rhLIF与IL-24基因协同诱导HL-60细胞的凋亡

目的:构建能稳定表达白血病抑制因子(LIF)的转基因细胞,并研究所表达的LIF与IL-24基因在诱导HL-60细胞凋亡方面的协同作用。方法:用真核表达质粒pcDNA3-LIF转染ECV304细胞,G418筛选阳性细胞,收集阳性细胞和培养上清,RT-PCR检测LIFmRNA的表达。同时在已转化重组腺病毒质粒的大肠杆菌中抽提质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL-24,用PacI酶切使重组腺病毒质粒线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,收获Ad-IL-24腺病毒子。将重组病毒子(Ad-IL-24)感染HL-60细胞,同时加入含LIF的培养上清,并设对照组,RT-PCR检测IL-24 mRNA表达,光镜下观察HL-60细胞形态的变化,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫细胞化学分析凋亡因子的改变。结果:成功构建能稳定表达LIF蛋白的转基因细胞;获得高滴度的重组腺病毒Ad-IL-24,用它感染HL-60细胞后,能检测到IL-24 mRNA的表达。各种检测方法表明LIF、IL-24基因都能抑制HL-60细胞生长、诱导凋亡,且两者具有协同作用。结论:LIF、IL-24基因都能抑制HL-60细胞生长,诱导凋亡,两者具有协同作用。

腺病毒介导hIL-24基因对瘢痕疙瘩表达Bcl-2等细胞因子的影响

目的:研究重组腺病毒介导hIL-24基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞表达Bcl-2、IL-6和TGF-β1的影响,探讨IL-24基因对瘢痕疙瘩的生物学作用。方法:体外培养人正常皮肤及瘢痕疙瘩成纤维细胞,用含有hIL-24基因的腺病毒载体感染瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ABC-ELISA)检测人正常皮肤及瘢痕疙瘩成纤维细胞中的Bcl-2、IL-6和TGF-β1的表达水平。结果:瘢痕疙瘩组的Bcl-2、IL-6和TGF-β1表达水平明显高于正常皮肤组;瘢痕疙瘩感染Ad.IL-24组的Bcl-2、IL-6和TGF-β1表达水平都低于腺病毒空载体组和瘢痕疙瘩组。结论:IL-24基因可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞表达Bcl-2、IL-6和TGF-β1。

Mda-7/IL-24基因转染对肝癌细胞生长的影响

目的研究Mda-7/IL-24基因对肝癌细胞系Hep3B生长的影响。方法构建Mda-7/IL-24基因的真核表达载体pcDNA3.1/Mda-7/IL-24,用脂质体介导的基因转染法分别将真核重组体pcD-NA3.1/Mda-7/IL-24和pcDNA3.1空载体质粒导入人肝癌细胞系Hep3B细胞中,经G418筛选获得细胞克隆。通过聚合酶链式反应(PCR)、免疫组织化学等方法检测基因和蛋白的表达、细胞生长增殖情况。结果将pcDNA3.1载体和pcDNA3.1/Mda-7/IL-24重组体转染肝癌细胞系Hep3B中,RT-PCR结果显示pcDNA3.1/Mda-7/IL-24克隆中有680bp的扩增条带,而pcDNA3.1空载体转染的克隆未见的扩增条带,未转染的Hep3B细胞亦未见680bp的条带;转染Mda-7/IL-24的Hep3B细胞与空白质粒载体转染的Hep3B细胞和Hep3B细胞的生长速度相比,后两者生长速度较快。结论将外源性Mda-7/IL-24基因导入Hep3B细胞后,可以抑制细胞生长。

mda-7/IL-24基因与肿瘤

在人类黑色素瘤细胞株 (HO- 1)中克隆了一个位于 1q34.2 - q4 1的新的黑色素瘤分化相关基因 m da- 7。该基因有70 2 5个碱基组成 ,含 7个外显子 6个内含子 ,编码大小为 2 3.8k Da蛋白 ,由 2 0 6个氨基酸序列组成。对多种肿瘤细胞具有抑制生长 ,诱导凋亡的作用 ,是一个新的肿瘤抑制基因。

