乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b(+),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.

L-乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析

构建了一株产D ,L_乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD_1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ14 4作为宿主 ,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因 (ldhL)。核酸序列分析表明 ,该基因以ATG为起始密码子编码 316个氨基酸残基组成的蛋白质 ,预测的分子量为 33 84kD ;5′端存在典型的启动子结构 ,3′端的终止子是不依赖于 ρ因子的转录终止子。ldhL编码的蛋白质有 3个保守区域 ,其中Gly13～Asp5 0保守区域是NADH的结合位点 ,Asp73～Ile10 0和Asn12 3～Arg15 4保守区是酶的活性部位。该ldhL和其他乳杆菌的ldhL基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核苷酸序列相似性最高仅为 6 4 1% ,氨基酸序列相似性最高仅为 6 8 9% 。

嗜热菌的耐热 L-乳酸脱氢酶的研究

从广东各地的热温泉(55—95℃)水样中,分离到200余株最适生长温度高于70℃的极端嗜热菌。其中一株编号为 HG25,具有耐热胞内 L-乳酸脱氢酶(L-Lactate dehydrogenase EC.1.1.1.27.,简称 LDH),有栖热菌属(Thermus)的特征,革兰氏阴性,无芽孢,好氧,不运动,产黄色素,最适生长温度为65—75℃,最高生长温度为85℃,最低为40℃,不水解淀粉,不从葡萄糖产酸,DNA 的 G+C 百分含量为65mol%,L-乳酸脱氢酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素柱层析作了初步提纯,比活提高7倍,LDH 还原丙酮酸反应的最适温度为60℃,最适pH为8.0,酶在70℃稳定,保温10分钟后,仍保留85%的原始酶活力。失活半寿期(t_(1/2))为85℃10分钟。

一个产生L-乳酸脱氢酶的嗜热菌的新种——非解朊栖热菌

从广东省阳江、电白和韶关等地55—95℃的温泉中采集水样,经分离得到21株 G^-、不产生芽孢的高温菌。它们都能产生 L-乳酸脱氢酶。根据表观特征,DNA 的同源性和 G+Cmol%等特征可归入栖热菌属(Thermus)。但对葡萄糖不产酸和不液化明胶等表型特征不同于已发表的种。又根据该群内的 DNA/DNA 杂交结果,有高的同源性(大多在80%以上),而与已发表的种仅有40.5—70.7%的同源性。结果表明可成立一独立的类群,建议为栖热菌属的一个新种,因具不液化明胶的特性,命名为非解朊栖热菌(Thermus nonproteolyticus Cai & Yangsp.nov.)。以菌株 HG-42为模式株,保藏于中国科学院微生物研究所。

L-乳酸脱氢酶抑制剂抑制成因的探讨

应用 HF/3 21G研究了抑制剂 H2N－ CO－ COO－对 L乳酸脱氢酶的抑制成因 .结果表明 ,酶被抑制的主要原因有 :(1)抑制剂与底物的稳定构象态在结构上极为相似 ,导致酶不能有效识别底物 ;(2)模型抑制剂各原子所带净电荷的优势使抑制剂更易与酶活性中心结合 ;(3)抑制剂通过对酶的诱导契合作用使酶活性中心的空间被缩小 ;(4)对活性中心有关结构的分析表明 ,底物的甲基分子片以及酶的氨基酸残基 Gln 102,对催化反应能否顺利进行 ,影响极大 .

L-乳酸脱氢酶生产菌的选育及产酶条件

从泡菜汁中筛得一株胞内L 乳酸脱氢酶(L LDH)活性较高的植物乳杆菌RS2 2,采用亚硝基胍和超声波同时作用进行诱变,使其比活力由3.48U/mg提高到7.49U/mg,并对突变株的产酶条件进行了研究.

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。

不对称还原苯丙酮酸的L-乳酸脱氢酶L-LcLDH2的表达及生物信息学分析

以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增一种L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH2)的编码基因Lcldh2;借助表达质粒pET-28a(+)将Lcldh2在大肠杆菌BL21(DE3)中实施异源表达。实验结果表明,细胞超声破碎液中L-LcLDH2催化苯丙酮酸的酶活性为47 U/mg总蛋白质;采用重组E.coli/Lcldh2全细胞催化苯丙酮酸还原,所获产物L-苯乳酸的对映体过量(eep)值>99%。生物信息学分析表明,Lcldh2开放阅读框长906 bp,编码含301个氨基酸的L-LcLDH2,预测其相对分子质量和等电点分别为32585和5.5;L-LcLDH2含有典型的NAD+结合位点序列(GXGXXG),属于NAD依赖型L-乳酸脱氢酶,且是一种非分泌、非跨膜、无信号肽和定位于细胞质的酶蛋白。L-LcLDH2的获得为生物法制备高光学纯L-苯乳酸提供了新的酶源。

