禽流感病毒M基因的重组慢病毒构建

旨在建立针对禽流感病毒(AIV)的实验室快速分子检测方法。构建重组慢病毒作为分子检测方法中的阳性对照品,采用PCR扩增技术获得AIV M基因的保守区片段,并构建pLVX-M-IRES-ZsGreen1重组慢病毒穿梭载体;将鉴定成功的重组穿梭质粒与骨架质粒pMD2.G和psPAX2共转染293T细胞,获得携带AIV M基因保守区的重组慢病毒;将重组慢病毒感染293T细胞,观察其荧光表达情况,收集、浓缩病毒液并测定其滴度;用AIV实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法检测M基因。结果表明:携带AIV M基因的重组慢病毒成功拯救,且其病毒滴度高、安全性强,可作为分子检测方法的阳性对照标准品。综上,本研究成功构建了AIV M基因的重组慢病毒,可高效包装出含有M基因保守区的慢病毒颗粒,为后续AIV分子检测试剂盒的研制提供参考。

叶酸受体1在肺腺癌组织中的表达及其与T790M基因突变的相关性研究

目的探讨叶酸受体1(FOLR1)在肺腺癌组织中的表达以及T790M基因突变后FOLR1蛋白在癌组织中的表达变化。方法收集2017年1月至2022年12月在河南省人民医院接受治疗的94例肺腺癌患者的临床资料。根据T790M基因突变情况分为突变组44例和未突变组50例。采用免疫组织化学法检测94例肺腺癌组织中FOLR1的蛋白水平,分析腺癌组织中FOLR1蛋白表达与T790M基因突变的相关性。分析不同临床病理特征与FOLR1蛋白表达的关系。结果比较T790M基因突变和未突变肺腺癌组织中FOLR1蛋白的表达率差异有统计学意义(P=0.047)。结论FOLR1蛋白的表达与T790M耐药基因的突变之间有相关性,且FOLR1将是肺腺癌T790M耐药基因的诊断和治疗的潜在靶点。

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的截短表达及胶体金免疫层析法的建立

为建立一种快速、便捷的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的胶体金免疫层析方法,本试验通过原核表达截短的M基因作为检测线,葡萄球菌A蛋白(SPA)和鸡抗SPA作为金标抗原和质控线。结果显示,该试纸条与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒2型(PCV2),均不存在交叉反应,特异性强;最低检测限度为1∶6400,灵敏性高;批间、批内无差异性;4℃可保存30 d,稳定性好;临床样品检测结果与爱德士试剂盒符合率达到94.82%。综上所述,本试验建立了一种敏感性高、特异性好的PRRSV抗体检测的免疫层析试纸条,为PRRSV的监测、预防及诊断提供了技术支持。

8株禽源H_(9)N_(2)亚型禽流感病毒分离鉴定及M基因的序列分析

试验旨在了解中国目前H_(9)N_(2)亚型禽流感病毒(AIV) M基因的遗传变异情况,对2019—2022年分离到的8株H_(9)N_(2)亚型AIV M基因进行测序,并对核苷酸序列、氨基酸序列一致性和分子遗传进化进行分析。结果显示:8株分离株与参考株序列一致性均在88.4%以上,8株分离株M之间的核苷酸一致性为88.0%~99.7%;XD1~XD7属于G1-like分支,XD8属于BJ94-like分支。与经典株相比,分离株产生多个增加病毒感染性的突变。XD1~XD7含有对金刚烷胺类药物抗性的31N突变,而XD8则对金刚烷胺类药物敏感。研究表明,试验结果可为AIV的M蛋白相关生物学机制提供一定参考。

猪传染性胃肠炎病毒M、sM基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装

利用RT-PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）M和sM结构蛋白基因，将其分别克隆人载体pFastBac^TM Dual，获得转移质粒pFastBac^TM Dual-M和pFastBac^TM Dual-M-sM，将重组质粒转化至DHl0Bac感受态细胞，经抗性与蓝白斑筛选，获得杆状病毒重组质粒Bacmid-M和Bacmid-M-sM，在Cellfection作用下，将杆状病毒重组质粒转染昆虫细胞sf9，获得重组杆状病毒rBac-M和rBac-M-sM。通过WesternBlot、间接免疫荧光试验（IFA）进行检测，结果显示：重组蛋白在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达。将重组杆状病毒rBac-M和rBae-M-sM分别感染sf9昆虫细胞，进行TGEV病毒样颗粒（VLPs）的体外组装试验。结果表明，M蛋白在sf9细胞内单独表达，M蛋白和sM在sf9细胞内共同表达，都可形成TGEV病毒样颗粒，而且病毒粒子大小不等，直径在61～101nm。试验结果为进一步研究TGEV结构蛋白在病毒装配过程中的作用提供了理论依据。

