IFNγ 防治大鼠胆总管结扎所致肝纤维化的实验研究

目的：了解ＩＦＮγ对持续肝外性淤胆所致肝纤维化的作用。方法：制作大鼠持续肝外性淤胆模型，用药组于胆管结扎同时每日肌注ＩＦＮγ５×１０４Ｕ，用药２周；对照组则仅行胆管结扎而不用药。２周后分别测定血清生化指标、肝纤维化指标及肝能量代谢有关指标。结果：ＩＦＮγ可改善血清生化指标（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。在组织学表现上，用药组肝纤维化程度显著低于单纯结扎组（Ｐ＜０．０１）。用药组大鼠淤胆后肝羟脯氨酸及血清透明质酸水平升高明显受抑（Ｐ＜０．０１）。肝ＡＴＰ及ＣＰ测定显示淤胆合并用药时两者均保持于较高水平。

荨麻疹患者外周血单个核细胞产生IL-4、IL-10及IFNγ水平及意义

为研究荨麻疹患者外周血单个核细胞(PBMC)产生白细胞介素-4(IL-4),白细胞介素-10(IL-10)及γ干扰素(IFNγ)的水平,采用双抗体夹心ELISA方法,测定了23例荨麻疹患者PBMC产生IL-4、IL-10及IFNγ水平。结果表明荨麻疹患者PBMC产生IL-4水平明显高于正常人(P<0.01),而产生IL-10及IFNγ水平与正常人相差不显著(P>0.05)。IL-4在Ⅰ型变态反应荨麻疹发病中可能起一定作用。

小鼠内皮抑素基因克隆、测序及pEgr-IFNγ-mEndostatin重组双基因表达质粒的构建

目的 :克隆小鼠内皮抑素 (m Endostatin)编码区 c DNA序列并构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和 m Endo-statin双基因表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应法 (RT- PCR) ,以小鼠肝细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m Endostatin,与 p MD1 8T载体连接作全自动测序 ,并利用基因重组技术构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和m Endostatin双基因表达质粒。结果 :经测序证实获得的 m Endostatin序列与文献报道完全一致 ,并构建了含 Egr-1启动子的 IFNγ和 m Endostatin双基因表达质粒 p Egr- IFNγ- m Endostatin。结论 :利用 RT- PCR法成功克隆了m Endostatin的 c DNA序列 ,构建了 p Egr- IFNγ- m Endostatin重组双基因表达质粒。

IFNγ修饰的DC对T细胞增值及杀伤肿瘤细胞作用影响的研究

目的探讨结肠癌细胞抗原致敏的IFNγ修饰的树突状细胞(DC)对T淋巴细胞增殖和分化的影响,以及活化T细胞对结肠癌LoVo细胞的杀伤作用。方法构建携带人IFNγ基因的重组复制缺陷型腺病毒载体(Ad-IFNγ),用其感染人外周血单个核细胞来源的DC;以流式细胞仪检测DC表型的变化。用反复冻融裂解法提取的结肠癌LoVo细胞抗原致敏DC,将其与自身T淋巴细胞共同培养,观察T细胞增殖和分化的情况以及活化T细胞对LoVo细胞的杀伤作用。结果Ad-IFNγ转染后24h内几乎不影响DC的吞噬功能,DC自身表达的IFNγ在一定程度上能促进DC的成熟;IFNγ修饰的DC经LoVo细胞抗原致敏后能明显促进T淋巴细胞的增殖并使其向Th1细胞分化,Th1细胞对结肠癌LoVo有明显的特异性杀伤效应。结论IFNγ修饰的DC能增强促进T淋巴细胞的增殖,诱导细胞免疫,增强T细胞的细胞毒作用,从而有效地杀伤肿瘤细胞。

