM-1 MAb可以与人血管内皮细胞ECV304细胞中的ICAM-1结合。以乳酸脱氢酶释放法检测ICAM-1 MAb抑制单核细胞与血管内皮细胞的黏附作用。4F1和2C5 MAb分别可以使细胞黏附降低34.4%和26.9%。二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验和毛细血管通透性试验表明:ICAM-1 MAb能够抑制小鼠耳廓肿胀度,使伊文思蓝渗出量降低。本研究证明所制备的MAb均具有阻断ICAM-1及抑制炎症反应的功能,其中4F1生物学活性高于2C5。

抗ICAM-1单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备有生物学活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:以纯品ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠4次。采用杂交瘤技术,经3次亚克隆筛选稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株。采用动物体内诱生的方法大量制备mAb。以protein G对其进行纯化后,用间接ELISA法测定mAb的效价并鉴定其Ig亚类。用Western blot鉴定mAb的特异性。结果:筛选出4株可稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为B9株、F1株、C11株和D6株。4株mAb的Ig亚类均为IgG1。4株mAb培养上清的效价均为1∶1 000;腹水的效价B9株与D6株为1∶2×105,F1株与C11株为1∶4×105。纯化后mAb的蛋白浓度为1.2 g/L,均可与ICAM-1特异性结合。结论:成功制备出效价高、特异性良好的4株抗ICAM-1 mAb,为进一步研究ICAM-1的生物学功能和临床应用奠定了基础。

抗ICAM-1单克隆抗体在治疗方面的研究进展

细胞间黏附分子-1（ICAM-1；CD54）属于免疫球蛋白超家族成员，是一种跨膜的单链糖蛋白，相对分子质量（Mr）为80000～110000，在细胞膜上分为细胞外段，疏水的跨膜段和短的细胞内区段。

ICAM-1单克隆抗体对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤作用的研究

目的探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的保护作用。方法48只7 d龄SD大鼠随机分为缺血缺氧组(A组)、ICAM-1单抗治疗组(B组)、生理盐水组(C组)和正常对照组(D组)。其中A组观察到再给氧后2 h,24 h,48 h,72 h和168 h处死,B,C,D组观察到再给氧后48 h处死。应用免疫组织化学法和HE染色观察1CAM-1在不同时间脑组织的表达和脑组织中性粒细胞浸润情况。结果A组再给氧2 h,脑微血管内皮细胞ICAM-1微弱表达,24 h后表达开始增加,48 h达到高峰,同时受损脑组织中性粒细胞浸润也随之增加。B组再给氧48 h后,ICAM-1表达强度及中性粒细胞浸润比同时间点缺氧缺血组明显降低。结论HIBD时ICAM-1的表达与中性粒细胞浸润密切相关,ICAM-1单抗对新生大鼠HIBD具有一定保护作用。

犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。

弓形虫GRA1蛋白单克隆抗体的制备与间接免疫荧光检测方法的建立

本研究旨在利用原核表达系统表达弓形虫GRA1蛋白并制备单克隆抗体,用于弓形虫病的诊断及GRA1蛋白功能研究。以弓形虫cDNA为模板,设计引物扩增GRA1基因片段,构建原核表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达蛋白并纯化。用纯化后的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体并鉴定。以制备的弓形虫GRA1单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,优化反应条件建立弓形虫间接免疫荧光检测方法。结果表明:成功构建了原核表达质粒pET-30a(+)-TG-GRA1;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白GRA1为可溶性表达,分子量约为27 kDa;Western blot结果显示重组蛋白GRA1可被犬弓形虫阳性血清识别,表明GRA1有良好的反应原性。成功筛选出5株单克隆细胞株,分别命名为1-B10、2-C3、2-C9、3-C11以及6-E6,并对它们进行亚型鉴定,其中2-C3、2-C9、3-C11为IgG1,1-B10、6-E6为IgM;IFA结果显示单克隆抗体具有良好的反应原性;建立了mAb 2-C9最佳稀释浓度为0.875μg/mL、最佳孵育时间为1.5 h,FITC标记的羊抗鼠IgG最佳稀释倍数为1∶400、最佳孵育时间为1.5 h的间接免疫荧光检测方法,并对15只小鼠的肝脏组织切片进行检测,结果表明该方法可用于弓形虫动物组织切片的检测,有助于弓形虫感染的实验室诊断及弓形虫的动态分布研究。

