IGF-1基因克隆及其产物的测序鉴定

基因过表达在基础实验和基因治疗应用中都是常用的手段,而质粒的扩增在基因过表达过程中是不可或缺的技术,如何规范、高效地对质粒进行扩增和提取是基因治疗应用的前提,也是困扰很多基础研究人员的难题。利用现有的实验技术,在降低实验成本基础上,建立过表达质粒扩增、提取的最优方案。首先采用传统方法制作LB培养基和感受态细胞,对转化后的质粒进行大量扩增培养,之后使用商业试剂盒对质粒进行提取,反复试验后对商业试剂盒质粒提取过程进行优化,提高效率,最终获得高纯度和浓度的质粒溶液。经超微量分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测和sanger测序等多种方式检测验证后与NCBI数据库中目标基因序列一致,提示扩增、提取成功。经优化后的质粒扩增、提取方案标准、高效,成本低廉,是质粒基因克隆的最佳选择。

IGF-1基因5′调控区DNA序列多态性与新扬州鸡肌肉产量关系的研究

以150只非同胞新扬州鸡为材料,采用PCR-RFLP法检测了该基因5′调控区DNA序列多态性,并运用线性模型统计方法分析了多态性与肌肉生长相关性状的关系。结果表明:新扬州鸡IGF-1基因5′调控区存在两种不同DNA序列,经Pst1酶切后出现3种基因型(“-/-”、“+/-”、“+/+”),-/-基因型频率为16%,+/-基因型频率为45.33%,+/+基因型频率为38.67%,基因型分布符合“哈代-温格伯定律”(P>0.05)。各基因型鸡的12周龄体重、屠体重、全净膛重、胸肌肉重和腿肌肉重的最小二乘均数存在“-/-”>“+/-”>“+/+”的趋势,且-/-基因型显著高于“+/+”型(P<0.05),-/-基因型胸腿肌肉总产量比+/+型高8.76%。基因型效应分性别考察与合并考察有相似的趋势。而胸肌率、腿肌率和全净膛率各基因型间差异均不显著(P>0.05)。

泰和丝羽乌骨鸡IGF-1基因与体重的关联分析

将类胰岛素生长因子1(IGF-1)作为研究泰和丝羽乌骨鸡体重的候选基因,以江西省泰和乌鸡原种场的12周龄鸡为试验材料,根据鸡IGF-1基因序列设计引物,采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法进行基因型分析,探讨IGF-1基因多态性与泰和乌鸡体重之间的关系。在IGF-1基因第一外显子上发现一处突变,这个突变产生2种基因型(AA和AB),结果表明,泰和乌鸡体重在不同基因型之间均存在显著差异(P<0.05)。AB基因型12周龄体重显著高于AA基因型个体(P<0.05);IGF-1基因5′端进行PCR-RFLP分析,利用PstI酶切得到3种基因型,经统计分析与泰和乌鸡12周龄体重差异不显著。

日本白鲫IGF-1基因全长cDNA克隆及组织表达分析

通过已获得的多个物种IGF-1基因的cDNA序列,设计合成简并引物,用日本白鲫的肝脏总RNA反转录获得的cDNA做模板,克隆获得了IGF-1中间序列.在此基础上,通过SMART RACE,获得了IGF-1全长cDNA序列.经过序列对比分析,所得到的序列是日本白鲫(Carassius cuvieri)IGF-1 cDNA全长,其中开放阅读框为486 bp,编码含161个氨基酸的蛋白质,该蛋白质含有保守的信号肽、B、C、A、D和E结构域和6个半胱氨酸残基.同时,系统进化分析表明,在进化过程中IGF-1基因在鱼类中保持着高度保守的进化特征.IGF-1在日本白鲫中广泛表达于多个组织,尤其在肝脏中表达量最高.在垂体、心脏、肾脏和肌肉中有较高的表达.而在脑、脾脏、精巢和卵巢中的表达量较低.

萨福克羊GH和IGF-1基因组织表达水平的分析

为分析生长激素(growth hormone,GH)基因和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)基因对绵羊生长发育的作用,以6月龄萨福克公羊为试验材料,利用荧光定量PCR SYBR Green I荧光染料法,对绵羊肠系膜淋巴结、心脏、肝脏、垂体、大脑、肾脏、骨骼肌、皮肤、肺脏、睾丸和脾脏11个组织中GH和IGF-1基因的表达水平进行相对定量分析。结果表明,GH基因在睾丸、肠系膜淋巴结和脾脏中的表达量显著高于心脏、肝脏、大脑、肾脏和骨骼肌(P<0.05);IGF-1基因在肝脏和肠系膜淋巴结中的表达量显著高于心脏、垂体、大脑、肾脏、骨骼肌、皮肤、肺脏、睾丸和脾脏(P<0.05)。说明绵羊GH和IGF-1基因有特定的组织表达模式;GH基因与免疫、繁殖及机体的生长发育密切相关;IGF-1基因与生长发育及免疫密切相关,肝脏不仅是IGF-1的主要合成器官,也是该基因特异性表达的主要器官组织之一。GH和IGF-1基因均具有一因多效作用。