活化条件对细胞内免疫染色IFNγ和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细胞的影响

目的：研究细胞活化条件对Ｔｈ１和Ｔｈ２细胞测定的影响。方法：采用酶联免疫斑点法（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔａｓａｙ，ＥＬＩＳＰＯＴ）测定活化细胞胞浆内的细胞因子。ＩＦＮγ阳性者为Ｔｈ１细胞，ＩＬ４阳性者为Ｔｈ２细胞。结果：ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ＋ＰＭＡ，ＰＨＡ＋ＰＭＡ或Ｃａ２＋载体＋ＰＭＡ刺激５ｈ，ＩＬ４阳性率均在１３％～１４％；ＩＦＮγ阳性细胞分别为（７３４±４７１）％、（７５６±４７０）％和（８９７±５６０）％，而刺激１６ｈ时，ＩＦＮγ阳性率分别变为（１１１９±４７２）％、（６８８±１７５）％和（５９４±２８４）％，有明显差异。结论：活化条件影响Ｔｈ细胞亚群的测定。

pcEgr-IFNγ重组质粒的构建与体外X射线诱导表达特性

目的 :扩增小鼠IFNγcDNA全长并构建pcEgr_IFNγ重组质粒 ,研究该重组质粒在不同剂量X射线作用下在B16细胞中的表达及时程。 方法 :利用PCR方法扩增小鼠IFNγcDNA全长 ,插入 pcDNA3.1质粒的多克隆位点 ,用Egr_1的启动子替代pcDNA3.1质粒的CMV启动子 ,构建成 pcEgr_IFNγ重组质粒 ;通过脂质体转染法将重组质粒转染入B16细胞 ,利用ELISA试剂盒检测在不同剂量X射线作用下 ,重组质粒的表达量及表达时程。 结果 :IFNγcDNA的扩增产物经测序 ,结果基本与已知序列相符 ,重组质粒经酶切鉴定 ,得出相应的特异带。不同剂量X射线照射后 ,pcEgr_IFNγ在B16细胞中表达量为77.73～94.60pg/ml ,明显高于对照组(P<0.05～P<0.01) ;2GyX射线照射后6h ,pcEgr_IFNγ表达量最高 ,为90.00pg/ml,明显高于对照组(P<0.001)。 结论 :用本实验克隆的IFNγcDNA所构建的 pcEgr_IFNγ重组质粒 ,经X射线的诱导 ,在被转染的B16细胞中表达量明显增高。对重组质粒X射线诱导表达的剂量时程的检测 ,为将来pcEgr_IFNγ基因治疗合并放疗的体内研究奠定了基础。

IFNγ-LTα与LTα诱导L929细胞凋亡信号转导的初步研究

目的 研究融合蛋白IFNγ LTα诱导L92 9细胞凋亡的信号转导机制 ,并与LTα相比较。方法 用结晶紫染色法观察细胞毒效应 ;用检测试剂盒检测caspase 8和 3活性的变化 ;观察 3种信号转导分子的抑制剂对IFNγ LTα和LTα诱导的细胞毒效应的影响。结果 IFNγ LTα能诱导L92 9细胞凋亡及胞内caspase 8和 3的活性变化 ,但两种caspase产生的时间和幅度有所不同。PKC的抑制剂可促进IFNγ LTα和LTα对L92 9细胞的杀伤 ;而PLA2及Ca2 +通道的抑制剂对杀伤则有明显的阻断作用 ,但对LTα的阻断强于对IFNγ LTα的阻断。结论 IFNγ LTα融合蛋白的抗肿瘤活性强于LTα ,其信号转导特征有别于LTα。信号分子caspase与PKC、PLA2、Ca2

