健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠NLRP3信号通路IL-1β、IL-18表达的影响

目的探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠NLRP3信号通路白细胞介素(IL)-1β、IL-18表达的影响。方法从40只SD大鼠随机选取10只作为正常组,其余大鼠自由饮用5%硫酸葡聚糖溶液7 d制备UC大鼠模型,将成模大鼠随机分为模型组、柳氮磺吡啶组和健脾益肠散组,每组10只。健脾益肠散组和柳氮磺吡啶组予相应药液灌胃,正常组和模型组予等体积蒸馏水灌胃,连续14 d。观察大鼠一般状况,并进行疾病活动指数(DAI)评分,ELISA检测大鼠血清核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶1(Caspase-l)含量,免疫组化染色、Western blot和RT-PCR检测结肠组织IL-1β、IL-18蛋白及mRNA表达。结果与正常组比较,模型组大鼠一般状况较差,DAI评分显著升高(P<0.01),血清NLRP3、ASC、Caspase-l含量显著增加(P<0.01),结肠组织IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,健脾益肠散组和柳氮磺嘧啶组大鼠一般状况明显好转,DAI评分显著降低(P<0.01),血清NLRP3、ASC、Caspase-l含量明显减少(P<0.05,P<0.01),结肠组织IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论健脾益肠散可抑制NLRP3信号通路IL-1β、IL-18表达,改善结肠免疫炎症损伤,发挥治疗UC作用。

健脾益肠散对TNF-α诱导的树突状细胞NLRP3炎症小体信号通路表达的影响

目的观察健脾益肠散对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的树突状细胞(DCs)NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白表达的影响,探讨其治疗溃疡性结肠炎的作用机制。方法分离培养C57BL/6小鼠原代DCs,分为正常组、模型组、阴性对照组、阳性药组和中药组,TNF-α诱导构建DCs炎症微环境模型,各组分别予相应处理后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,免疫荧光、Western blot分别检测DCs核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白表达,Western blot、RT-PCR分别检测DCs白细胞介素(IL)-1β、IL-18蛋白和mRNA表达。结果与正常组比较,模型组DCs增殖能力显著下降(P<0.01),细胞NLRP3、ASC、Caspase-1阳性表达显著升高,NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达及IL-18、IL-1βmRNA表达显著升高(P<0.01);与模型组和阴性对照组比较,阳性药组和中药组DCs增殖能力显著上升(P<0.01),细胞NLRP3、ASC、Caspase-1阳性表达显著降低(P<0.01),NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-1β、IL-18mRNA表达显著降低(P<0.01),且中药组细胞增殖能力、Caspase-1阳性表达、IL-18 mRNA表达均明显高于阳性药组(P<0.05),IL-1βmRNA表达明显低于阳性药组(P<0.05)。结论健脾益肠散能抑制TNF-α诱导的DCs炎性反应,其治疗溃疡性结肠炎作用机制可能与调控NLRP3炎症小体信号通路NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β表达有关。

基于自噬探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜保护的作用机制

目的通过观察健脾益肠散对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠自噬相关分子表达的影响,探讨其肠黏膜保护的作用机制。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、健脾益肠散组和柳氮磺吡啶组。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇溶液复合法建立溃疡性结肠炎大鼠模型;模型复制成功后灌胃给药,每日1次,持续14 d。观察大鼠一般状况,计算疾病活动指数(DAI)评分;苏木素-伊红(HE)染色法观察结肠组织病理形态;透射电镜观察结肠上皮细胞自噬情况;免疫荧光染色法、蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测结肠组织肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测自噬蛋白5(Atg5)、自噬蛋白7(Atg7)、泛素结合蛋白62(p62)mRNA表达。结果与正常组比较,模型组一般情况较差,DAI评分明显升高(P<0.0001);结肠组织出现明显的上皮细胞损伤,电镜下自噬体的数量明显减少;结肠组织Beclin1、LC3-II/LC3-I蛋白及Atg5、Atg7 mRNA表达明显降低(P<0.0001),p62 mRNA表达明显升高(P<0.0001)。与模型组比较,健脾益肠散组大鼠一般情况明显恢复,DAI评分明显降低(P<0.0001);结肠组织病理损伤有不同程度的改善,电镜下自噬体的数量明显增多;结肠组织Beclin1、LC3-II/LC3-I蛋白及Atg5、Atg7 mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.001,P<0.0001),p62 mRNA表达明显降低(P<0.01)。结论健脾益肠散可通过上调自噬相关分子Beclin1、LC3、Atg5及Atg7的表达,下调p62的表达,增强自噬以达到保护溃疡性结肠炎模型大鼠结肠黏膜损伤的作用。