L-乳酸脱氢酶热变性的热力学研究

用差示扫描量热法对L-乳酸脱氢酶的热变性进行了研究(温度扫描范围为290—390K,酶蛋白溶液浓度为0.28—0.72mg蛋白/mg溶液)。实验观察到当酶溶液浓度在0.62—0.72mg蛋白/mg溶液范围内有一个吸热转变,酶溶液浓度小于0.62mg蛋白/mg溶液时有两个未完全分开的吸热转变。 这个酶的量热焓与范德霍夫焓的比远大于1,而接近于2,这表明乳酸脱氢酶的变性过程不是一个简单的两态转变,从热力学和吸热峰的形状、大小分析,可以推断乳酸脱氢酶分子是由两个以弱相互作用相连结的合作结构区组成,而每一个结构区是由两个相互作用很强的亚基组成。也就是说乳酸脱氨酶的变性过程包括两个半独立的合作结构区的转变,每一个结构区的转变都近似一个两态转变,ΔHeal与ΔHvh的比值是随着两个半独立部分相互作用的增强,即蛋白浓度的增加而减小。随着蛋白浓度的减小,蛋白质周围水分子增多,酶分子中两个半独立部分的相对独立性增强,这可由热谱图上一个吸热转变变成两个半独立的转变得到证实。

硫化氢信号分子与L-乳酸脱氢酶蛋白相互作用机制的研究

硫化氢(H_2S)作为信号分子与目标蛋白相互作用而实现信号传导机制的研究一直是研究热点。本研究以L-乳酸脱氢酶为目标蛋白,选用3种H_2S供体试剂(NaHS、Na_2S、PS),采用分子荧光实时监测L-乳酸脱氢酶活性变化,研究H_2S与目标蛋白的相互作用。SDS-PAGE电泳结果显示,H_2S不是通过形成二硫键/三硫键的方式与L-乳酸脱氢酶蛋白相互作用;圆二色谱结果表明,L-乳酸脱氢酶的二级结构发生变化,提示H_2S可能存在半胱氨酸巯基衍生能力,以硫烷硫存在的PS具有最强的巯基作用力;MALDI-TOF-MS/MS分析结果表明,L-乳酸脱氢酶蛋白中部分半胱氨酸巯基位点发生了硫烷化,进一步揭示了H_2S是通过与活性半胱氨酸巯基位点硫烷化的方式与L-乳酸脱氢酶发生作用。

L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌BL-21(DE3)中的表达

为了在大肠杆菌中构建利用葡萄糖生产L-乳酸的途径,以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LA-04-01基因组为模板,设计引物扩增L-乳酸脱氢酶基因L-ldh。将该基因连接到表达载体pET-28a(+)上,并转化大肠杆菌Top10。通过卡那霉素抗性平板筛选,提取重组质粒pET28a-L-ldh并测序,结果正确。将pET28a-L-ldh转化大肠杆菌BL-21(DE3),通过卡那霉素抗性平板筛选,得到产乳酸的大肠杆菌基因工程菌。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳,检测到目的蛋白条带,L-乳酸脱氢酶比酶活力达到9.44 U/mL。该基因工程菌通过摇瓶发酵,L-乳酸产量达到3g/L,成功构建出一条在大肠杆菌中生产L-乳酸的新途径。