IL-24基因联合去甲斑蝥素对A549人肺癌细胞凋亡的影响

目的:研究IL-24基因与NCTD联合作用对A549细胞增殖和凋亡的影响。方法:IL-24和(或)NCTD干预A549细胞24 h后,MTT法检测A549细胞增殖抑制率;用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;Western blot法检测Bax、Bcl-2、VEGF和HSP-70蛋白表达水平。结果:IL-24联合NCTD作用24 h对A549细胞增殖抑制率为60.3%,与NCTD/IL-24组比较差异有显著性;IL-24联合NCTD作用对A549细胞凋亡率为32.5%;IL-24和(或)NCTD作用A549细胞后Sub-G1期细胞增多;NCTD/IL-24作用24 h后Bax表达上调,Bcl-2、VEGF表达下调,联合组Bax蛋白表达上调,Bcl-2、VEGF、HSP-70表达下调,尤其VEGF、HSP-70表达下调明显。结论 :IL-24联合NCTD对A549细胞有协同抑制作用。

ING4及IL-24双基因共表达腺病毒载体对MG-63人骨肉瘤细胞体外抑癌增效作用研究

目的用人肿瘤生长抑制因子(mING4)及人白介素24(IL-24)基因构建腺病毒双基因共表达载体(Ad-ING4-IL-24),并设Ad-ING4和Ad-IL-24单基因对照,研究双基因共表达载体对MG-63人骨肉瘤细胞体外抑癌增效作用.方法首先将已构建成功的Ad-ING4-IL-24,Ad-ING4及Ad-IL-24腺病毒感染QBI-293A细胞,经多轮扩增后获得高滴度的病毒子,测病毒效价后分别以100 MOI剂量感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING-4及IL-24在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法检测ING-4及IL-24基因表达对MG-63细胞的生长抑制效应;半定量RT-PCR法检测ING4及IL-24基因表达对MG-63细胞中的Bcl-2,Bax,Caspase3,p21,CD34等相关基因表达的影响.结果获得了高滴度的重组腺病毒Ad-ING4-IL-24,Ad-ING4,Ad-IL-24和Ad-GFP;治疗后MG-63细胞中ING-4及IL-24双基因表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,ING-4及IL-24基因表达可通过上调细胞中Bax,Caspase3,p21和下调Bcl-2,CD34基因表达诱导细胞凋亡.在病毒子剂量为100 MOI时,Ad-ING4-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑制作用比对Ad-ING4和Ad-IL-24抑制效果更为显著.结论腺病毒介导的ING4或/和IL-24基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,且Ad-ING4-IL-24双基因比Ad-ING4和Ad-IL-24单基因的抑制效果更为显著,该现象可能是通过改变Bcl-2,Bax,Caspase3,p21,CD34基因表达水平来发挥抗肿瘤作用的.

IL-24重组载体的构建及其联合化疗药物对SKOV3细胞中TUBB3与ERCC-1基因表达的影响

通过基因重组技术将白介素24(IL-24)基因片段分别克隆成pc DNA3.0-OSP-1-IL-24和pc DNA3.0-IL-24载体,利用逆转录PCR(RT-PCR)测定2种载体的表达.将2种化疗药物紫杉醇(PTX)与顺铂(DDP)分别作用于正常SKOV3细胞及pc DNA3.0,pc DNA3.0-IL-24,pc DNA3.0-OSP-1和pc DNA3.0-OSP-1-IL-24稳定转染SKOV3细胞(卵巢癌细胞株),通过噻唑蓝(MTT)法检测化疗药物联合IL-24基因对细胞的杀伤效果及细胞的增殖能力,应用实时荧光定量PCR技术检测人β-微管蛋白3(TUBB3)与核苷酸切除修复交叉互补基因位1(ERCC1)基因在各组细胞中的表达.RT-PCR检测结果显示,通过基因重组技术克隆了pc DNA3.0-IL-24与pc DNA3.0-OSP-1-IL-24载体,IL-24基因能提高SKOV3细胞对化疗药物顺铂和紫杉醇的敏感性.其联合化疗药物对肿瘤药物的IC50值分别下降了10倍和6倍,TUBB3和ERCC1基因在IL-24基因转染的SKOV3细胞内的表达水平与在正常SKOV3细胞内相比,分别下降4倍和10倍多.上述结果表明,IL-24联合化疗药物可明显下调TUBB3与ERCC1基因的表达,该实验为临床治疗卵巢癌提供了重要的理论依据.