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株M基因的分子特征

本实验根据已经发表的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)M蛋白基因序列设计并合成一对引物 ,利用RT_PCR扩增得到了IBV新疆分离株LX4株 (HA价为 2 7)M基因 678bp的片段 ,将该片段克隆到PUC18载体上 ,通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒。采用Sanger’s双脱氧末端终止法对插入片段进行核苷酸序列测定 ,获得了IBV_LX4株M基因的核苷酸序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将它与GENBANK中发表的 15株国外参考毒株相比较 ,发现核苷酸的同源性 (除D14 66和DE0 72外 )为 85 % ～92 % ,氨基酸的同源性为 83 % ～92 % ,与国内参考株 (H5 2_GD)相比分别为 90 %和 92 % ,确证我们得到的克隆片段为IBV -LX4株的M基因。且含有两个糖基化位点 ,9个高度保守的半胱氨酸 ,三个跨膜区域 。

猪流行性腹泻病毒中国地方流行株LJB/03M基因的克隆与序列分析

从黑龙江某猪场疑似猪流行性腹泻猪的粪便中提取总RNA,采用RT-RCR方法扩增,首次获得中国地方流行株PEDVM全基因序列,将其克隆到pMD18-T载体中进行测序,克隆的M基因核苷酸序列由681个核苷酸组成,含有一个完整的开放阅读框架,编码226个氨基酸。与国外已发表的其他毒株进行基因进化分析,GenBank中的6株PEDV形成的基因进化树具有3个分支。其中分离株LJB/03形成一个独立的分支,说明LJB/03的M基因序列与其他毒株相比,发生了一定的变异。

二株广西猪繁殖与呼吸综合征流行毒M基因的克隆和序列分析

广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)所致。利用针对PRRSV的N基因的特异性引物P1和P2,通过RT＿PCR技术对分别从广西贵港市(GXGG)和南宁市(GXNN)收集到的可疑病料进行检测,结果两份为阳性。合成针对M基因的引物M1和M2,分别扩增了GXGG和GXNN两株PRRSV的M基因,并进行克隆和测序,得到长582个核苷酸的目的基因片段。应用DNAStar序列分析软件对所测的两个广西毒株与国内外已发表的ATCCVR＿2332、LV和CH＿la毒株进行同源性比较。分析表明,GXGG与ATCCVR＿2332、LV、CH＿la的核苷酸同源性分别为95 6%、69 5%、97 7%;GXNN与ATCCVR＿2332、LV、CH＿la的核酸同源性分别为94 9%、69 5%、97 3%。对推定的氨基酸序列进行了比较,GXGG与ATCCVR＿2332、LV、CH＿la的氨基酸同源性分别为97 7%、80 5%、97 7%;GXNN与ATCCVR＿2332、LV、CH＿la的氨基酸同源性分别为98 3%、79 9%、97 1%。说明广西流行毒株与ATCCVR＿2332和CH＿la的同源性很高,而与LV毒株的同源性很低。从本研究构建的系统发育树分析,广西流行的PRRSV与ATCCVR＿2332株的亲缘关系比较密切。

2011年-2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV M基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的M基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV M基因序列与51个参考毒株M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV M基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S（GenBank登录号：JN547228）、疫苗株CV777（GenBank登录号：AF353511）和Attenuated DR13（GenBank登录号：JQ023162）的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。

人β_2m基因的克隆及表达

目的 克隆和表达HLA I类分子轻链(β2m)基因,为人工制备HLA I类分子提供基础。方法 利用逆转录PCR技术从Jeg-3细胞株中克隆β2m基因,与质粒pET22b(+)重组,构建原核表达载体pET22b(+)-β2m,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),诱导β2m基因高效表达,并采用双抗体夹心ELISA法对表达产物进行抗原性和功能鉴定。结果 酶切和测序证实β2m基因克隆和载体构建成功,目的蛋白在宿主菌中高效表达于包涵体中;通过包涵体的分离和纯化获得初步纯化的β2m,所制备的β2m能够与特异性抗体结合,并能与HLA I类分子重链形成具有天然构象的HLA I类分子。结论 人β2m基因能够在原核宿主中高效表达,表达产物具有形成HLA I类分子的功能。