西妥昔单克隆抗体联合XELOX化疗治疗老年晚期直肠癌的近远期效果及其对ICAM-1、Cox-2和CK-20水平的影响

目的探讨西妥昔单克隆抗体联合XELOX化疗治疗老年晚期直肠癌的近远期效果及其对血清细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、环氧酶-2（Cox-2）和细胞角蛋白-20（CK-20）表达的影响。方法选取2009年6月～2013年11月右江民族医学院附属医院肛肠外科收治的88例老年晚期直肠癌患者．根据治疗方案的不同分为XELOX化疗组（单独组）和XELOX化疗＋西妥昔单克隆抗体组（联合组），每组各44例；分别比较两组患者的近远期临床疗效、ICAM-1、Cox-2和CK-20的变化。结果联合组的治疗有效率为70．45％，显著高于单独组的40．91％（P〈0．05），但两组患者疾病控制率和不良反应发生率比较差异无统计学意义（P〉0．05）；联合组1年生存率与单独组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；联合组2年生存率明显高于单独组（P〈0．05）；而且，联合组患者的局部复发与转移率也明显低于单独组（P〈0．05）；单独组患者的平均生存时间为16．263个月，显著短于联合组的20．658个月（P〈0．05）；治疗后两组患者ICAM-1、Cox-2和CK-20表达水平均显著降低（P〈0．05）；而且，联合组患者的改善程度明显优于单独组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论西妥昔单克隆抗体联合XELOX化疗可显著提高老年晚期直肠癌的近远期临床疗效，抑制肿瘤相关基因ICAM-1、Cox-2和CK-20的水平。

DCLK1单克隆抗体在结直肠癌中的表达以及影响因素分析

目的研究和分析Doublecortin样激酶-1(Doublecortin Like Disease 1,DCLK1)单克隆抗体在结肠癌中的表达情况与相关影响因素。方法选取2018年7月—2022年6月哈尔滨工业大学附属黑龙江省医院收治的73例结直肠癌患者作为研究对象,根据患者肿瘤组织中DCLK1表达水平,将其分为DCLK1低表达组(n=31)与DCLK1高表达组(n=42),分析DCLK1单克隆抗体在结直肠癌中表达的影响因素。结果DCLK1高表达组与DCLK1低表达组肿瘤直径、肿瘤分期(Tumor Node Metastasis,TNM)、浸润深度、淋巴结是否转移、有无脉管、肿瘤病灶是否远处转移及肿瘤分化程度对比,差异有统计学意义(P均<0.05)。多因素Logistic回归分析研究结果表明,肿瘤组织中DCLK1高表达水平影响因素包括淋巴结转移、浸润深度、TNM分期、肿瘤直径、肿瘤病灶远处转移、肿瘤分化程度(OR=1.079、1.235、1.548、1.784、1.745、2.026,P均<0.05)。结论肿瘤组织中DCLK1高表达水平影响因素包括淋巴结转移、浸润深度、TNM分期、肿瘤直径、肿瘤病灶远处转移、肿瘤分化程度,临床可通过检测上述指标的方式判断肿瘤组织中DCLK1表达水平。

抗TL1A单克隆抗体通过影响巨噬细胞极化减轻结节病肉芽肿形成的机制研究

目的 探讨抗TL1A单克隆抗体是否可通过影响结节病中巨噬细胞的极化水平,减轻结节病肉芽肿的形成。方法 采用随机分组法将32只C57BL/6小鼠分成空白对照组、结节病组、结节病+TL1A Ab治疗组和结节病+地塞米松治疗组(n=8)。通过肺组织病理学染色(HE染色)观察各组小鼠肺部肉芽肿的形成;通过流式细胞术检测各组小鼠脾脏单个核细胞(PBMC)中M1/M2型巨噬细胞的水平。提取各组小鼠股骨和胫骨内的原代骨髓源性巨噬细胞(BMDM),培养并分别诱导各组BMDM向M1或M2型巨噬细胞方向分化,使用流式细胞术与qPCR分别测定各组小鼠BMDM中M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的细胞数目和相关因子的mRNA表达情况。结果 与结节病组相比,结节病+TL1A Ab组小鼠肺组织中肉芽肿的数目明显减少(P<0.001)。相较于空白对照组,结节病组PBMC中M1型巨噬细胞水平增高(P<0.001),给予TL1A Ab后可逆转这一现象(P<0.001);结节病+TL1A Ab组PBMC中M2型巨噬细胞的水平高于结节病组(P<0.001)。各组小鼠BMDM经诱导分化后,结节病+TL1A Ab组M1型巨噬细胞极化水平较结节病组下降(P<0.001);而TL1A Ab组M2型巨噬细胞极化水平高于结节病组(P<0.001)。结论 抗TL1A单克隆抗体通过调控结节病中巨噬细胞的极化水平而抑制结节病中的肉芽肿性炎。