携带人mda-7／IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24对肝癌细胞凋亡的影响

目的观察携带人mda-7／IL-24的溶瘤腺病毒SG600IL24对各种不同转移潜能肝癌细胞HepG2、SMMC7721、MHCC97L和正常肝细胞L02的作用。方法将携带人mda-7／IL-24的溶瘤腺病毒SG600-IL24分别感染人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、MHCC97L和正常肝细胞L02，逆转录．聚合酶链式反应（RT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、Westernblot检测mda-7／IL-24基因和蛋白的表达，M1Tr观察肝癌细胞的生长抑制，Hoeehst33258和流式细胞仪（FCM）检测细胞的凋亡，流式细胞仪（FCM）检测细胞周期。结果RT-PCR和Westernblot显示mda-7／IL-24在肝癌细胞和正常肝细胞中高表达，ELISA提示细胞培养上清液中mda-7／IL-24蛋白也明显增加。MTT和流式细胞仪提示mda-7／IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长（生长抑制率分别为75％±2．5％，86％±3．5％，72％±1．8％，HepG2：F=5．86，SMMC7721：F=7．98，MHCC97L：F=5．13，均P〈0．01），促进肝癌细胞的凋亡（凋亡抑制率分别为56．5％±4．0％，34．4％±2．0％，43．3％4-2．5％，HepG2：F=203．4，SMMC7721：F=130．5，MHCC97L：F=160．6，均P〈0．01），阻滞肝癌细胞在G2／M期（G2／M期阻滞分别为35．4％±4．2％，40．5％4-5．O％，42．0％±5．0％，HepG2：F=112．5，SMMC7721：F=133．2，MHCC97I．：F=145．5，均P〈0．01），而对正常肝细胞没有明显的促进凋亡和增殖阻滞作用。结论溶瘤腺病毒SG600-1124能特异性杀伤不同转移潜能人肝癌细胞和诱导凋亡，促进肝癌细胞增殖阻滞，而对正常肝细胞无明显促进凋亡和增殖阻滞作用。

Mda-7/IL-24基因转染对肝癌细胞凋亡影响的研究

目的为了研究 Mda-7/IL-24基因对肝癌细胞系 Hep3B 凋亡的影响。方法构建了Mda-7/IL-24基因的真核表达载体 pcDNA3.1/Mda-7/IL-24,用脂质体介导的基因转染法分别将真核重组体 pcDNA3.1/Mda-7/IL-24和 pcDNA3.1空载体质粒导入人肝癌细胞系 Hep3B 细胞中,经G418筛选获得细胞克隆。通过聚合酶链式反应(PCR)、免疫组织化学等方法检测基因和蛋白的表达,同时检测了细胞的生长和凋亡情况。结果 pcDNA3.1/Mda-7/IL-24转染的 Hep3B 细胞能够检测到 Mda-7/IL-24的表达,可以抑制细胞生长,DNA 琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带,转染空载体和未转染的 Hep3B 细胞未见凋亡表现。结论将外源性 Mda-7/IL-24基因导入Hep3B 细胞后,可以促进凋亡,Mda-7/IL-24作为一种肝癌的治疗基因,具有广泛的应用前景。

抑癌基因IL-24在乳腺癌细胞中的表达及意义

目的研究hIL-24(人白细胞介素24)对MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长抑制作用。方法将pDC316-hIL-24-EGFP转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,用RT-PCR法、Western blot法检测IL-24基因在肿瘤细胞中的表达。结晶紫染色法检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的生长抑制。RT-PCR检测侵袭、转移相关基因的转录。ELISA法检测VEGF、Ang-1的分泌水平。结果 IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达,并对乳腺癌细胞增殖有明显抑制作用。能明显下调MMP-2、MMP-9的转录。VEGF、Ang-1表达下降。结论 IL-24对乳腺癌细胞有明显的抑制生长、侵袭转移、血管生成的作用。

真核双基因表达载体pBud-TRAIL-IL-24的构建及其在宫颈癌细胞中的表达

目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因和白细胞介素24(Interleutin-24,IL-24)基因的真核双基因表达载体,并观察其对宫颈癌细胞生长的影响情况。方法:采用分子克隆技术,将IL-24基因插入真核表达载体pBud-TRAIL中,构建双表达质粒pBud-TRAIL-IL-24,经酶切和测序鉴定后,转染宫颈癌HeLa细胞。荧光显微镜和免疫荧光双标技术检测TRAIL和IL-24在HeLa细胞中的表达。MTT法检测重组质粒对HeLa细胞生长状况的影响。结果:成功构建了真核双基因表达载体pBud-TRAIL-IL-24,并在宫颈癌细胞中表达;转染48 h后可见重组质粒对宫颈癌细胞生长有明显抑制作用(P<0.05)。结论:构建的双表达载体pBud-TRAIL-IL-24能在宫颈癌细胞中表达,并可有效抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,为进一步研究TRAIL和IL-24联合应用于宫颈癌的基因治疗奠定了基础。

