新城疫病毒La Sota株热损伤靶点的初步分析

为探索新城疫病毒不耐热毒株La Sota热损伤靶点,以期为新型耐热疫苗研发提供理论依据,试验通过检测加热前后La Sota株的吸附及内化功能,考察纤突蛋白HN和F活性变化情况,以及核衣壳完整性,综合分析新城疫病毒热损伤靶点。结果显示:37℃加热24 h后F蛋白活性首先受损,表现为内化功能显著下降(0.01<P<0.05),56℃加热15 min后HN和F蛋白活性几乎丧失,表现为吸附及内化功能均极显著下降(P<0.01);高温加热后,病毒核衣壳完整性显著降低,病毒粒子破损且失去纤突结构,表现为吸附及内化功能极显著下降(P<0.01)。研究表明,La Sota株热损伤靶点与加热温度和时间密切相关:中温下(≤56℃)病毒热损伤靶点主要在HN和F蛋白,高温下(≥80℃)病毒热损伤靶点为纤突蛋白和核衣壳;纤突蛋白的热敏感性高于核衣壳,且F蛋白受损早于HN蛋白。

鸡群加强免疫新城疫活疫苗(CS_(2)株)与灭活苗(La Sota株)的效果对比

为了比较新城疫活疫苗(CS2株)与灭活苗(La Sota株)对鸡群的加强免疫效果,本试验对首次已饮水免疫过新城疫弱毒苗的鸡群,再次用新城疫活疫苗(CS_(2)株)与灭活苗(La Sota株)分别进行加强免疫,采用血凝抑制试验方法检测新城疫免疫抗体,并作对比分析。结果显示:加强免疫使用灭活苗(La Sota株)比用活疫苗(CS_(2)株)的免疫合格率更高,免疫效果更理想。

新城疫活疫苗La Sota株免疫增强了禽网状内皮组织增生病毒对SPF鸡的致病作用

禽网状内皮组织增生病毒(REV)是鸡群中常见的垂直传播性病毒之一,感染后可导致鸡群发生严重的免疫抑制,对于一些未净化REV的鸡群,在免疫新城疫活疫苗后某些鸡会加重发病趋势,怀疑通过鸡胚感染的REV和新城疫活疫苗在体内发挥了协同致病作用,为此本研究开展了模拟实验。从100枚SPF鸡胚中随机选择50枚SPF鸡胚通过卵黄囊接种REV,剩余50枚SPF鸡胚通过卵黄囊接种灭菌PBS。待孵化出雏后鸡胚接毒组和空白鸡胚对照组各取20只SPF鸡于7日龄时免疫新城疫活疫苗(La Sota株),同时鸡胚接毒组和空白鸡胚对照组各取20只SPF鸡于7日龄时接种PBS。结果显示:携带有REV的雏鸡再免疫活疫苗La Sota株后首先出现死亡,其体重明显低于其他组SPF鸡体重,免疫器官损伤程度比REV单独感染组更加严重,且显著高于对照组。本研究结果表明新城疫活疫苗La Sota株免疫后增强了REV对SPF鸡的致病作用,提示我们选择净化种源的重要性。

新城疫弱毒疫苗La Sota株对血清4型禽腺病毒致病作用的影响研究

Ⅰ群血清4型禽腺病毒(FAdV-4)是常见的家禽垂直传播性病毒,感染鸡后可导致心包积液综合征。在生产中,先天感染FAdV-4的雏鸡免疫La Sota疫苗时会明显加重病情,因此我们推测新城疫弱毒疫苗的免疫具有加重或诱发和垂直传播感染的FAdV-4的致病作用。本研究随机选择50枚SPF鸡胚通过卵黄囊接种来模拟FAdV-4先天性感染,同时以接种生理盐水SPF鸡胚作为对照。待孵化出雏后,接毒组和对照组各取20只7日龄SPF鸡免疫新城疫Ⅳ系弱毒疫苗(La Sota株),同时各组其余鸡以相同方式接种等量PBS作为对照。结果显示:FAdV-4感染的雏鸡在免疫La Sota株后更容易发生严重的生长抑制和免疫器官损伤,说明免疫La Sota株能显著增强FAdV-4致病性。本研究结果显示,免疫弱毒疫苗La Sota增强了垂直传播感染的FAdV-4致病性,提示家禽养殖业种源净化的重要性。