鼠李糖乳杆菌L-乳酸脱氢酶的生物信息学分析和基因克隆

本研究以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)L-乳酸脱氢酶(Lr-L-LDH)为研究对象,以研究较多的Lr-L-LDH1为对照,对基因组注释的两个Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2基因,进行异同分析。采用在线网站和专业软件对Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2的一级结构、基本特性、亲疏水性、二级结构进行分析和预测,对三级结构进行同源建模以及酶和底物的分子对接分析,并对酶的编码基因进行系统发育分析,克隆表达及酶活性检测。结果显示:相较于Lr-L-LDH1,Lr-L-LDH2有着相似的分子特性,二级和三级结构,但Lr-L-LDH2编码序列短,氨基酸序列同源性低(48.08%),有不同的进化地位;Lr-L-LDH2也含有乳酸脱氢酶催化活性位点序列和保守的NAD^(+)结合位点序列(GXGXXG),能够形成典型的活性三维口袋域,是NAD^(+)依赖型四聚体结构L-乳酸脱氢酶,在细胞中需要果糖1,6-二磷酸(FBP)来激活,催化丙酮酸还原为L-乳酸;体外克隆表达和酶学分析表明,Lr-L-LDH2酶活力极显著低于Lr-L-LDH1(P<0.01)。Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2都具有乳酸脱氢酶活性,推测二者在乳酸表达调控中相互作用,对鼠李糖乳杆菌L-乳酸脱氢酶的分子改造应同时考虑Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2的作用,研究对乳酸发酵工业的基因工程改造提供分子基础和科学依据。

保加利亚乳杆菌ATCC11842 L-乳酸脱氢酶同工酶基因的克隆与表达分析

通过对保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)同工酶基因的异源表达、酶活测定和摇瓶发酵研究L-LDH在乳酸合成中的作用。将保加利亚乳杆菌ATCC11842中L-乳酸脱氢酶基因ldb0120和ldb0094分别克隆至载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28aldb0120和pET28aldb0094,并转化到大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行表达。进一步对重组蛋白进行Ni-NTA柱亲和层析和酶学活性测定,结果显示,LDB0120和LDB0094的比活力分别为0和25 U/mg,表明LDB0094是具有低活性的L-乳酸脱氢酶,而LDB0120不具有活性。对两株重组菌分别进行好氧和微好氧发酵,重组菌E.coli BL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧条件可以合成L-乳酸,浓度分别为41.9和227.9 mg/L,而菌株E.coli BL21/pET28aldb0120在两种培养条件下均基本不合成L-乳酸,推测保加利亚乳杆菌中L-乳酸脱氢酶LDB0094为催化L-乳酸合成的关键酶。首次对保加利亚乳杆菌的L-乳酸脱氢酶同工酶基因进行研究,通过基因异源表达、蛋白纯化、酶活测定和摇瓶发酵,揭示Ldb0094酶为保加利亚乳杆菌ATCC11842中催化L-乳酸合成的关键酶。

L-乳酸脱氢酶催化反应机理的ab initio研究

应用ab initio方法在HF/6-31G*水平上对L-乳酸脱氢酶催化反应机理进行了研究. 结果表明, 的转移是丙酮酸盐转化为L-乳酸盐反应的速度控制步骤, 并且, 与的转移是准同步进行的. 反应的活化能为168.37 kJ/mol, 反应物的复合物与产物复合物的能量差为?87.61 kJ/mol, 丙酮酸转变为乳酸是吸热反应. 与文献报道的半经验研究相比, 计算结果的显著特征是: 过渡态中辅酶上的吡啶环呈准船式构象而非平面构象; 反应的转移步骤在结构及电荷特征上与低位垒氢键很相似. 此外, 过渡态中底物与L-乳酸脱氢酶的活性位之间存在着相当强的静电作用, 伴随着过渡态的形成, 底物上羰基的极性逐渐增强, 有利于的转移. 这些计算结果与相关实验结论一致. 计算结果还表明, 过渡态中的“氢负离子”实际上是一个带0.13个单位正电荷的阳离子, 这一结果与文献报道的半经验计算结果一致.

厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

定点饱和突变提高Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶对苯丙酮酸的催化效率

【背景】光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景。本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸,但其活性较低。为提高L-LcLDH催化苯丙酮酸的催化效率,构建了一个单突变体L-LcLDH^(Q88R),其催化效率kcat/Km是L-LcLDH的4.9倍。【目的】为进一步提高L-LcLDH^(Q88R)催化苯丙酮酸的催化效率,采用饱和突变技术将位于L-LcLDH^(Q88R)底物结合口袋附近的氨基酸残基Ile^(229)随机替换为其他氨基酸,以获得活性更高的优良突变体。【方法】以重组表达质粒p ET-22b-LcldhQ88R为模板,采用全质粒PCR技术对L-LcLDH^(Q88R)基因(LcldhQ88R)中编码Ile^(229)的密码子实施饱和突变,构建突变转化子文库。以催化苯丙酮酸的活性为指标,从文库中筛选出优良的突变转化子。【结果】突变转化子(Escherichia coli/Lcldh^(Q88R/I229Q))表达出一种由Arg和Gln分别替换了Gln88和Ile^(229)的双突变体L-LcLDH^(Q88R/I229Q)。重组表达产物L-LcLDH^(Q88R/I229Q)的酶学性质分析表明:L-LcLDH^(Q88R/I229Q)的比活性是L-LcLDH的18.5倍,是L-LcLDH^(Q88R)的2.3倍;其催化效率分别为后两者的6.8倍和1.4倍。L-LcLDH突变前后的温度和pH特性改变不大。根据分子对接结果推测出,双突变Q88R/I229Q导致L-LcLDH的底物结合口袋的入口变大和构型的变化可能对其催化活性的提高发挥了重要作用。【结论】双突变Q88R/I229Q显著提高了L-LcLDH的活性和催化效率,使得L-LcLDH^(Q88R/I229Q)在不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸中成为有潜力的工具酶。