IL-24抑癌基因联合大蒜素对肺癌细胞的杀伤作用

目的探讨IL-24基因联合大蒜素对肺癌A549细胞的增殖抑制和促凋亡作用。方法提取前期构建的p DC316-h IL-24-EGFP质粒,转染肺癌A549细胞,分为A组:空白对照组;B组:单独大蒜素组;C组:脂质体+IL-24组;D组:大蒜素+脂质体+IL-24。荧光显微镜下观察质粒的转染情况,结晶紫染色法和MTT法检测p DC316-h IL-24-EGFP联合大蒜素对肺癌A549细胞生长的影响,用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 40、80 mg/L大蒜素和p DC316-h IL-24-EGFP单用24、48 h对A549细胞均有明显抑制作用,呈剂量依赖性。低剂量大蒜素(40 mg/L)联合p DC316-h IL-24-EGFP比单用p DC316-h IL-24-EGFP作用更强(P<0.05)。40 mg/L大蒜素、p DC316-h IL-24-EGFP和两药联用48 h,A549细胞凋亡率分别为32.7%,39.4%和68.8%。结论 p DC316-h IL-24-EGFP联合大蒜素对人肺癌A549细胞有协同抑制作用。

携带IL-24基因的溶瘤腺病毒诱导黑素瘤细胞凋亡

目的探讨携带IL-24基因的溶瘤腺病毒（ZD55-IL-24）诱导人黑素瘤A375细胞凋亡的作用。方法用PCR方法鉴定ZD55-IL-24，并大量扩增、纯化和病毒滴度测定。将ZD55-IL-24感染人黑素瘤A375细胞。结晶紫染色观察细胞毒性，MTr法测定细胞存活率，Western印迹检测溶瘤腺病毒E1A、IL-24基因蛋白表达。结果PCR鉴定表明ZD55-IL-24包含IL-24基因且没有野生型腺病毒污染；结晶紫染色结果表明ZD55-IL-24对A375细胞有明显的细胞毒性效应。M1Tr法结果显示，ZD55-IL-24对A375细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性效应。Western印迹结果表明ZD55-IL-24能在A375细胞内高效表达E1A、IL-24基因。结论溶瘤腺病毒ZD55-IL-24能携带IL-24基因在黑素瘤A375细胞中高效表达，抑制细胞增殖并诱导其凋亡。

腺病毒介导的IL-24对人大细胞肺癌NCI-H460细胞的体外抑制效应

目的研究腺病毒介导的IL-24基因表达对NCI-H460肺癌细胞抑癌增效作用及分子机制。方法将Ad-IL-24重组腺病毒感染NCI-H460细胞。以Western blot法鉴定IL-24基因在NCI-H460细胞中的表达;MTT法检测重组腺病毒对NCI-H460细胞的生长抑制作用;经Annexin-V-PE/7-AAD染色后流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率变化;RT-PCR检测NCI-H460细胞中bax、caspase-3、bcl-2、survivin等因子的表达。结果腺病毒介导的IL-24基因在NCI-H460细胞中能够有效表达;Ad-IL-24组对NCI-H460细胞的生长具有明显的抑制作用,Ad-IL-24能够上调bax、caspase-3等因子的表达,下调bcl-2、survivin等因子的表达,诱导细胞凋亡。结论腺病毒介导的IL-24基因在体外可明显抑制人肺癌细胞NCI-H460的生长,诱导其凋亡,其分子机制可能与上调bax、caspase-3等促凋亡因子的表达,下调bcl-2、survivin等凋亡抑制因子的表达有关。