NDV La Sota、V4疫苗免疫鸡及免疫攻毒鸡的主要特异性血清抗体动态变化规律比较

本研究应用间接ELISA方法对新城疫LaSota和V4疫苗免疫SPF鸡及免疫后攻毒SPF鸡的血清中新城疫病毒(NDV)特异性HI抗体、IgM和IgG抗体水平的动态变化进行了检测。结果表明 ,V4较LaSota疫苗免疫鸡HI抗体提前 3天左右出现 ,但除高峰期 (1周左右 )外 ,其HI抗体水平均低于LaSota免疫鸡。LaSota疫苗免疫鸡血清中NDV特异性IgM和IgG抗体水平高于V4免疫鸡 ,IgG抗体高峰较V4免疫鸡提前约 2周出现 ,攻毒后 ,LaSota免疫鸡血清中特异性IgG和IgG回忆应答显著 ,而V4免疫鸡IgM和IgG回忆应答不明显。

新鱼腥草素钠对新城疫La Sota疫苗免疫效果的影响

将96只非免疫健康三黄肉雏鸡随机分为4组,分别接种新城疫病毒La Sota株弱毒活疫苗,同时将新鱼腥草素钠按照不同的剂量皮下注射;在第二次免疫后的第7、14、21、28天分别测定各组动物的抗NDV血凝抑制抗体、免疫器官指数以及外周血CD4+/CD8+淋巴细胞比值。结果表明,新鱼腥草素钠对提高鸡体抗NDV血凝抑制抗体效价和外周血CD4+/CD8+淋巴细胞比值具有一定作用,且与对照组差异显著(P<0.05);但不同给药剂量的新鱼腥草素钠影响不同,其中以中等剂量(2mg/kg)效果最为明显。免疫器官指数的测定表明,新鱼腥草素钠对新城疫疫苗免疫效果的影响不是通过促进免疫器官发育实现的。

新城疫病毒La Sota株F蛋白结构与部分功能区的预测

以新城疫病毒(Newcastlediseace virus,NDV)La sota F蛋白的氨基酸序列为基础,采用Chou-Fasman法、Garnier-Robson法、Karplus-Schulz法与Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法分别预测蛋白质的二级结构和B细胞抗原表位。预测结果表明,NDV La Sota F蛋白结构较为复杂,含有较多的α-螺旋、β-折叠区,转角和无规则卷曲等有柔韧性区域。此外,应用Tmap法预测了NDV La sota F蛋白的跨膜区域,通过同源建模的方法预测了该蛋白的三维空间结构,并比较了强弱毒株裂解位点处空间结构的不同。为进一步通过试验方法确定其蛋白的B细胞表位和从结构出发了解其生物学功能,提供了理论依据。

接种La Sota疫苗雏鸡外周器官中CD4^+T细胞的来源及其作用

切除胸腺的２日龄雏鸡，接种抗鸡Ｔ细胞表面分子ＣＤ４的单克隆抗体，于１２日龄时以ＬａＳｏｔａ疫苗免疫。然后，在不同的日龄分别用ＦＡＣＳ、ＭＴＴ及间接ＥＬＩＳＡ测定脾脏和外周血中ＣＤ４＋和ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞亚类数量、脾Ｔ淋巴细胞转化功能及病毒特异的血清ＩｇＧ抗体的动态变化。结果，胸腺切除鸡Ｔ淋巴细胞亚类数量、转化功能及病毒特异的血清ＩｇＧ抗体的动态变化均不同于对照组鸡。提示ＬａＳｏｔａ疫苗免疫鸡外周器官中增加的ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞可能来源于胸腺外途径，并对抗体的产生具有辅助功能。

