Protective effects of total triterpenoids extracts from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja on STZ-stimulated INS-1 cells through regulating of autophagy and apoptosis

OBJECTIVE To explore the protective effects of total triterpenoids extracts from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja on STZ-stimulated INS-1 cells through regulating of autophagy and apoptosis.METHODS INS-1cells were cultured in media containing 3n M STZ and different doses of total triterpenoids extracts from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja.The proliferation of cells was examined by MTT assay,ROS content were detected by fluorescence enzyme label.The levels of superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px),hydrogen peroxidase(CAT),malondialdehyde(MDA)were also measured by colorimetry.The activities of caspase-3,9 were also observed by Caspase colorimetric assay kit in each group.The expressions of Bcl-2 m RNA and Bax m RNA were detected by Real time PCR,protein expression of LC3-Ⅱand PARP were detected by Western blotting.RESULTS Compared with the control group,total triterpenoids extracts from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja could promote the proliferation of INS-1 cells no matter with STZ or not when its concentration lower than 25μg·m L-1;but when its concentration higher than 100μg·m L-(1use individually)or 50μg·m L-1(combined use),total triterpenoids extracts from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja might significantly inhibite the growth of the cells whether STZ existed or not.Total triterpenoids extracts from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja(6.25,12.5,25μg·m L-1)might inhibit INS-1cell apoptosis,decrease intra-cellular ROS contents,improve the s upernatant liquid SOD,GSH-PX,CAT activities,decrease MDA level,promote INS-1 cell secreting insulin,decrease the protein expressions of autophagy protein LC3Ⅱand apoptosis regulating protein cleaved PARP protein,up-regulate the anti-apoptotic protein Bcl-2 m RNA expression,down-regulate the pro-apoptotic protein Bax m RNA expression and Bcl-2and Bax,reduce the activity of caspase-9 and caspase-3(P<0.05 or P<0.01).CONCLUSION Total triterpenoids extracts from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja has good protective effect on STZ-stimulated INS-1cells.It can inhibit STZ injured INS-1 cells to overproduce ROS production,enhance endogenous antioxidant enzymes(GSH-Px,SOD,CAT activities),reduce the expression of autophagy protein LC3Ⅱand apoptosisregulating protein cleaved PARP,up-reglute the antiapoptosis protein Bcl-2 expression,down-regulate the pro-apoptotic protein Bax expression,decrease the caspase-9 and caspase-3 activities,and improve the INS-1cell survival rate,and then play a protective effect on damaged INS-1 cells.

Impact of Bisphenol A (BPA) and Free Fatty Acids (FFA) on Th2 Cytokine Secretion from INS-1 Cells

Bisphenol A (BPA) is used in huge amounts for many plastic products and is a hormone (estrogen) disrupting agent. BPA as well as FFAs may be deleterious for the immune system. The aim was to identify Th2 cytokines and some of their signal transduction mechanisms in INS-1 cells, an insulin secreting cell line. Screening using a proteome profile indicated an increase of IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13 and IL-17 by BPA. Also FFAs (in combination with LPS) were positive. In detailed quantitative measurements, these results were confirmedly indicating a complex array of pro-and anti-inflammatory potential. The interaction of BPA with 17β-estradiol was non-additive with respect to IL-4 and IL-6 release and additive with respect to FFA interaction indicating same and different mechanisms of action, respecttively. As signal transduction PI3K (Wortmannin-sensitive) and STAT-3/6 (Tofacitinib-sensitive) are involved in various effects, INS-1 cells release several cytokines due to BPA and FFA attack which may be involved in disturbance of glucose homoeostasis and type 1 diabetes.