腺病毒介导的IL-24表达对PC-3人前列腺癌细胞体内外抑癌效应

目的:研究腺病毒介导的IL-24基因表达对前列腺癌细胞体内外的抑癌效应及分子机制。方法:将扩增的Ad-IL-24感染PC-3细胞,用RT-PCR和Western blot法检测IL-24基因在PC-3细胞中的表达;MTT法检测IL-24基因表达对PC-3细胞的生长影响;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡变化;RT-PCR法检测IL-24基因的表达对PC-3细胞中的Bcl-2、Bax、p53和Caspase3凋亡相关基因表达的影响。用Ad-IL-24在裸鼠PC-3移植瘤的瘤体内注射治疗,通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、CD34等与细胞凋亡和血管形成相关因子的表达。结果:IL-24基因在PC-3细胞中成功表达,对PC-3细胞增殖有明显抑制作用,可上凋p53、Bax、Caspase-3基因和下凋Bcl-2基因表达,进而诱导细胞凋亡。Ad-IL-24能显著抑制裸鼠前列腺癌移植瘤生长,瘤重的抑制率可达54%;免疫组化结果显示Ad-IL-24不仅能明显上调Bax和Caspase-3基因和下调Bcl-2基因表达,而且能引起与血管形成标记基因CD34表达水平下降。结论:腺病毒介导的IL-24基因表达在体内外可明显抑制PC-3细胞的生长,诱导其凋亡。其机制可能与上凋P53、Bax、Caspase-3基因和下凋Bcl-2和CD34基因表达水平有关。

Ad-ING4-IL-24对骨肉瘤生长抑制效应的实验研究

目的:研究肿瘤生长抑制因子4(ING4)和人白细胞介素24(hIL-24)双基因共表达腺病毒载体对MG-63人骨肉瘤细胞及其裸鼠移植瘤的抑癌增效作用。方法:将Ad-ING4-IL-24腺病毒感染MG-63细胞,用RT-PCR法检测ING4和(或)IL-24基因在肿瘤细胞中的表达。MTT法和流式细胞仪(FCM)检测ING4和(或)IL-24基因的表达对MG-63的生长抑制和促凋亡的影响。用骨肉瘤细胞的裸鼠移植瘤动物模型,检测Ad-ING-IL-24对移植瘤生长的抑制作用,并通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等基因的表达。结果:ING4和IL-24基因在MG-63细胞中成功表达,并对MG-63增殖有明显抑制作用,并能引起细胞凋亡,其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值升高有关。动物实验表明Ad-ING4-IL-24能显著抑制移植瘤生长,瘤重抑瘤率达75.7%。免疫组化结果显示Ad-ING4-IL-24能明显上调Bax、P21和Caspase-3等基因的表达,同时下调Bcl-2和CD34的表达。结论:Ad-ING4-IL-24在肿瘤基因治疗中是非常理想的抑癌增效载体。

卵巢特异启动子调控白介素24基因真核表达载体的构建

目的构建卵巢特异启动子-1(ovarian-specific promoter,OSP-1)调控白介素-24基因(Interleukin-24,IL-24)表达的真核表达载体。方法通过RT-PCR方法从人外周血基因组中扩增IL-24基因片段,应用基因重组技术将0SP-1启动子片段插入到pcDNA3.0真核表达载体,替换pcDNA3.0载体的CMV启动子与增强子序列,然后将克隆的IL-24基因片段插入到pcDNA3.0-OSP-1载体的OSP-1启动子的下游,从而构建成由OSP-1启动子调控IL-24基因表达的载体pcD-NA3.0-OSP-1-IL-24。结果载体构建过程的酶切结果以及测序结果表明载体pcDNA3.0-OSP-1-IL-24构建正确。结论通过基因重组技术成功构建了卵巢特异启动子调控IL-24基因表达的真核表达载体,为体外研究IL-24靶向特异性杀伤卵巢癌细胞提供了前期实验基础。

人白介素24基因克隆表达、纯化及活性检测

目的克隆人IL-24基因,构建原核表达载体,表达纯化GST-IL-24融合蛋白,检测其活性。方法用密执毒素诱导HeLa细胞表达IL-24 mRNA,通过RT-PCR获取IL-24cDNA,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,IPTG诱导表达,经GSTrap TMF Fcolumn亲合纯化,SDS-PAGE和Westernblot检测融合蛋白的表达,MTT法检测GST-IL-24对宫颈癌CaSKi细胞的抑制作用。结果克隆得到人IL-24的cDNA,序列与GenBank公布序列完全一致,SDS-PAGE电泳可见50kD大小的融合蛋白表达。GST-IL-24以剂量依赖的方式抑制宫颈癌CasKi细胞的生长。结论成功构建人IL-24基因原核表达载体,表达纯化得到GST-IL-24,该融合蛋白对宫颈癌CasKi细胞具有抑制作用。