T790M基因突变阳性的肺腺癌并骨转移患者个体化治疗远期疗效及预后的相关因素分析

目的:探讨T790M突变的肺腺癌骨转移患者接受个体化综合治疗的疗效及预后的相关因素。方法:回顾性分析68例经个体化综合治疗的T790M突变的肺腺癌骨转移患者的临床资料,采取化疗、放疗、靶向分子药物、单抗类药物、双磷酸盐等综合治疗,观察疗效及预后,分析相关因素。结果:个体化综合治疗有效率为60.3%(41/68),中位生存期为23个月。无放疗、T790M耐药基因突变无合并KRAS耐药基因突变、既往化疗类型为辅助化疗、N1期、孤立的骨转移灶、化疗交替奥希替尼治疗、转移器官个数少、以及ECOG评分<2分对远期疗效有显著影响(P<0.05)。多因素分析显示,T790M耐药基因突变无合并KRAS耐药基因突变(P=0.012)、转移器官个数0或1个(P=0.000)、化疗有无交替奥希替尼(P=0.020)及孤立的骨转移灶为影响T790M突变的肺腺癌骨转移患者联合治疗后远期疗效的保护因素。结论:T790M耐药基因突变无合并KRAS耐药基因突变肺癌患者经化疗、靶向分子药物等综合治疗获得了较长的生存时间,化疗联合靶向分子药物、双磷酸盐类药物等综合治疗为T790M突变的肺腺癌骨转移患者提供了有潜力的治疗模式。

猪流行性腹泻病毒PCR检测及其M基因的遗传变异分析

为了解我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行情况,利用套式反转录-聚合酶链反应(nRT-PCR)技术,从表现腹泻症状的仔猪粪便中扩增出6份阳性样品,测序表明,一扩PCR产物的大小为854bp,涵盖PEDV的M基因。选择34个参考毒株基于M基因进行进化树分析,结果显示PEDV可以分为G1和G2两个基因型7个基因亚型。G1型以2007年前的经典毒株为主,包括CV777、Br1/87、KPEDV-9、JMe2和CH/S株等;G2型则以近年分离的毒株为主,包括GDXS5、JS-2004-2、PFF188、KU06RB08等。其中G2.3亚型已经成为目前世界上主要的PEDV流行毒株,包括本次检测的6株PEDV、泰国的KU06RB08及GenBank中我国和韩国2011年的流行毒株。通过同源性比较发现,这6株PEDV之间的同源性为98.2%～100%,与经典毒株CV777的同源性为97.6%～98.2%。结果表明,尽管PEDV之间的同源性仍较高,但PEDV流行毒株已经逐渐形成独特的流行进化分支。

猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了解福建省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株ORF3和M基因变异情况,本研究从4个不同规模猪场发生仔猪"顽固性腹泻"疾病的病料中扩增到4株PEDV的ORF3和M基因,并进行了序列分析。结果表明:4株PEDV ORF3基因均含有675个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为89.7%～100.0%,氨基酸的同源性为94.7%～99.6%,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与CV777 truncated毒株最低,仅为89.7%,FJNP毒株核苷酸的同源性与中国北方流行的CH ZKFG 11毒株最高,达100.0%。M基因含有681个碱基,编码226个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为94.8%～100.0%,氨基酸的同源性为94.8%～99.6%,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与日本D89752毒株最低,仅为94.8%,FJNP毒株核苷酸的同源性与韩国CPF193、泰国毒株最高,达100.0%。4株PEDV毒株均与国内外流行强毒株的亲缘关系较近,与attenuate DR13弱毒株的亲缘关系较远。

IBV M基因与IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)的M基因和禽白介素18(IL-18)基因分别插入双顺反子质粒pIRES-EGFP/DsRed中,构建IBV M和IL-18基因的共表达质粒pIRES-M/IL18及表达M基因的pIRES-M质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,28日龄加强免疫1次;免疫前后均采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量;二免后2周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果显示,pIRES-M/IL18、pIRES-M质粒均在Vero细胞中有效地转录并表达目的蛋白。从免疫后7 d起,pIRES-M/IL18免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量均高于pIRES-M组。pIRES-M/IL18、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为65%和40%。以上结果表明,禽源IL-18基因与IBV M基因共表达可增强鸡体对DNA疫苗的免疫应答,提高对IBV强毒的抵抗力。

H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆及序列分析

从鸡胚尿囊液中提取H9N2亚型禽流感病毒的 RNA,根据已发表的 A型流感病毒(AIV)的核苷酸序列 ,设计一对特异引物 ,采用反转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR)成功地扩增了AIV的M基因.将M基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明所扩增的1 192 nt片段包含了完整的M基因的两个开放阅读框.核苷酸序列比较分析结果表明:该毒株与A/Hong Kong/1073/99(H9N2)、A/Duck/Hong Kong/380.5/2001(H5N1)、A/Duck/NY/191255-79/02(H5N2)相比 ,核苷酸序列的同源性在92.2 %～96.1 %之间,其相对应的氨基酸序列的同源性在91.7 %～96.3 %之间.