Tet-off系统调控人IFNγ基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达

背景与目的:Tet-off系统是一个高效、低毒、具有严密开关功能的基因调控系统,本研究构建质粒pTre-IFNγ,初步探讨Tet-off系统调控人干扰素γ(interferon-gamma,IFNγ)基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达。方法:SacⅡ、XbaⅠ双酶切载体pTre及目的基因,T4连接酶连接,重组体经双酶切、测序鉴定;脂质体介导pTet-off及pTre-IFNγ共转染小鼠骨髓基质细胞;RT-PCR法检测IFNγmRNA,ELISA法检测分泌到培养液中的IFNγ蛋白,分析共转染后IFNγ的分泌规律、共转染后48h中不同浓度盐酸四环素对IFNγ蛋白分泌的影响及在共转染后第48h加入盐酸四环素在不同时间阶段对IFNγ蛋白分泌的影响。结果:双酶切及测序证实质粒pTre-IFNγ构建成功;共转染后48hRT-PCR检测到IFNγmRNA表达;ELISA法示IFNγ蛋白分泌持续6天,第3天的分泌高峰为每1×106个细胞(720.09±241.51)pg;共转染后48h中蛋白分泌量随四环素浓度增加逐渐减少,10～100ng/ml四环素存在时蛋白分泌接近零;第48h时添加盐酸四环素后8h即能明显抑制IFNγ蛋白表达,延长作用时间,抑制效应加重。结论:Tet-off系统能迅速而高效地下调人IFNγ基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达。

Ad/IFNγ转染的骨髓基质细胞的体内抗白血病作用

目的观察Ad/IFNγ转染的骨髓基质细胞在小鼠体内表达IFNγ的特征及规律,并观察其抗白血病作用。方法Ad/IFNγ(MOI=50,MOI感染复数)体外转染骨髓基质细胞,并通过RT-PCR,ELISA检测骨髓基质细胞表达IFNγ;将K562细胞成瘤的裸鼠随机分为3组,分别给予静脉回输Ad/IFNγ转染的骨髓基质细胞、Ad/LacZ转染的骨髓基质细胞以及未转染的骨髓基质细胞,每只裸鼠的回输量为2×106个细胞,以RT-PCR,ELISA检测IFNγ在裸鼠体内表达的规律并观察其抑瘤效应及生存期。结果RT-PCR,ELISA于体外均能检测到IFNγ的表达。体内研究发现,Ad/IFNγ-骨髓基质细胞组在体内检测到的IFNγ主要分布在肝、脾、骨髓和肿瘤中,但在血液中未能检测到IFNγ的表达。并且,Ad/IFNγ-骨髓基质细胞于体内有明显的抑瘤效应,并能够延长其生存期。结论骨髓基质细胞能够将外源性IFNγ基因携带至肝、脾、骨髓等造血组织,也能携带至肿瘤组织,基因修饰的骨髓基质细胞为我们提供了治疗白血病的新的前景。

Egr-IFNγ重组质粒的构建和在B16细胞中的辐射诱导表达

小鼠IFNγ cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成Egr-IFNγ重组质粒,利用质脂体介导转染B16细胞,用ELISA方法检测x射线照射后IFNγ表达的剂量效应和时程。结果表明,实验组的表达水平明显高于对照组,其中20Gy和2Gy照射组高于其它实验组(p<0.01)。26y照射后6h IFNγ表达量最高(p<0.01)。转染后的B16细胞每隔24h接受2Gy x射线照射,结果显示第一次照射后表达量最高(p<0.01),然后逐渐降低。结果提示电离辐射可激活Egr-IFNγ重组质粒,并调节IFNγ基因表达,这项研究可能对肿瘤治疗的研究有一定的意义。

工程酵母X4分泌表达HBscFv-IFNγ的发酵工艺优化

为提高工程菌-毕赤酵母X4诱导表达HBscFv-IFNγ(抗乙肝病毒表面抗原单链抗体-γ干扰素,single-chain Fv against HBVsurface antigen-γ-interferon)的量,本实验通过单因素和正交实验来优化发酵工艺,确定了X4表达HBscFv-IFNγ的最优工艺条件:150mL摇瓶培养84h,甲醇添加量2.2%(v/v),接种后的OD600=6.5,装液量20mL。使HBscFv-IFNγ的产量由起始的15mg/L提高到21.14mg/L,提高达40.9%。这为进一步对HBscFv-IFNγ的纯化、药效研究和高密度培养奠定了基础。