4个猪种IGF-1基因核心启动子区的克隆及生物信息学分析

为了探索IGF-1基因的启动子结构特征对猪体长性状的影响,应用PCR方法从藏猪、巴马小型猪、野猪、军牧一号猪的基因组DNA中分别克隆测序了IGF-1基因启动子区序列,并结合生物信息学手段分析了不同品种猪之间启动子区转录因子结合位点数目和序列特征的差异,发现在IGF-1基因启动子区,巴马小型猪与藏猪、东北野猪、军牧一号猪相比,缺失CdxA、Nkx-2 2个转录因子结合位点,但比藏猪、东北野猪多了1个MZF1转录因子结合位点;藏猪、东北野猪与军牧一号猪相比,缺失1个MZF1转录因子结合位点,邻接法构建的分子进化树发现,藏猪与巴马小型猪亲缘关系最近,与东北野猪亲缘关系相对较近,但与军牧一号猪亲缘关系最远。结果表明:猪的IGF-1基因启动子结构在不同体长猪种上存在一定差异。

转IGF-1基因超细毛羊与非转基因羊肠道粪便菌群多样性及组成差异分析

旨在探究超细毛羊转入IGF-1基因后是否会引起超细毛羊肠道微生物菌群群落改变而导致转基因羊生物安全存在隐患的问题。本研究在同一羊场随机选取临床健康羊3组,其中转IGF-1基因阳性组(GP组)41只(24母(GDF),17公(GPM)),转基因阴性羊(GN组)43只(25母(GNF),18公(GNM)),非转基因超细毛羊(NG组)29只(18母(NGF),11公(NGM))。取直肠粪样,应用IIlumina HiSeq高通量测序技术测定粪便样本中细菌的16S rRNA V3-V4区序列,分析转基因超细毛羊与非转基因羊间肠道粪样细菌群落组成。结果表明,共计得到17个门,32个纲,56个目,94个科,228个属及185个种;LEfSe分析显示,GPF组有10个生物标记物;GPM组有5个,均是反刍动物肠道菌群的常见定植菌;NGF组的生物标记物为拟杆菌BS11科;NGM组为厚壁菌门。均为反刍动物肠道菌群的主要优势菌。3组肠道菌群的共享菌分析显示,在门纲目科属种6个分类水平拥有共享菌比例高达91%~94%。本研究证实,转入IGF-1基因并未改变超细毛羊肠道菌群的整体结构分布,转基因羊具有生物安全及环境安全性。

转染hIGF-1基因增强软骨细胞聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原的表达

目的探讨人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor,hIGF-1)基因对软骨细胞分泌聚集蛋白多糖(aggrecan)、Ⅱ型胶原的影响.方法构建并鉴定携带hIGF-1基因的重组腺病毒(Ad/CMV-hIGF-1),采用1、10、100及500感染复数单位(multiplicity of infection,MOI)的Ad/CMV-hIGF-1转染软骨细胞,PBS为阴性对照,100μg/L hIGF-1生长因子为阳性对照,转染后4 d进行aggrecan、Ⅱ型胶原免疫组化,参照文献分析免疫组化阳性单位.结果在1～100MOI范围内,随着Ad/CMV-hIGF-1滴度增加,aggercan、Ⅱ型胶原表达递增,500 MOI Ad/CMV-hIGF-1转染后,aggrecan表达骤减;Ⅱ型胶原表达下降不明显.结论 hIGF-1基因对软骨细胞aggrecan、Ⅱ型胶原的表达有影响;100 MOI Ad/CMV-hIGF-1优于100 μg/L hIGF-1生长因子的作用.