抗人Ⅰ型干扰素受体亚基1人源化单克隆抗体的制备和鉴定

Ⅰ型干扰素在系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用,采用抗体阻断其信号转导通路具有潜在的治疗作用。本研究以人Ⅰ型干扰素受体亚基1(IFNAR1)重组蛋白为抗原免疫新西兰白兔,采用B细胞克隆技术筛选兔抗人IFNAR1单克隆抗体,经过人源化改造获得QX006N。体外研究结果显示,QX006N能特异性地结合人IFNAR1,亲和力约108 pmol/L,可阻断Ⅰ型干扰素信号通路及其介导的生物学效应。本研究为开发靶向干预Ⅰ型干扰素信号途径用于治疗SLE的抗体药物提供了坚实的基础。

抗ICAM-1单克隆抗体在大鼠肝移植急性排斥反应中的应用及肝细胞凋亡

目的比较1A29、环孢霉素A(CsA)及两者联合应用对大鼠肝移植模型不同程度排斥反应中肝细胞凋亡的变化情况。方法建立稳定的大鼠肝移植模型;利用同系大鼠肝移植作为对照组;非同系大鼠间肝脏移植术后抗排斥反应模型。分组应用1A29、CsA及联合应用。观察不同程度排斥反应中肝细胞凋亡的情况。结果同系大鼠间(SD→SD)未出现排斥反应;而非同系大鼠间(Wistar→SD)肝移植术后均出现不同程度的排斥反应。大鼠酶谱和胆红素明显增高,病理提示具有典型的排斥反应改变;CsA(10mg/kg体重)的应用可以有效地控制排斥反应的发生;CsA(3mg/kg体重)的单独应用对排斥反应无效,但CsA与1A29(30μg/kg体重)联合应用可以有效的控制排斥反应。单独应用1A29对排斥反应亦无效。发生排斥反应的移植物肝细胞凋亡显著增加;应用免疫抑制剂而未出现排斥反应的移植物肝细胞凋亡无明显增加。结论肝细胞凋亡与移植肝脏的排斥反应有着密切的相关性。肝细胞凋亡的发生与1A29的应用无明显关系。1A29的应用可以明显减少CsA的用量,单纯应用1A29不能有效控制肝移植的排斥反应过程。

鼠抗人B7-1分子功能性单克隆抗体的制备及生物学特性

目的 :制备鼠抗人B7 1分子的功能性单克隆抗体 ,研究其对高表达相应配基分子细胞的生物学效应。方法 :用两株转人B7 1基因细胞株XG7 B7和L B7分别作为免疫原及检测细胞株 ,利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。以快速定性试纸分析法鉴定单抗所属的小鼠IgG亚类 ,采用竞争抑制及间接免疫荧光法分析单抗的特异性和亲和力 ,以高表达B7 1分子的恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi为靶细胞 ,分析单抗对其生长的影响。以人多发性骨髓瘤细胞转入B7 1基因细胞株XG1 B7为刺激细胞 ,以人外周血单个核细胞 (PBLs)为反应细胞 ,用MTT法分析单抗的中和活性。结果 :成功地获得了 1株鼠抗人B7 1的功能性单克隆抗体 (克隆 4E5 ) ,属于小鼠IgG1亚类 ,经流式细胞仪分析 ,4E5与PBLs、体外人工诱导的树突状细胞(DCs)、Raji和Daudi的阳性结合率分别为 10 2 %、95 1%、92 7%及 89 2 % ;能完全阻断标准抗人B7 1单抗与相应抗原的结合。同时还发现 ,单抗 4E5能显著地抑制恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi的生长繁殖 ,并能阻断B7分子介导的协同刺激信号的传导。结论 :单克隆抗体 4E5是一株抗人B7 1分子的功能性单抗 ,具有重要的研究和应用价值。