IFNγ/IL-4对人胎盘滋养层功能的影响

【目的】研究γ干扰素 (IFNγ) /白细胞介素 4 (IL 4 )对人孕早期胎盘滋养层细胞活性及人绒毛膜促性腺激素 (hCG)分泌的影响。【方法】胎盘滋养层细胞活性采用MTT法进行检测 ,胎盘滋养层组织分泌的hCG采用放免法进行分析测定。结果 :IFNγ在一定浓度范围内 (10～ 10 0 0ng/ml)对胎盘滋养层细胞活性及其hCG分泌有明显的抑制作用 (P <0 0 1) ;而IL 4 (1～ 10ng/ml)则有明显的促进作用 (P <0 0 1)。 【结论】IFNγ/IL

慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗前后血清IL2和IFNγ水平变化

目的 探讨拉米夫定治疗前后乙型肝炎患者血清IL 2、IFNγ水平变化及其临床意义。方法 根据拉米夫定治疗 12个月后的不同应答状况分组 ,进行回顾性研究 ,利用双抗体夹心ELISA法检测治疗前后不同时间点患者血清IL 2、IFNγ水平 ,另取 5例健康献血员作对照。结果 完全应答组治疗前血清IL 2、IFNγ水平显著高于健康对照 ,部分应答组治疗前血清IL 2、IFNγ水平与对照组相比无差异 ;治疗后可见血清IL 2、IFNγ水平升高 ,升高幅度和应答状况有一定相关性。结论 拉米夫定治疗应答状况与治疗前、后血清IL 2、IFNγ水平有关 ,治疗前其水平高者或治疗后其水平显著升高者 ,有更多的机会发生完全应答 ,血清IL 2。

HBscFv-IFNγ在毕赤酵母X33中的表达、纯化及鉴定

为了有效治疗乙肝病而研究了将抗乙肝病毒表面抗原单链抗体(single-chain Fv against HBV surface antigen,HBscFv)与临床治疗乙肝常用的γ-干扰素(γ-interferon,IFNγ)连接的融合蛋白(HBscFv-IFNγ)。采用重叠PCR法将基因hbscfv与ifnγ连接成hbscfv-ifnγ,再构建成多拷贝重组质粒pPICZαA/(hbscfv-ifnγ)1,2,4,然后转入巴斯德毕赤酵母X33。从中筛选出的工程菌株X4能够分泌表达目的蛋白HBscFv-IFNγ,并用SDS-PAGE、Western blotting和ELISA方法进行了初步鉴定,结果表明组成HBscFv-IFNγ的HBscFv和IFNγ仍具有生物学活性。用14F7亲合层析纯化X4的发酵液可获得纯度达95%～98%的HBscFv-IFNγ。它可中和HBV转基因小鼠血清中27.9%的乙肝病毒表面抗原(HBV surface antigen,HbsAg),这表明HBscFv-IFNγ上的抗体能够与生物体内的HBV有效结合。可见,HBscFv-IFNγ将是一种防治乙肝病而有开发前景的靶向新药。

藏獒犬IFNγ基因的克隆表达及其生物学活性测定

通过RT-PCR技术从刺激的藏獒犬外周血淋巴细胞中成功克隆IFNγ全基因,其大小为501bp,编码167个氨基酸,前23个AA为信号肽,与GenBank上发表的犬IFNγ((NM001003174.1)比较,序列的同源性为99.4%。构建了原核表达载体pET-30a-IFNγ,转化BL2L,IPTG诱导后表达约23Kd的重组蛋白,经镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后,纯度达90%以上;利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬γ干扰素的生物学活性,结果显示纯化的蛋白具有一定的抗病毒活性,本研究结果为进一步研究犬γ干扰素的抗病毒活性奠定基础。