玫瑰冠鸡IGF-1基因多态性与早期生长速度关系研究

以玫瑰冠类群鸡(玫瑰冠鸡)为材料,采用PCR-RFLP法检测了IGF-1基因5’调控区DNA序列多态性,并运用线性模型统计方法分析了多态性与初生重和12周龄体重的关系。结果显示:玫瑰冠鸡IGF-1基因5’调控区自然存在两种不同DNA序列,经PstI酶切后出现3种基因型("-/-"、"-/+"、"+/+"),基因型分布符合哈代-温伯格定律。各基因型个体的初生重、12周龄体重的最小二乘均存在"-/-">"+/-">"+/+"的趋势,且"-/-"型个体的12周龄体重显著高于"+/+"型个体(P<0.05)。

黄羽肉鸡IGF-1基因单核苷酸多态性与生长性状的相关研究

本试验将类胰岛素生长因子1(IGF-1)作为研究肉鸡生长的候选基因,以海门京海集团的第二世代黄羽肉鸡为试验材料,根据鸡IGF-1基因DNA序列设计引物,采用PCR-SSCP方法进行SNP检测和基因型分析,探讨IGF-1基因多态性与鸡生长性状之间的关系。于IGF-1基因外显子1上发现一处突变。这个突变产生的不同基因型与鸡生长性状进行的统计分析结果表明,个体的1日龄初生重、4周龄、12周龄及300日龄成年体重在不同基因型之间均存在显著差异(P<0.05)。AA基因型1日龄初生重、4周龄、8周龄及300日龄成年体重均显著高于BB基因型个体(P<0.05)。推测可以将IGF-1基因应用于鸡生长的标记辅助选择育种实践。

西藏小型猪IGF-1基因的克隆测序分析

目的克隆西藏小型猪的肝脏组织中的IGF-1基因的c DNA序列,并与Pubmed中查询到的猪c DNA进行比对分析。方法提取了西藏小型猪肝脏组织的总RNA,应用RT-PCR技术扩增了IGF-1基因的c DNA序列,将扩增出的片段克隆到p MD18-T载体上,构建重组质粒p MD18-T-IGF-1,进行测序分析。结果克隆出西藏小型猪肝脏组织中的IGF-1的c DNA序列,获得了大小为567 bp长的片段,编码了186个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(NM_214256.1)的IGF-1基因高度同源,比对序列发现,在440、455 bp处发生了G→A、C→T的突变,该位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,分别由组氨酸变成了精氨酸、亮氨酸转变成了丝氨酸。结论为西藏小型猪的生长发育机制研究提供了分子学依据。两个位点的突变引起的氨基酸的改变是否是导致西藏小型猪矮小的原因,需要进一步论证。

安义瓦灰鸡IGF-1基因多态性研究

研究了安义瓦灰鸡IGF-1基因的多态性,检测到该基因第1外显子有1处突变,表现为3种基因型,其中AA基因型的频率最高,BB基因型的频率最低,A等位基因的频率远高于B。多态信息含量分析表明,该位点属于中度多态位点。

IGF-1基因多态性与汉族青年体质指数和肺活量相关

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因5’调控区CA重复微卫星片段长度多态性与汉族人体质的关系,寻找能够用于基因选材和个性化保健指导的生物标记。方法测定60名19～20岁汉族学生的身体形态发育、心肺机能、运动素质方面的代表性指标。同时采集口腔脱落细胞,提取基因组DNA,PCR扩增目标片段,分析基因位点的多态性情况。用一般线性模型估算基因型与各项体质指标的关系。结果身高、体质量、800 m(女)、1 000m(男)、仰卧起坐、掷实心球指标,不同基因型组间差异不显著(P>0.05),而体质指数、肺活量的测定值,基因型组间差异显著(P<0.05)。CA重复片段长度与体质指数和肺活量负相关。结论本研究的数据显示:IGF-1基因5’调控区CA重复微卫星多态性与汉族青年的体质指数和肺活量显著相关,是预测肺活量和体质指数的有效基因标记,可以用于运动选材和个性化保健指导。

西藏小型猪IGF-1基因在不同生长发育阶段和不同组织器官中的差异表达

目的测定西藏小型猪的IGF-1基因在不同年龄阶段、不同组织中的表达分布情况,为未来的研究提供基础数据。方法采用实时荧光定量PCR技术,以GAPDH基因为内参照,检测了IGF-1基因在西藏小型猪不同组织和不同生长阶段间的表达变化。结果 (1)IGF-1基因表达的时序性研究表明在0、0.25、0.5、1、2岁时肌肉组织的表达量最低,在0、0.25、0.5岁时皮肤组织中表达量最高,在0.1、2、3岁时肝组织的表达量最高。(2)IGF-1基因在在7个不同组织中均有表达,0.25岁时其在表达丰度由高到低依次为:皮肤、肺、肝、肾、脾、心脏和肌肉。且在皮肤中的表达量最高且极显著高于其他各组织(P<0.01)。同时在不同年龄阶段的表达中,IGF-1基因0.25岁时在各组织中的表达均达到峰值。结论西藏小型猪的IGF-1基因的表达呈现出明显的时空特异性。