贵州省猪流行性腹泻病毒ORF3、M基因克隆及序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）毒株ORF3及M基因的遗传变异情况,试验于2014年4月-2015年3月从贵州省5个地区采集105份腹泻仔猪的粪便,应用RT-PCR方法进行PEDV检测,从中选择8份PEDV阳性样本,扩增其ORF3及M基因,测序并进行序列比对分析。结果显示,从采集的105份粪便样本中可检出75份PEDV阳性样本,阳性率为71.43%;8株PEDV贵州株ORF3及M基因序列均无碱基缺失或插入;ORF3基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在95.1%-100.0%与95.1%-99.6%之间,M基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.4%-100.0%与98.7%-100.0%之间;氨基酸系统进化树分析结果显示,2014-2015年贵州流行株与近年来中国毒株、韩国毒株及泰国毒株亲缘关系较近,与疫苗株Attenuated DR13及CV777株亲缘关系较远。提示目前贵州省仔猪腹泻病原主要是PEDV,且为PEDV强毒株。

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果。该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法。

江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析

目的对2011年江西省采集的鼠肺标本进行汉坦病毒的分离鉴定,了解分离病毒株的基因特征。方法采用Vero-E6细胞对阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对毒株进行鉴定。扩增分离株的S、M片段基因进行克隆测序。运用DNAstar软件包和MEGA3.1软件对序列进行分析。结果从15份标本分离到2株来自褐家鼠的汉城型汉坦病毒。对其中1株病毒的S、M片段进行了克隆和序列测定,其中S片段含1 772个核苷酸,编码429个氨基酸;M片段含3 651个核苷酸,编码1 133个氨基酸。经核苷酸和氨基酸同源性分析,新分离株与国内外汉城型病毒核苷酸同源性94.8%~98.0%,氨基酸同源性98.2%~99.6%。与汉城型标准株80-39株相比,S片段仅1个氨基酸位点发生变异;M片段有9个氨基酸位点发生变异,糖基化位点的数目和位置没有发生变化。结论从江西省褐家鼠分离到两株汉城型病毒,病毒基因变异较小,型别相对稳定。

广东人禽流感H5N1毒株M基因特性、进化和变异

通过对人禽流感H5N1毒株M基因序列的变异分析，揭示毒株M基因特征与进化。检测广东地区人禽流感H5N1毒株M基因核苷酸序列，同时检索全球人禽流感H5N1毒株M基因序列，采用DNAStar5．0软件对检索的人禽流感H5N1毒株M基因核苷酸序列进行比对和分析；并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析。结果发现，1997-2006年53株毒株M1基因和51株毒株M2核苷酸序列同源性均分成两组，1997年毒株为第一组（GⅠ），2003-2006年香港、越南、泰国、印尼、中国大陆、土耳其、伊拉克、阿塞拜疆、埃及毒株为第二组（GⅡ）。M1基因20个氨基酸位点置换，占7．94％（20／252），其中2003-2006年毒株M1基因有9个氨基酸位点不同于1997年毒株；M2基因22个氨基酸置换，占22．7％，其中2003-2006年毒株M2基因有4个氨基酸不同于1997年毒株。M2基因Ks值为26．8×10^-6～42．6×10^-6Nt／d，Ka值为4．39×10^-6～6．98×10^-6Nt／d；而M1基因的同义突变速度均远高于错义突变速度，显示M1基因受到机体免疫压力较小；检验发现M1基因进化存在负选择性压力。2003-2006年毒株M1基因通过氨基酸S224N置换，增加一个糖基化位点NSS224-226；而来自印尼的8株毒株M2基因发生C50F置换，引起蛋白二级结构改变。1997年中国香港人禽流感毒株自当时出现后，便未在以后人禽流感疫情中出现。2003-2006年毒株M1基因增加糖基化位点NSS224-226，可能与毒株致病性有关。人禽流感H5N1毒株M基因在自然界变异频繁，可能影响H5N1毒株的人-人传播能力。

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。