La Sota与V4疫苗F蛋白的B细胞表位活性检测与比较

根据La Sota和V4疫苗株F蛋白B细胞表位预测的结果,进行了表位区的鉴定和比较。将两疫苗株F基因预测存在差异的表位,根据序列位置邻近合并分成6段表位区,分别对每个毒株的6段表位区进行了亚克隆,并对每个毒株的预测区进行了表达。应用建立的Tricine缓冲体系50 g/L^200 g/L线性梯度聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳对表达情况进行了分析,得到5段多肽的大小分别是P1为8.0 ku,P2为10.8 ku,P4为11.6 ku,P5为13.5 ku,P6为10.5 ku。应用La Sota特异性抗血清,利用Western blot-ting对表达的各肽段进行了抗原性鉴定。结果表明,P1、P4、P5、P6段呈阳性反应,说明其中含有线性B细胞表位。这4段分别位于F蛋白的1 aa^48 aa,201 aa^274 aa,377 aa^458 aa和469 aa^530 aa,以前发现的中和性表位均不在这4段区域内。而P2段在West-ern blotting中无抗体反应性,表明它不含线性表位。比较研究发现NDV La Sota与V4株的P4区的B细胞表位活性存在着重要的差异,这种差异可能造成两个毒株的免疫原性差异。

鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗对新城疫La Sota疫苗免疫效果的影响

用鸡传染性法氏囊病(IBD)免疫复合物疫苗免疫1日龄SPF雏鸡和普通京粉雏鸡,间隔1、2周后免疫新城疫La Sota疫苗,以单独免疫新城疫La Sota疫苗为对照,免疫后2、3、4和5周对各组鸡采血测定新城疫HI效价,并在免疫5周后用新城疫强毒攻击,计算各组保护率。结果显示,1日龄时首免IBD免疫复合物疫苗间隔不同时间再免疫新城疫La Sota疫苗,与单独免疫新城疫La Sota疫苗相比,新城疫HI抗体水平均无显著差异(P>0.05)。证明IBD免疫复合物疫苗在SPF雏鸡和普通雏鸡上对新城疫La Sota疫苗免疫均无免疫抑制作用。

新城疫La Sota疫苗对山东分离株的免疫保护试验

用标准疫苗株LaSota活疫苗在隔离器中接种SPF鸡,进行免疫保护试验。免疫后,每7d采血监测NDV抗体,免疫后2周,利用经过鉴定的新城疫病毒(NDV)潍坊毒SGM01、昌乐毒SCL03、东营毒HY、日照毒SRZ03、莘县毒SSX03和标准强度F48E9分别进行攻毒试验,同时设SPF鸡对照。每天观察,及时剖检发病鸡,检查鸡群病变,确定疫苗的保护性。结果表明,LaSota疫苗能对除SGM01和HY以外的病毒攻击的SPF鸡提供较好的保护。

重组鸡痘病毒表达的鸡IL-1β、IL-2和髓细胞生长因子对新城疫La Sota疫苗免疫效果影响

为研究在新城疫LaSota疫苗免疫不全的情况下,重组鸡痘病毒(rFPV)表达的鸡白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素2(IL-2)和髓细胞生长因子(MGF)是否具有免疫增强作用。10日龄SPF鸡随机分成8组(I～VIII),每组18只,每只接种1个半数保护剂量(PD50)的LaSota疫苗,同时免疫不同剂量的表达鸡IL-1β、IL-2或cMGF的rFPV(rFPV-IL-1β、IL-2、cMGF)。结果:rFPV表达的IL-1β、IL-2或cMGF可以消除鸡痘病毒在免疫早期对雏鸡体重增长的影响;一定剂量的IL-1β和IL-2可使鸡脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的总体水平提高;免疫21d后用新城疫的F48E8强毒经肌肉攻毒,一定剂量的IL-1β和IL-2(I和III组)能提高LaSota疫苗的免疫保护率,而cMGF却没有表现出这种作用。本研究表明rFPV表达的IL-1β和IL-2在一定的剂量下可以增强LaSota疫苗的免疫效果,具有免疫增强作用。