天祝白牦牛IGF-1基因克隆、生物信息学及差异表达分析

旨在获得天祝白牦牛 IGF-1基因序列,分析其分子结构特征及在牦牛毛囊发育周期中的表达规律,为解析白牦牛毛囊发育及被毛生长提供理论依据。以天祝白牦牛体侧皮肤为试验材料,通过PCR扩增及测序技术克隆 IGF-1基因CDS区序列,并与黄牛序列比对,进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测天祝白牦牛毛囊发育不同时期 IGF-1基因的mRNA表达水平。结果表明,天祝白牦牛 IGF-1基因的CDS区长465 bp,编码154个氨基酸;IGF-1基因编码蛋白的分子质量为17 065. 81 ku,理论等电点为9.36;蛋白质二级结构以无规卷曲(57.79%)和α-螺旋(27.27%)为主,序列分析表明,天祝白牦牛IGF-1蛋白为不稳定亲水蛋白;qPCR检测结果表明, IGF-1基因在牦牛毛囊发育的生长期、退行期和休止期均有表达,生长期和退行期表达量显著高于休止期。

IGF-1基因多态性对德化黑鸡产蛋性状遗传效应的研究

利用PCR-PstⅠ-RFLP技术对德化黑鸡的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因的5′端调控区进行多态性分析,并探讨了多态性与产蛋性状的相关性。结果表明,该调控区的扩增产物用PstⅠ酶切检测出3种基因型AA、AB、BB。利用最小二乘分析研究了该多态位点对产蛋性状的影响,结果表明该多态位点对开产日龄没有显著影响,对240日龄产蛋数和300日龄产蛋数有显著影响(P<0.05)。其中AA基因型的240日龄产蛋数和300日龄产蛋数显著高于AB基因型和BB基因型,表现为差异显著(P<0.05),AB基因型的240日龄产蛋数和300日龄产蛋数高于BB基因型,但表现为差异不显著(P>0.05)。

IGF-1基因多态性与骨骼肌性状的关系

运动员选材是竞技体育中取胜的关键之一。在后基因组时代,基因选材将成为运动选材的重要手段,而基因选材的前提是必须找到有效的基因标记。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种与肌肉、骨骼等组织的生长关系十分密切的小分子多肽,其基因上很可能存在运动能力分子标记。因此,以该基因为目标区域,进行了查找基因标记的尝试,用PCR-RFLP法检测了基因5’调控区单核苷酸多态(SNPs)情况,并用广义线性模型统计分析了多态性与肌肉性状的关系。结果显示:IGF-1基因5’调控区存在一个C-T转换突变,形成三种基因型,分别标记为:"-/-"、"-/+"、"+/+"。基因型与骨骼肌生长总量和肌纤维直径有着密切的关系,"-/-"基因型个体的胸部和腿部肌肉总量最高,与"+/+"基因型个体相比差异显著,P值分别为0.029和0.038,而且"-/-"基因型个体的肌纤维平均直径最大,与"+/-"基因型比差异显著(P<0.05)。

IGF-1基因内含子4多态性与南江黄羊生长性状的关系

为寻找与南江黄羊生长性状相关的分子标记,试验以羊的类胰岛素生长因子-1作为控制南江黄羊生长性状的主基因的候选基因,以405只南江黄羊为试验材料,利用PCR-SSCP方法和DNA序列分析技术检测了内含子4的多态性。结果表明:内含子4上有1个G→C颠换多态,与生长性状关联分析结果表明,该多态位点与初生重和周岁体重有关系(P<0.05),CC基因型初生重显著高于GG基因型和CG基因型(P<0.05);CC基因型个体的周岁体重显著高于CG基因型(P<0.05);且基因型对周岁体长和周岁体高的影响接近显著(P=0.0685和P=0.0606),在这两个体尺性状上,都表现为CC>GG>CG。初步认定CC基因型是初生重和周岁体重有利基因型。

鸡IGF-1基因的遗传多态性与繁殖性状的相关研究

对万载康乐黄鸡、泰和乌骨鸡2个鸡种共324个样本,采用PCR-RFLP技术对胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因的5’端调控区进行遗传变异研究,发现该调控区的扩增产物经PstⅠ酶切后出现3种基因型(AA、AB、BB)。分析这3种基因型与其部分蛋用性状的关系发现:在泰和乌骨鸡中,这3种基因型对其开产日龄、280日龄、300日龄及500日龄产蛋量影响差异均不显著(P>0.05)。在万载康乐黄鸡中,这3种基因型在开产体重、开产日龄、开产蛋重及280日龄产蛋量表现为差异不显著(P>0.05),而在300日龄及500日龄时表现为差异显著(P<0.05)。