降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞凋亡的影响

目的:研究降糖消渴颗粒含药血清对胰岛瘤细胞INS-1凋亡的影响并对其作用机制进行初步探讨。方法:应用中药血清药理学方法制备降糖消渴颗粒含药血清及空白血清,以大鼠胰岛瘤细胞INS-1为研究对象,观察降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞形态的影响,并用流式细胞术检测含药血清对细胞凋亡率的影响,用Western blot的方法检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,初步探讨其抗凋亡机制。结果:与空白血清组比较,降糖消渴颗粒含药血清可保护INS-1细胞形态,并降低细胞凋亡率,同时降糖消渴颗粒含药血清减少了Bax蛋白表达,增加Bcl-2蛋白表达,提高了Bcl-2/Bax蛋白的比值。结论:降糖消渴颗粒含药血清可抑制胰岛瘤细胞的INS-1凋亡,其机制可能与以线粒体为核心的凋亡途径有关。

丝胶对链脲佐菌素作用下大鼠INS-1细胞Bax表达的调控作用

目的:观察丝胶对链脲佐菌素(STZ)致损伤大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1细胞)Bax表达的影响。方法:INS-1细胞分为三组,正常对照组(不予任何药物处理)、STZ处理组(10mmol/L的STZ处理细胞24h)、丝胶保护组(10mmol/L的STZ、300μg/ml的丝胶共同处理细胞24h)。采用CCK-8法观察各组细胞的活力,蛋白印迹和实时荧光定量PCR法检测各组细胞Bax蛋白和mRNA的表达情况。结果:STZ处理组INS-1细胞的活力明显低于正常对照组、Bax蛋白和mRNA表达明显高于正常对照组(P<0.05);丝胶保护组INS-1细胞的活力明显高于STZ处理组、Bax蛋白和mRNA表达明显低于STZ处理组(P<0.05)。结论:丝胶对STZ致损伤大鼠INS-1细胞具有保护作用,其机制可能与下调Bax的表达有关。

Resveratrol Attenuates Benzo(a)pyrene-Induced Dysfunctions,Oxidative Stress and Apoptosis in Pancreatic Beta-Cells

Background: Diabetes mellitus is one of the major health problems for people all over the world today. According to international diabetes federation reports, diabetes affects 382 million people worldwide. Environmental pollutants have deleterious effects on glucose metabolism and cause insulin resistance. We aimed to investigate the effects of the environmental pollutants benzo(a)pyrene, and the therapeutic potential of resveratrol. Methods: 20 μM of benzo(a)pyrene was administered after 48 h of resveratrol (80 μM) application for 24 h in INS-1 (832/13) insulinoma cells. The cells were treated with 20 μM benzo(a)pyrene for 24 hours after 48 hours initial preconditions with 10 μM resveratrol. Oxidative stress status, insulin secretion and apoptosis were analyzed by molecular techniques. Results: Though resveratrol increased the antioxidant status which was decreased by benzo(a)pyrene, interestingly, it increased the oxidative status. Resveratrol increased benzo(a)pyrene-depleted reduced glutathione levels to the control level. The mRNA expression levels of beta-cell functions associated with genes insulin-1, insulin-2 and sirtuin-1 were upregulated by resveratrol. Resveratrol treatment elevated the insulin concentration of culture medium, and the mRNA expression of forkhead box protein-1 gene. Resveratrol upregulated benzo(a)pyrene-downregulated p53 gene expression. On the other hand, benzo(a)pyrene-downregulated mRNA expression of B-cell lymphoma-2 was induced by resveratrol treatment. Conclusion: The data showed that resveratrol could reverse the oxidative alterations, functional impairments and the carcinogenetic effects of benzo(a)pyrene in pancreas beta-cells.

INSM1阳性宫颈小细胞神经内分泌癌一例

本文报道一例34岁女性宫颈小细胞神经内分泌癌病例,镜下见弥漫分布的小圆形细胞,胞质少,核深染,核仁不明显;免疫组织化学显示胰岛素瘤相关蛋白1(insulinoma-associated protein 1,INSM1)、CD56等特异性的标志物阳性,病理诊断为宫颈小细胞神经内分泌癌,此报道强调了INSM1在诊断小细胞神经内分泌癌中的潜在价值。