健脾益肠散对TNF-α处理树突状细胞炎症因子水平及共刺激分子CD40表达的影响

目的:观察健脾益肠散对肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理的树突状细胞(DC)炎症因子水平及其刺激分子CD40表达的影响。方法:原代分离、培养C57BL/6小鼠DC细胞,采用流式细胞术对DC的主要标记物CD11c进行鉴定,并将培养的DCs随机分为正常组、模型组、阴性对照组、阳性药组及受试药组,TNF-α处理细胞构建DC炎症微环境模型,各组给予不同处理后,于倒置荧光显微镜下观察各组DCs的形态,采用CCK-8检测细胞的增殖能力,采用ELISA法检测各组DC培养上清液中CD40、IL-1β及IL-18含量,采用Western blot及RT-PCR技术分别检测各组DCs中CD40的蛋白和mRNA表达水平。结果:分离纯化的DC的CD11c表达率为85.1%,与正常组比较,模型组DC培养上清液中CD40、IL-1β及IL-18的含量、细胞中CD40的蛋白及其mRNA表达均明显增多,而增殖能力显著下降(P<0.01);受试药组DC培养上清液中CD40、IL-1β及IL-18的含量、CD40的蛋白及其mRNA表达减少,且细胞增殖能力上升,与模型组及阴性对照组相比较皆有统计学意义(P<0.01)。结论:健脾益肠散对TNF-α处理的DCs共刺激分子CD40的蛋白和mRNA表达及炎症因子的含量具有明显的抑制作用,可能是其发挥免疫耐受作用治疗溃疡性结肠炎的重要机制之一。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠IFN-γ、IL-10、TGF-β1的影响

目的:观察健脾益肠散对溃疡性结肠炎(UC)大鼠血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1的影响。方法:将60只SD大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、健脾益肠散高、中、低剂量组和柳氮磺吡啶组,每组10只;采用2、4、6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法复制UC大鼠模型;给药21天后,ELISA法测定各组大鼠血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1含量。结果:模型组大鼠血清IFN-γ、TGF-β1含量增加,IL-10含量减少,与正常组比较均有统计学差异(P<0.01);与模型组比较,健脾益肠散高、中剂量组IFN-γ、IL-10含量和高剂量组TGF-β1含量均明显改善(P<0.05或P<0.01);健脾益肠散高剂量组血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1的变化与柳氮磺吡啶组比较差异无统计学意义(P>0.05),但其明显优于健脾益肠散低剂量组(P<0.05)。结论:健脾益肠散对UC肠黏膜免疫的保护作用可能与调节外周血IFN-γ、IL-10、TGF-β1的含量有关。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD40表达的影响

目的:探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎(UC)大鼠CD40分子蛋白和基因表达的影响。方法:SD大鼠60只,随机分为空白组,模型组,健脾益肠散高、中、低剂量组和西药组(柳氮磺吡啶组);采用TNBS/乙醇法制备UC大鼠模型;灌胃相应药物21 d后,免疫组化、Western blot和RT-PCR法分别检测各组大鼠结肠组织中CD40的蛋白和mRNA表达。结果:模型组大鼠结肠组织CD40的蛋白和mRNA表达较空白组显著升高(P <0. 01)。各给药组均可不同程度地降低结肠CD40蛋白和mRNA的表达(P <0. 05或P <0. 01),且以健脾益肠散高剂量最为明显,而健脾益肠散中剂量与柳氮磺吡啶比较差异不显著(P> 0. 05)。结论:健脾益肠散对UC肠黏膜的免疫保护可能与降低CD40的表达有关。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD86和ICAM-1表达的影响

目的观察健脾益肠散对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠CD86分子(CD86)和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的影响,探讨其对UC肠黏膜的免疫保护机制。方法将60只SD大鼠先随机分为空白组和造模组,造模组采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)溶液灌肠法制备UC大鼠模型,待模型复制成功后再将造模组随机分为模型组、西药组和中药高、中、低剂量组;干预21 d后,免疫组化法检测各组大鼠结肠组织中CD86的阳性表达,Western Blot、RT-PCR法分别检测结肠中ICAM-1的蛋白和mRNA表达。结果与空白组比较,模型组大鼠结肠组织中CD86的阳性表达以及ICAM-1的蛋白和mRNA表达均显著增高(P<0.01);与模型组比较,中药高、中、低剂量组和西药组CD86、ICAM-1的表达均不同程度地降低(P<0.05或P<0.01),且以中药高剂量组最为明显(P<0.05或P<0.01)。结论健脾益肠散可能通过降低结肠组织中CD86、ICAM-1的表达水平起到对UC结肠黏膜的免疫保护作用。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD80、LFA-1表达的影响