L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325中的表达

本文研究了在m RNA转录水平上三种L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325不同生长阶段的表达情况。以16s r RNA作为内参基因,应用实时荧光定量PCR技术测定不同生长阶段的菌体中L-乳酸脱氢酶基因(ldh、ldh X和ldh B)表达的动态变化规律。该菌株的生长曲线呈S型,培养2~6 h为菌体的生长对数期,随后进入稳定期。生长曲线的测定表明该菌株生长力极其旺盛;16s r RNA、ldh、ldh X和ldh B基因的扩增效率曲线显示,内参基因与目的基因的扩增效率一致且接近100%,这说明利用相对荧光定量法能够较好的反应目的基因的表达量;ldh、ldh X和ldh B基因在菌体生长的3个时间点(6 h、9 h和12 h)都有一定量的表达,随着菌体的不断生长,基因表达的变化均呈现显著性上升趋势,且上升幅度不断增加,在12 h时基因表达量达到最大值。其中ldh基因在的表达量在菌体生长的3个时间点存在显著性差异,而ldh X、ldh B基因的表达量存在极显著差异。

干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质

L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,L-LDH)是发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸的关键酶。以干酪乳杆菌G-02(Lactobacillus casei G-02)基因组DNA为模板,克隆得到L-LDH基因(ldhL),经序列分析后将其连接到表达载体pET-28a(+)上,构建成重组质粒pET-ldhL转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,实现ldhL基因的表达。30°C加入IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白样品通过SDS-PAGE分析,约在40 kD处出现显著的特异性条带。对表达的L-LDH生物学特异性研究显示:重组L-LDH的比酶活为1 722 U/mg,最适反应温度为40°C-45°C;果糖-1,6-二磷酸(FBP)为别构激活剂,使最适pH向中性方向偏移(pH为6.6-6.8),Mn2+可拓宽最适酶活pH范围;Mn2+、Ca2+和Mg2+对L-LDH有激活作用,而Zn2+对L-LDH有抑制作用。

牛链球菌L-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

利用PCR方法从牛链球菌(Streptococcus bovis)基因组DNA中扩增出了L(+)乳酸脱氢酶基因(ldh),并将其连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSEldh,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株JM109。利用SDS-PAGE分析ldh表达产物的分子量为36KD,重组菌株的乳酸脱氢酶酶活力为168.2U/mL,最适反应温度25℃,最适作用pH为5.0,重组质粒的稳定性达99.9%。

β_2微球蛋白与乳酸脱氢酶对非霍奇金淋巴瘤治疗效果的判断价值

目的探讨血清β2微球蛋白(β2-MG)和乳酸脱氢酶(LDH)在判断非霍奇金淋巴瘤(NHL)有无骨髓浸润及治疗效果中的意义。方法回顾性分析106例经病理确诊的NHL初治患者,按骨髓涂片检查结果分为淋巴瘤细胞白血病组27例(淋瘤白组),有骨髓浸润组26例(浸润组),无骨髓浸润组53例(无浸润组)。分别于化疗前后检测血清β2-MG和LDH水平,比较3组间有无差异。结果 3组患者β2-MG水平比较差异有统计学意义(P<0.01),其中浸润组和淋瘤白组β2-MG水平均高于无浸润组(P<0.01);淋瘤白组β2-MG水平高于浸润组(P<0.01)。3组患者LDH水平比较差异有统计学意义(P<0.01),其中浸润组和淋瘤白组LDH水平均高于非浸润组(P<0.01)。3组患者应用化疗药物治疗后β2-MG和LDH水平均有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论β2-MG和LDH可作为NHL患者是否存在骨髓浸润及其治疗效果的临床判断指标。