用SOE PCR方法获得新城疫病毒La Sota株全基因组cDNA

为了获得新城疫病毒La Sota株全基因组cDNA。根据SOE PCR方法要求设计引物,对NDV LaSota株进行分段扩增,然后应用SOE PCR方法连接各片段,全基因连接可得到约15000 bp的扩增片段,所得到的产物为NDV La Sota株全基因组cDNA。结果表明:采用SOE PCR方法合成的基因序列经测序及酶切鉴定,与GenBank上登陆的NDV La Sota株全基因组序列基本一致。本研究为构建新城疫LaSota株的感染性cDNA奠定了物质基础;并为进一步研究NDV的生物学特性、结构与功能的关系,探讨影响NDV毒力的因素、及研制新型疫苗载体提供了可靠依据。

鸡新城疫La Sota株、鸡传染性支气管炎W_(93)株二联活疫苗研究 Ⅱ.接毒剂量选择试验

将鸡新城疫LaSota毒种和嗜肾型鸡传染性支气管炎W93毒种分别用生理盐水做适当稀释后,将两种病毒液等量混合,接种于同一SPF鸡胚尿囊腔内。结果表明,IBV、NDV在同一鸡胚内增殖时无互相干扰现象;收获的鸡胚液(LaSota+W93)中NDV、IBV的效价分别达到相应单苗水平。

新城疫病毒La Sota C5株感染性克隆的构建及病毒拯救

将本实验室保存的一株La Sota病毒用有限稀释法接种鸡胚进行纯化,连续传代5次后筛选到1株高血凝效价的纯培养克隆株,命名为La Sota C5,并对其进行全基因组测序,克隆株与亲本株在生物学特性与基因序列上都存在一定的差异。参照La Sota C5株全基因序列单酶切位点,用RT-PCR的方法将基因组分8段扩增,按照病毒基因组的结构顺序,将克隆片段定向插入到TVT转录载体中,成功构建含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-La Sota C5。将TVT-La Sota C5与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有感染性的La Sota株新城疫病毒。病毒的成功拯救为后续基因功能和疫苗载体开发等方面的研究提供了平台。

法氏囊活性肽对新城疫La Sota株弱毒疫苗的免疫增强效果

将7日龄黄羽肉鸡300只均分为对照、常规疫苗剂量配合法氏囊活性肽、常规疫苗剂量减半配合法氏囊活性肽、生理盐水和法氏囊活性肽5组,通过血凝抑制试验测定血清抗体水平和间接ELISA检测鼻腔冲洗液中IgA水平及计算法氏囊指数等试验方法,研究法氏囊活性肽和新城疫La Sota弱毒疫苗配合应用的免疫效果。结果显示,29日龄后,常规免疫剂量配合法氏囊活性肽组的法氏囊指数、血清抗体滴度和IgA水平显著高于对照组(P<0.05),而常规剂量减半配合法氏囊活性肽组与对照组在法氏囊指数、血清抗体滴度和IgA水平上差异不显著(P>0.05);说明法氏囊活性肽对疫苗有免疫增强作用,疫苗剂量减半配合法氏囊活性肽应用可达到常规疫苗免疫效果。

鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)的灭活试验

为了研究鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)中两种病毒的最佳甲醛灭活浓度和灭活时间,试验选取四种甲醛最终浓度0.1%、0.2%、0.4%、0.8%,分别对两种抗原进行灭活,在灭活10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、24 h、30 h、36h、42 h分别取样,对每个样品进行灭活检验和血凝价测定。从试验结果得出,新城疫病毒(La Sota株)最适合的甲醛浓度为0.1%,灭活时间为16 h;禽流感病毒(H9亚型HP株)最适合甲醛浓度为0.1%,灭活时间为18 h。