HLA-A~*0201/WT1五聚体联合胞内IFNγ染色在检测白血病患者外周血WT1特异性T细胞中的应用

本研究探讨五聚体及胞内因子染色在定性定量检测抗原特异性T细胞中的应用价值。用RT-PCR方法检测受试者WT1表达水平;用HLA-A*0201/WT1五聚体及胞内IFNγ染色检测14例表达HLA-A*0201的白血病患者全相合移植前后及其供者外周血中的WT1特异性T细胞。结果表明:14例供者中2例有低水平WT1表达,白血病患者均有不同水平的WT1表达。14例供者均未检测到WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞;移植前14例患者中2例可检出WT1+CD8+CTL,3例检出WT1+IFNγ+细胞,二者间无明显差异(p=0.357),而移植后均可检出WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞,明显高于移植前(p值均<0.01)。移植后大部分患者均在30天内检出WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞,但后者检出率高于前者(p=0.014)。14例患者中WT1+CD8+CTL峰值中位数为0.18%,而WT1+IFNγ+细胞峰值中位数为0.83%,明显高于前者(p=0.005);WT1+CD8+CTL峰值中位时间为移植后75天,WT1+IFNγ+细胞峰值中位时间为移植后105天,但二者间无明显差异(p=0.455)。结论:五聚体及胞内IFNγ染色能有效检测白血病患者外周血中白血病抗原特异性T细胞;两种方法联合检测有助于抗原特异性T细胞的准确定性定量检测。

人His6-IFNγ/TNFβ(His6γ-TNFNβ)融合蛋白(包涵体)的分离、纯化与复性研究

应用pET28(含T_7lac启动子和His6-tag)质粒,将人γTNFβ融合基因与之组建成pETγLT表达质粒,并转化于E.coliBL21(DE3).本文对pETγLT/ BL21(DE3)工程菌的His6-γTNFβ重组产物进行了诱导表达,分离纯化的研究.结果表明,该工程菌用LB培养基在37℃扩增至OD_(590)为0.5左右,加IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导5小时,此时His6-γTNFβ的表达量可占菌体总蛋白的45%.重组产物绝大多数以IBs形式存在于菌体中.工程菌经反复超声破碎、高速离心,得IBs粗制品后,再经含2mol/L脲的缓冲液洗涤可得到相对纯净的IBs.然后用7mol/L脲变性溶解IBs,离心取上清,进行Ni^(2+)-Sepharose 6B柱一步法亲和层析,可得到电泳纯度为95%的His6-γTNFβ,经稀释复性和用凝血酶切去His6-tag的产物,其细胞毒活性为(1.2～2.0)×10~7U/mgp,抗病毒活性为(6.0～6.6)×10~6U/map.

IFNγ和 IL- 6对人肝癌细胞系C1抑制物合成的调控(英文)

目的为研究 IFNγ或 IL - 6对肝癌细胞系 C1抑制物 (C1INH)合成的调控作用。方法用 EL ISA双夹心法检测了经其刺激后 Hep G2和 SMMC7712细胞培养上清中 C1INH的含量。结果两细胞系自身能合成少量 C1INH。 IFNγ和 IL - 6可通过不同的途径上调两种细胞 C1INH的合成 ,且 IFNγ的作用强于 IL- 6。结论此结果提示有可能用 IFNγ和 IL- 6治疗 C1INH缺乏病。

IL-4T和IFNγR%转基因小鼠的遗传监测研究

引进了IL 4T和IFNγR %两个品系的转基因小鼠 ,在普通环境下饲养得到子代。采用PCR及Southern杂交方法对其进行了遗传监测 ,以检验转基因小鼠遗传特性 ,防止传代过程中基因的丢失。PCR方法可快速检测出小鼠的基因类型 ,但还有假阴性的结果出现。通过Southern杂交可对结果进行辅助检测 ,得到更确实的结果。