胰腺十二指肠同源框基因PDX-1的体外扩增

目的提取大鼠胰岛细胞瘤细胞株的RNA,以其中的mRNA为模板,扩增胰腺十二指肠同源框-1(PancreaticDuodenalHomeobox-1)编码基因,并测定核苷酸序列,为进一步克隆及表达PDX-1cDNA奠定基础。方法采用TIZOL方法进行RNA提取;通过RT-PCR方法扩增大鼠PDX-1cRNA;琼脂糖凝胶电泳检测后进行序列测定。结果从大鼠胰岛细胞瘤细胞中提取了RNA,以其中的mRNA为模板扩增出大鼠PDX-1基因,经琼脂糖凝胶电泳鉴定为目的片断,经序列测定与Genebank公布的序列一致。结论在国内首次成功的克隆了PDX-1基因。扩增时在5'端以限制性酶切位点进行限制,对进一步进行其克隆、表达研究以及对其生物学功能进行研究奠定了基础。

亚砷酸钠对NIT-1细胞增殖及胰岛素基因表达的影响

为了观察亚砷酸钠(NaAsO2)对胰岛β细胞NIT-1增殖及胰岛素(Insulin)基因表达的影响,本实验使用不同浓度的NaAsO2(1,2,4,8,16和32μmol/L)分别不同时间(24h和48h)作用于NIT-1细胞,以MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR方法检测Insulin mRNA的表达。结果显示:1)NaAsO2对NIT-1细胞增殖活性的影响:当NaAsO2浓度小于2μmol/L的时候轻度促进NIT-1细胞增殖(P>0.05)。当NaAsO2浓度大于4μmol/L时抑制细胞增殖(P<0.01),细胞增殖抑制率随NaAsO2浓度的增加及作用时间的延长而增加(P<0.01)。2)NaAsO2(1,4和8μmol/L)对NIT-1细胞Insulin mRNA的表达的影响:作用24h,各剂量组InsulinmRNA表达降低,其中8μmol/L组与对照组比差异有统计学意义;作用48h,各剂量组Insulin mRNA表达降低,其中4μmol/L组和8μmol/L组与对照组比差异有统计学意义。由此可得出砷对NIT-1细胞增殖及Insulin基因表达的影响与作用时间、剂量有关,Insulin mRNA表达水平的改变可能是砷影响胰岛β细胞功能进而引发糖尿病的机制之一。

Berberine Induces Cell Apoptosis through Cytochrome C/Apoptotic Protease-Activating Factor 1/Caspase-3 and Apoptosis Inducing Factor Pathway in Mouse Insulinoma Cells

Objective:To investigate apoptotic effects of berberine,a significant alkaloids component existing in Rhizoma coptidis,and its possible acting mechanism in insulinoma cells.Methods:Different concentrations of berberine were used to treat mouse insulinoma(MIN6)cells for various period of time.The viability and apoptosis of the cells were analyzed using methylthiazolyldiphenvl-tetrazolium bromide assay,flow cytometry and enzyme-linked immuno sorbent assay.Changes in the relating pro-and anti-apoptosis proteins were detected by western-blotting.Results:The half-maximal inhibitory concentration(IC50)of berberine was 5.7μmol/L on MIN6 cells viability for 16 h.Berberine caused a 20%reduction(P<0.05)in cell number after only 4-h incubation;which reached 50%after 24 h(P<0.01).Berberine treatment for 16 h significantly increased the level of DNA fragmentation.The flow cytometry showed the apoptotic rate increased 2.9-and 4.6-fold after treating with berberine(5μmol/L)for 8 and 16 h,while 3-and 8.7-fold after 10μmol/L treatment for 8 and 16 h(P<0.01).Berberine treatment dramatically elevated the expression ratio of Bax to Bcl-2.Meanwhile,berberine notably increased the apoptosis-inducing factors and cytochrome C transforming from the mitochondria to the cytoplasm.Apoptotic protease-activating factor 1(Apaf-1)was subsequently activated after cytochrome C release.Furthermore,caspase-3 and poly adenosine diphosphate-ribose polymerase were also activated to trigger apoptosis cascade.Conclusion:High concentration(5 and 10μmol/L)of berberine could induce the apoptosis of MIN6 cells through cytochrome C/Apaf-1/caspase-3 and apoptosis inducing factor(AIF)pathway.