抗生素和保存条件对新城疫La Sota抗原液效价的影响

利用同一批次的新城疫La Sota抗原液分别加入2种抗生素和两种用量,作用一定时间后每隔1周测定其效价(HA和EID50);同时,将这一批次抗原液分别放置在风冷冷库中和普通冷冻冰柜中保存;另外,将这一批抗原液不加任何抗生素条件下放置在风冷冷库中每隔1周测定其效价(HA和EID50)。结果表明:无论是抗生素的种类、用量还是冷冻保存的条件都会对其效价产生一定程度的影响。

猪脾转移因子对La Sota株鸡新城疫弱毒疫苗的免疫增强作用

【目的】本文旨在研究猪脾转移因子(TF)对新城疫(ND)病毒弱毒疫苗La Sota株的免疫增强作用及机理,为兽医临床防控提供理论依据。【方法】以4种不同剂量La Sota疫苗株分别单独、与TF联合免疫SPF鸡,14 d后以ND病毒(NDV)参考强毒F_(48)E_(9)株(10^(4.7) ELD_(50))进行攻毒,采用蛋白质芯片技术测定鸡外周血IL-6、IL-10、IL-16和IL-21浓度,并以血凝抑制(HI)试验和荧光定量RT-PCR方法分别检测鸡ND HI抗体效价和F_(48)E_(9)株的病毒血症水平。【结果】攻毒保护试验表明,单独免疫10^(5.17)、10^(4.17)、10^(3.17)和10^(2.17) EID_(50)剂量时疫苗攻毒保护率分别为100%、55%、0%和0%,半数保护量(PD_(50))为12023 EID_(50);对应剂量联合免疫时疫苗攻毒保护率分别为100%、75%、0%和0%,PD_(50)为6918 EID_(50);对照组(非免疫有攻毒)和空白组(非免疫非攻毒)死亡率分别为100%和0%。对10^(4.17) EID_(50)免疫剂量进一步检测分析表明,免疫后,联合免疫鸡IL-6、IL-10、IL-21和ND HI抗体效价(log_(2)x)比单独免疫最多时分别提高了254.95 pg/mL、62.10 pg/mL、1.51 pg/mL和2.6,其中ND HI抗体效价差异极显著(P<0.01);攻毒后,联合免疫鸡IL-10、IL-16、IL-21和病毒血症阳性率比单独免疫最多时分别降低了428.61 pg/mL、167.81 pg/mL、1.48 pg/mL和20%,其中IL-16、IL-21差异极显著(P<0.01)。【结论】本文结果显示,TF可提高La Sota株弱毒疫苗的免疫保护率及免疫后IL-6、IL-10、IL-21介导的免疫应答、ND HI抗体效价,降低疫苗PD_(50)及攻毒后IL-16、IL-21介导的炎症反应、IL-10介导的免疫应答抑制作用、病毒血症。本文明确了TF对La Sota株弱毒疫苗具有较好的免疫增强作用,为疫苗免疫佐剂研发和ND防控提供参考。

新城疫CHR株与La Sota株2种疫苗近期免疫效力比较试验

鸡新城疫CHR 株冻干疫苗中试产品3 批以及La Sota 株冻干疫苗( 符合质量要求) , 以5 种免疫途径: 肌注、滴鼻、喷雾、饮水、拌料分别接种11 日龄雏鸡。每批疫苗每种途径接种1 组, 20 只/ 组, 共20 组。雏鸡群免疫前血凝抑制抗体(HI) 效价为1∶2-13 , 于14 d 、28 d 后再测HI抗体水平, 并分别用10 000 鸡胚半数致死量(ELD50) 新城疫标准强毒北京株攻击。从而检测2 种疫苗用5 种免疫途径免疫后在不同时间的近期免疫效力。结果表明, 近期内CHR 株疫苗HI抗体呈上升趋势, 而La Sota 株疫苗HI抗体先升高后下降; CHR 株疫苗以饮水和拌料途径效果较好, 其它3 种途径效果相似。接种后14 d 攻毒, 2 种疫苗均能较好保护强毒攻击; 28 d 后, CHR 株保护率高于La Sota 株。