抗黄曲霉毒素B_1单克隆抗体的制备及特性

用杂交瘤技术制备了５株产生抗黄曲霉毒素Ｂ１单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中之一ＡＦＢ１－２Ｈ８进行了较系统的研究。ＡＦＢ１－２Ｈ８属ＩｇＣ３。纯化腹水抗体效价约５×１０＾６。ＥＬＩＳＡ检测标准毒素的线性范围为０．５￣５０ｍｇ／ｍｌ。最低检出量为０．０１ｎｇ／ｍｌ。该单抗与参试的其它黄曲霉代谢物的交叉反应系数为０￣０．２１，该抗体有较大的应用价值。

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及试剂盒的研制

目的为了能够快速检测粮谷类食品中伏马菌素B1的污染水平,研制具有我国自主知识产权的针对伏马菌素B1快速检测试剂盒.方法制备了能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了敏感、特异、快速的酶联免疫吸附试验检测方法,最终形成具有中国自主知识产权的伏马菌素B1快速检测试剂盒.结果该试剂盒所用单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,亲和常数为8.3×10^-8mol/L.该抗体与其他结构类似物无明显交叉反应,具有较高的特异性.试剂盒对伏马菌素B1最低检出限5ng/ml,标准曲线的线性范围（50～500ng/m1）,回归方程Y=-0.582X＋1.793（r=0.99,P＜0.05）;对玉米作50ng/ml,200ng/ml和500ng/ml 3个加标浓度的回收率在71.89%～112.95%之间;试剂盒在常温状态下有效期至少10个月;实验室内的变异系数和实验室间的变异系数均小于20%.

伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用

拟制备灵敏高、特异性强的抗伏马菌素B_1(FB_1)单克隆抗体,并初步应用于FB_1的检测,以期为FB_1的免疫学快速检测提供技术支持。采用碳二亚胺法(EDC)制备人工抗原FB_1-BSA和FB_1-OVA。以免疫原FB_1-BSA免疫BALB/c小鼠,每四周免疫一次。四免后,小鼠脾B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,采用ELISA筛选,建立分泌抗FB_1抗体的单克隆杂交瘤细胞株;采用动物体内诱生腹水方法制备出抗FB_1单抗,并鉴定单抗的各种性能;初步建立FB_1免疫学检测方法。结果得到1株稳定分泌抗FB_1单抗的杂交瘤细胞株2E11-H3,该细胞株分泌的mAbs的效价高达1∶1.02×10~6,亲和力常数平均值为7.98×10^(10) L·mol^(-1),亚型为IgG_3。FB_1mAbs的工作浓度为1∶6.0×10~4,与FB_1发生特异性反应,间接竞争ELISA测得IC_(50)=43.65ng·mL^(-1);与FB_1结构类似物FB_2和FB_3的交叉反应率分别为385%和72.4%,与其他霉菌毒素及载体蛋白BSA和OVA均无交叉反应。样品回收率在85.85%~114.07%,平均值为98.81%;变异系数为10.11%。本研究制备出了灵敏度高、特异性强、亲和力高的FB_1单抗,并初步建立FB_1免疫学检测方法。

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。

分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立

目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆。结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定。结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序。

两株鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:制备鼠抗人PD-1单克隆抗体(mAb)及鉴定其生物学特性。方法:以基因转染细胞PD-1/L929为免疫原,免疫BALB/c小鼠;采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析,筛选分泌鼠抗人PD-1分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、Western blot、竞争结合抑制试验及肿瘤细胞株测定等方法对mAb进行生物学特性鉴定。结果:获得了2株持续稳定分泌鼠抗人PD-1mAb的杂交瘤细胞株,命名为1F2和5F10。对其生物学特性的鉴定结果表明,均为条带相对分子质量在(Mr)55000左右的免疫球蛋白,具有不同的PD-1结合位点;1F2mAb可识别SKHep-1和7721细胞株表面的PD-1分子,而5F10可识别Raji细胞株的PD-1分子。结论:成功获得了2株鼠抗人PD-1杂交瘤及其分泌的mAb。

H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。诱导表达的HA融合蛋白分子质量约为94.0 ku,表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。