放射性核素标记胰高血糖素样肽1类似物的研究进展

胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种有效的抗高血糖内源性激素,可以促进葡萄糖依赖性的胰岛素分泌,抑制胰高血糖素释放。天然的GLP-1半衰期短,易受二肽基肽酶4降解,GLP-1类似物可以在延长半衰期的同时保持其生物活性。GLP-1受体(GLP-1 receptor,GLP-1R)在胰腺β细胞和胰岛素瘤表面高度表达,因此通过放射性核素标记GLP-1及其类似物对GLP-1R可视化在胰岛素瘤的诊治、胰腺β细胞的量化和功能评估、活体示踪胰岛移植等领域展现出了独特优势。随着GLP-1及其类似物在体内更多系统的生理和药理作用被揭示,这类放射性探针在包括心血管疾病和神经精神类疾病中的应用也逐渐成为可能。本文主要概述了靶向GLP-1R的放射性探针在胰岛素瘤和β细胞显像中的研究进展,并进一步结合GLP-1生理学作用,对放射性核素标记的GLP-1及其类似物未来在更多领域的发展进行综述。

siRNA干扰AT1R基因调控链脲佐菌素诱导NIT-1细胞凋亡的实验研究

目的用siRNA干扰技术沉默小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)基因,探讨其对链脲佐菌素(STZ)诱导的胰岛素瘤细胞凋亡的影响。方法针对小鼠AT1R基因,设计并合成3对siRNA序列,脂质体法转染至NIT-1细胞,荧光显微镜观察荧光强度检测转染效率,Real-time PCR检测AT1R mRNA表达量判断不同干扰序列及干扰时间的基因沉默效果;分4组:空白组不予任何干预,STZ组予5 mmo L/L STZ干预30 min,si-AT1R组予40 nmol/L si-AT1R转染24 h,si-AT1R+STZ组予40 nmo L/L si-AT1R转染24 h后5mmo L/L STZ干预30 min;Real-time PCR检测Caspase-3 mRNA表达量,Hoechst33342染色荧光显微镜和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 40 nmol/L siRNA转染的荧光强度最强,转染后AT1R mRNA表达量明显下降,si-AT1R-2转染24 h的沉默效果最佳(92.20%);Caspase-3 mRNA表达量:STZ组与空白组比增加了2.37倍(P<0.05),si-AT1R+STZ组与STZ组比减少了11.28%,但差异无统计学意义;细胞凋亡率:STZ组与空白组比增加了3.27倍(P<0.05),si-AT1R+STZ组与STZ组比减少了26.82%(P<0.05)。结论本研究建立了稳定的胰岛细胞AT1R基因沉默模型;RNA干扰沉默胰岛细胞AT1R基因可通过下调Caspase-3mRNA表达量降低STZ诱导的细胞凋亡率,提示AT1R介导了STZ诱导的胰岛细胞凋亡过程。

1，25-二羟基维生素D3对链脲佐菌素致胰岛素瘤细胞损伤的保护与修复作用

目的初步探讨1，25-二羟基维生素D3（1，25。（0H）zD3）对链脲佐菌素（STZ）所致大鼠胰岛素瘤（INS-1）细胞损伤的保护与修复作用。方法将INS-1细胞接种于培养板中，置于CO：培养箱中进行培养，药物干预后，应用细胞计数试剂盒（CCK8）检测细胞增殖活力，ELISA法分别检测培养液中的胰岛素浓度、丙二醛（MDA）浓度和总抗氧化能力（T-AOC）。结果1，25-（0H）：D3可以促进INS-1细胞的活力和胰岛素的分泌（P〈0．01）。STZ所致模型组的细胞活力降低（P〈0．001），胰岛素分泌量减少（P〈0．01），MDA含量明显升高（P〈0．01），T-AOC能力下降（P〈0．01）。与STZ组比较，1，25-（OH）2D3保护组与修复组在不同程度上改善了上述指标（P〈0．01）。结论1，25-（oH）2D3可以促进INS-1细胞分泌胰岛素，对STZ损伤的胰岛细胞具有-定的保护与修复作用。