目的研究健脾益肠散对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠共刺激分子CD80、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)表达的影响。方法SD大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组和健脾益肠散高、中、低剂量组,采用TNBS溶液灌肠法建立UC大鼠模型,给药21 d后取材,免疫组织化学法检测结肠组织中CD80、LFA-1的蛋白阳性表达,RT-PCR法检测结肠组织中CD80、LFA-1的mRNA表达。结果模型组大鼠结肠组织中CD80的蛋白阳性和mRNA表达均明显增加,LFA-1的蛋白阳性和mRNA表达均明显减少,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01);健脾益肠散高、中、低剂量均可不同程度地降低CD80的蛋白阳性和mRNA表达、升高LFA-1的蛋白阳性和mRNA表达,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);且健脾益肠散高剂量组优于健脾益肠散中、低剂量组(P<0.05或P<0.01)。结论健脾益肠散对UC肠黏膜的免疫炎症抑制作用可能与调节结肠组织中CD80、LFA-1的表达有关。

健脾益肠散对LPS诱导树突状细胞成熟标志CD83表达的影响

目的观察健脾益肠散对体外脂多糖(LPS)诱导的树突状细胞(DC)成熟标志CD83表达的影响。方法原代分离、培养C57BL/6小鼠DC细胞,采用流式细胞术对DC细胞的主要标记物CDla进行鉴定,LPS诱导细胞构建DC细胞成熟模型。将培养的DC细胞随机分为空白对照组、模型组、中药含药血清组、空白血清组和IL-10组。干预24 h后,采用Western blotting、RT-PCR技术分别检测各组DC细胞中CD83的蛋白和mRNA表达。结果与空白对照组比较,模型组DC细胞CD83的蛋白和mRNA表达均明显增多(P <0.05或P <0.01);中药含药血清组DC细胞CD83的蛋白和m RNA表达减少,与模型组和空白血清组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论健脾益肠散对LPS诱导的DC细胞成熟标志CD83的蛋白和mRNA表达具有明显的抑制作用,可能是其发挥免疫耐受作用治疗溃疡性结肠炎(UC)的重要机制。

基于UPLC-Q-TOF/MS鉴定健脾益肠散大鼠体内外源物成分

目的基于UPLC-Q-TOF/MS技术研究健脾益肠散在正常大鼠体内的原型成分和代谢产物,归纳总结不同类型化合物的体内代谢规律。方法采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm,1.8μm)色谱柱,流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸水(B),梯度洗脱,体积流量0.4 mL/min,柱温30℃,电喷雾离子源(ESI),在正、负离子模式下对色谱流出物进行质谱检测。结果从大鼠血浆、尿液、粪便中鉴定出34个原型成分、79个代谢成分,主要代谢途径包括氧化、还原、甲基化、葡糖醛酸结合、硫酸结合等。结论对健脾益肠散在大鼠体内的外源物成分进行快速有效的定性,为揭示其功效成分的作用机制提供物质基础。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织HSP70表达的影响

目的:探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠组织热休克蛋白70(HSP70)蛋白和mRNA表达的影响。方法:将健康SPF级雄性SD大鼠60只,随机分为2组,正常组和造模组;造模组采用二硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法复制UC大鼠模型;待复制模型成功后将造模组随机分为5组,分别为模型组、柳氮磺吡啶组(0.3 g·kg^(-1))以及健脾益肠散高、中、低剂量组(204,136,68 g·kg^(-1)),每组10只;灌胃相应药物21 d后,观察各组大鼠的一般状态和结肠黏膜组织损伤情况,免疫组化、蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分别检测大鼠结肠组织中HSP70的蛋白和mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠结肠黏膜损伤评分显著升高(P<0.01),HSP70蛋白和mRNA表达均显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组结肠黏膜损伤评分均显著降低(P<0.01),各给药组均可增加结肠组织HSP70的蛋白和mRNA表达(P<0.05,P<0.01),其中以健脾益肠散高剂量组最为明显(P<0.05,P<0.01)。结论:健脾益肠散可能通过促进HSP70的表达而达到对UC大鼠结肠黏膜的免疫保护,从而发挥治疗作用。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠MyD88的影响

目的:探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎(UC)大鼠髓样分化因子88(MyD88)的影响。方法:将60只大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组(0.3 g·kg-1)及健脾益肠散高(204 g·kg-1)、中(136 g·kg-1)、低剂量(68 g·kg-1)组,每组10只;除正常组外,其余均采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法复制UC大鼠模型;灌胃给药21 d后,用ELISA、免疫组化、Western blot及RT-PCR法检测各组大鼠血清MyD88含量和结肠组织MyD88的表达。结果:模型组大鼠血清MyD88水平及结肠组织MyD88蛋白和mRNA表达均明显高于正常组(P<0.01);健脾益肠散高、中剂量组血清MyD88含量和结肠MyD88蛋白及mRNA表达均较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);健脾益肠散低剂量组MyD88蛋白表达亦低于模型组(P<0.05);健脾益肠散高剂量组对MyD88的影响与柳氮磺吡啶组比较差异不显著,但明显优于低剂量组(P<0.05)。结论:健脾益肠散对UC肠黏膜免疫的保护作用可能与降低外周血MyD88水平及结肠组织MyD88的蛋白和基因表达有关。