志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。

弗氏志贺菌M90T株毒力相关膜蛋白复合物组成基因缺失突变体的构建

目的:构建弗氏志贺菌M90T株毒力相关膜蛋白复合物组成蛋白基因的缺失突变株。方法:分别扩增目的基因的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因片段,利用重叠延伸PCR技术将这3个片段融合为打靶片段,电击转化M90T/pKD46感受态细胞,在λRed重组系统的作用下,通过同源重组将目的基因置换为卡那霉素抗性基因,之后在辅助质粒pCP20的作用下切除FRT位点之间的卡那霉素抗性基因,得到基因缺失突变体。结果与结论:分别构建了M90T株毒力相关膜蛋白复合物4个组成蛋白Apy、DnaK、ClpB、YdgA的基因缺失突变体,为进一步研究各基因的功能提供了突变体。

志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:克隆编码志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的基因phoN2并实现表达,纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠抗Apyrase的多克隆抗体,并对多克隆抗体进行评价。方法:通过PCR扩增的志贺菌5a M90T中的基因phoN2克隆至表达载体pET24a中,将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达并纯化Apyrase-HIS融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多抗。Western blot、ELISA、免疫荧光鉴定获得的抗血清。结果:成功构建了原核表达载体pET24a-Apyrase,经诱导表达出相对分子量为28 kD的融合蛋白,用纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备的多克隆抗体,通过Western blot、ELISA、免疫荧光法证明多克隆抗体制备成功。结论:成功制备了志贺菌福氏5a特异性的鼠多克隆抗体,为进一步研究Apyrase蛋白在志贺菌福氏5a M90T中的表达、定位及志贺菌福氏5a M90T的快速检测奠定了基础。