Quantitative mitochondrial proteome of pancreatic INS-1β cells stimulated with prolonged high glucose using SILAC

Most type 2 diabetics are accompanied with deficiency of insulin secretion and hyperglycemia. It has reported that glucose-stimulated insulin secretion of β cell (GSIS)

稠李花色苷酶法制备及对H_2O_2诱导大鼠胰岛素瘤细胞损伤的保护作用

目的:探究纤维素酶酶法制备稠李花色苷的最佳条件,并研究制备的稠李花色苷对H_2O_2诱导的大鼠胰岛素瘤(Ins-1)细胞损伤的保护作用。方法:通过单因素试验和正交试验,优化得到酶法制备稠李花色苷的最佳条件;稠李花色苷处理大鼠Ins-1细胞,进行形态学观察、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]细胞活力实验、2’,7’-二氢二氯荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichloro dihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光探针法检测细胞内活性氧实验研究稠李花色苷对H_2O_2诱导损伤的Ins-1细胞保护作用。结果:纤维素酶法提取稠李花色苷的最佳条件为:温度60℃、纤维素酶添加量9 mg/g、料液比1∶35(g/m L)、p H 3.5,此条件下稠李花色苷得率为(0.956±0.027)mg/g;形态学观察及MTT细胞活力实验显示,稠李花色苷对H_2O_2诱导损伤的Ins-1细胞具有较强的保护作用,DCFH-DA法检测细胞内活性氧实验说明,稠李花色苷能够显著地清除Ins-1细胞内的活性氧。结论:纤维素酶法制备稠李花色苷是一种有效的方法,制备的稠李花色苷对H_2O_2诱导的大鼠Ins-1细胞损伤具有较强的保护作用。

胰岛素瘤动物模型的建立及特性研究

目的:建立胰岛素瘤的动物模型并分析其特性,为胰岛素瘤的深入研究奠定实验基础。方法:首先检测体外培养的大鼠胰岛素瘤细胞株INS-1的激素释放能力,然后将INS-1细胞移植到裸鼠左肾包膜下,或在移植后18 d或在移植前3 d联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)破坏动物自身胰岛。尾静脉采血检测血糖,当血糖<2.8mmol/L认为胰岛素瘤模型建立。对各种条件建立的模型,观察给予不同刺激物对血糖的影响以及动物血清中胰岛素含量;并对动物胰腺组织和移植细胞的肾脏组织标本进行免疫组化染色检测胰岛素和胰高血糖素。结果:胰岛素瘤细胞既表达胰岛素,同时也表达胰高血糖素。裸鼠接种INS-1细胞后3～4周血糖<2.8 mmol/L;移植肾脏明显增大,形成明显肿瘤,直径≥1 cm。细胞移植后腹腔注射STZ的动物,血糖短暂回升,超过正常血糖水平,之后又逐渐下降,约2周后血糖<2.8 mmol/L。正常裸鼠给予STZ后血糖明显升高,移植INS-1细胞后动物血糖逐渐下降,约4周后血糖降至2.8 mmol/L。与正常对照组相比,3种方法建立的胰岛素瘤模型给予高糖后,动物血糖峰值低。高糖加精氨酸或乙酰胆碱刺激后,正常动物血糖峰值较单纯高糖刺激降低,并较快降至正常水平,但3种胰岛素瘤模型组血糖升高均明显超过单纯高糖刺激者。高糖加去甲肾上腺素刺激后,正常动物血糖达到峰值时间延迟,血糖水平下降缓慢,3种胰岛素瘤模型组血糖较单纯高糖刺激组有所升高。与正常对照组相比,3种胰岛素瘤模型血浆基础胰岛素的水平明显升高。结论:通过给裸鼠肾包膜下移植INS-1细胞,可建立胰岛素瘤动物模型,且瘤细胞同时表达胰岛素和胰高血糖素,不易被STZ破坏。该模型为进一步探讨胰岛素瘤的发病机制奠定实验基础。

胰岛素瘤相关蛋白-2高表达对胰岛细胞增殖的影响

目的:探讨1型糖尿病自身抗原胰岛素瘤相关蛋白-2(IA鄄2)高表达对胰岛细胞系RIN5F细胞增殖、生长周期和细胞凋亡的影响。方法:利用分子克隆技术构建IA鄄2真核表达载体,转染RIN5F细胞后筛选稳定高表达IA鄄2的细胞系,采用3鄄(4,5鄄二甲基)鄄5鄄(3鄄羧甲基苯环)鄄2鄄(4鄄硫基苯)鄄2H鄄四唑盐复合物(MTS)检测法确定细胞增殖速率,运用流式细胞术检测细胞生长周期和细胞凋亡水平。结果:IA鄄2高表达细胞增殖速率显著低于载体对照组细胞(P<0.05)。IA鄄2高表达细胞的细胞凋亡数显著高于载体对照组细胞(P<0.01)。IA鄄2高表达细胞中位于S期的细胞比率显著增加,而G2/M期的细胞比率减少(P<0.05)。结论:IA鄄2在胰岛细胞内高表达可抑制胰岛细胞的增殖,促进细胞凋亡,在G2鄄M期细胞生长阻滞。

脂多糖对大鼠胰岛素瘤细胞INS-1自噬和凋亡的影响

目的研究脂多糖（LPS）对大鼠胰岛素瘤细胞INS-1自噬和凋亡的影响及其可能机制。方法取处于对数期生长的INS-1细胞用于实验，分别用0．1、1．0、10．0mg／LLPS处理细胞，24h后用磺酰罗丹明B（SRB）染色法检测LPS对INS-1细胞增殖的影响，用二氯荧光素双醋酸盐（DCFH-DA）作为荧光探针检测细胞内活性氧的水平变化，应用Western blotting法检测细胞自噬体膜上自噬标志分子微管相关蛋白1的轻链3-Ⅱ（Map1LC3-Ⅱ）和凋亡标志蛋白聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶（PARP）切割带的变化。将INS-1细胞的自噬必需基因7（A增7）通过siRNA介导的RNA干扰手段进行沉默，然后以1．0mg／LLPS处理细胞，24h后应用Western blotting检测细胞中Atg7、Map1LC3-Ⅱ和PARP切割带的水平。先用400μmoL／L的活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理INS-1细胞，1h后加入10．0mg／L的LPS，24h后应用Western blotting法检测细胞Map1LC3-Ⅱ蛋白和PARP切割蛋白的水平。组间数据比较采用方差分析和t检验。结果与对照组（0．755±0．030）比较，0．1、1．0、10．0mg／LLPS组INS-1存活率降低，差异有统计学意义（分别为0．658±0．042、0．658±0．015、0．634±0．029，F=30．98，P〈0．01）；与对照组（0．447±0．012）相比，0．1、1．0、10．0mg／LLPS组Map1LC3-Ⅱ蛋白水平增加，差异有统计学意义（分别为0．992±0．030、0．949±0．020、0．982±0．013，F=525．79，P〈0．01）；与对照组（0．055±0．001）相比，0．1、1．0、10．0mg／LLPS组PARP切割蛋白水平增加，差异有统计学意义（分别为0．313±0．007、0．390±0．011、0．500±0．033，F=327．09，均P〈0．01）；与对照组比较，10mg／LLPS组活性氧产生明显增多。与对照组比较，转染Atg7siRNA组Atg7、Map1LC3-Ⅱ和PARP切割蛋白水平均显著下降，差异均有统计学意义（t=156．069、123．154、103．246，均P〈0．01）。与LPS10．0mg／L组比较，LPS10．0mg／L＋NAC组Map1LC3-Ⅱ和PARP切割蛋白水平均显著下降，差异均有统计学意义（t=66．37、26．84，均P〈0．01）。结论LPS可诱导INS-1细胞的自噬和凋亡，且其所诱导的凋亡依赖于自噬的发生；活性氧参与了LPS诱导的INS-1细胞的自噬和凋亡。

大鼠胰岛素瘤实验模型的建立及其应用

目的通过移植大鼠胰岛素瘤INS-1细胞至糖尿病小鼠肾包膜下使之形成胰岛素瘤,并诱导其发生凋亡,建立可用于研究胰岛β细胞凋亡机制的动物模型。方法将5×106INS-1细胞接种于链脲霉素(STZ)造模的糖尿病小鼠左肾包膜下,监测动物空腹血糖和血清胰岛素水平的变化,当血糖趋近正常后摘取动物左侧肾脏并检测其血糖和血清胰岛素水平的变化;固定包埋摘取的肾脏,进行HE染色以及胰岛素的免疫组化染色,确定胰岛素瘤模型的建立。在胰岛素瘤动物模型中,腹腔给予毒胡萝卜素(TG)或软脂酸钠(PA),监测给药后动物空腹血糖的变化,当血糖浓度出现逆转时,摘取动物左侧肾脏,通过TUNEL原位染色法检测移植瘤细胞的凋亡。结果将INS-1细胞移植到糖尿病小鼠肾包膜下后,从第9天开始,动物空腹血糖进行性降低,血清胰岛素水平逐渐升高,当动物血糖接近至正常时,摘取动物左肾导致动物血糖显著升高,在摘取的左肾可见明显的移植瘤,免疫组织化学染色显示移植瘤细胞为胰岛素阳性。在胰岛素瘤动物模型给予TG或PA刺激后,动物空腹血糖出现逆转,显著升高,血清中胰岛素含量明显降低,摘取动物左侧肾脏后,TUNEL原位染色发现移植瘤内有明显的细胞凋亡。结论大鼠胰岛素瘤INS-1细胞肾包膜下移植可以建立胰岛素瘤动物模型,应用此动物模型可以在体内研究胰岛β细胞凋亡的机制。

慢病毒介导SiRNA沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳MOI值及筛选抗生素浓度

目的探究慢病毒介导RNAi沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)及BSD基因筛选抗生素(blasticidin)浓度。方法荧光标记小鼠SGMS2干扰阴性对照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120(TU number/cell)分别侵染INS-1空白细胞,培养72 h后使用荧光显微镜拍照并计算细胞的荧光比率(%)及死亡率(%),以确定最佳MOI值。小鼠胰岛素瘤INS-1空白细胞中加入0、1、2、3μg/m L blasticidin,第7天时采用MTT法检测细胞的死亡率,以确定细胞抗生素敏感浓度。使用SGMS2干扰阴性对照慢病毒及SGMS2干扰慢病毒(病毒滴度:1×108TU/m L)按照最佳MOI值侵染细胞,并用blasticidin敏感浓度进行阳性细胞筛选,获得混合系细胞。当细胞的荧光率达90%时,进行单克隆稳转细胞系的构建。结果最佳MOI值为60,此时细胞的荧光率达100%,但细胞的死亡率<0.5%,细胞保持原有的形态。当blasticidin敏感浓度为2μg/m L,此时空白细胞失去原有的贴壁性,全部死亡。INS-1-SEMS2细胞第2次检测的Ct值28.21大于第1次检测的Ct值27.58,且siRNA的干扰效率为77.78%,siRNA成功表达,混合稳转细胞系构建成功。成功构建小鼠胰岛素瘤INS-1-SEMS2单克隆细胞系。结论慢病毒介导RNAi沉默基因SGMS2的单克隆细胞系构建成功。

血管紧张素Ⅱ2型受体重组腺病毒的扩增及其在INS-1细胞中的转染

目的利用人胚肾(HEK)293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和对照病毒Ad-CMV-EGFP,并测定病毒滴度。在INS-1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP的滴度分别为9×109和8×109pfu/ml。在INS-1细胞中转染Ad-GAT2R-EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值(P<0.05),同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad-CMV-EGFP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS-1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。