肉苁蓉苷A通过JNK/MAPK通路抑制破骨细胞活性

背景:研究证实肉苁蓉苷A具有抗炎、抗氧化和抗骨质疏松的作用,但其对破骨细胞分化和功能的影响及潜在的机制尚缺少研究。目的:探讨肉苁蓉苷A对核因子κB受体活化因子配体诱导的体外破骨细胞分化和骨吸收功能的影响及作用机制。方法:提取与培养4-6周龄C57BL/6小鼠股骨和胫骨中的骨髓巨噬细胞,采用CCK-8毒性实验检验不同浓度的肉苁蓉苷A(5,10,20,40,80,160μmol/L)对骨髓巨噬细胞的毒性,抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察不同浓度的肉苁蓉苷A干预破骨细胞的分化情况,确定药物的有效干预浓度。将实验分为阳性对照组、肉苁蓉苷A低、中、高剂量组(40,80,160μmol/L),细胞贴壁后各组均加入50 ng/mL的核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞分化,肉苁蓉苷A低、中、高剂量组分别加入相应剂量的肉苁蓉苷A进行干预。采用肌动蛋白环鬼笔环肽染色和DAPI染色检测肉苁蓉苷A对破骨细胞形成的影响;骨磨片甲苯胺蓝染色观察肉苁蓉苷A对破骨细胞骨吸收功能的影响;Western blot检测JNK/MAPK通路上下游蛋白的表达情况;RT-qPCR检测抗酒石酸酸性磷酸酶、DC-STAMP、Nfatc-1、Ctsk和c-Fos等破骨细胞分化和骨吸收功能相关基因的表达情况。结果与结论:①抗酒石酸酸性磷酸酶染色、肌动蛋白环染色和骨陷窝甲苯胺蓝染色结果表明,与阳性对照组相比,肉苁蓉苷A对核因子κB受体活化因子配体诱导的体外破骨细胞的分化和骨吸收功能具有呈剂量依赖性的显著抑制作用;②RT-qPCR结果表明,与阳性对照组相比,肉苁蓉苷A高剂量组和低剂量组的抗酒石酸酸性磷酸酶、DC-STAMP、Nfatc-1、Ctsk和c-Fos等的mRNA表达量均显著降低,且肉苁蓉苷A高剂量组的降低效果更加显著;③Western blot结果显示,高剂量肉苁蓉苷A干预10,20,30和60 min时显著抑制p-JNK蛋白的表达;与阳性对照组相比,肉苁蓉苷A低、中、高剂量组显著抑制Nfatc1和c-Fos蛋白的表达,且呈剂量依赖性;④结果说明,肉苁蓉苷A能够通过降低p-JNK蛋白水平,抑制MAPK通路的激活和破骨细胞关键基因的表达,进而抑制破骨细胞的形成和骨吸收功能。

长链非编码RNA通过p38MAPK信号通路直接或间接影响骨质疏松症

背景:近年来大量的研究发现长链非编码RNA参与骨质疏松症的发生和发展。p38MAPK信号通路参与骨髓间充质干细胞、成骨细胞以及破骨细胞的分化等过程而参与骨质疏松症的发展,而长链非编码RNA可通过影响p38MAPK信号通路,直接或间接参与骨质疏松症的发生及发展过程。目的:综述长链非编码RNA通过p38MAPK信号通路,直接或间接影响骨质疏松症的进展,为长链非编码RNA在骨质疏松症中预防和治疗提供一个新思路。方法:检索PubMed、中国知网和万方数据库的相关文献,以“长链非编码RNA,骨质疏松,间充质干细胞,成骨细胞,破骨细胞,p38信号通路”为中文检索词,以“long non-coding RNA,osteoporosis,mesenchymal stem cells,osteoblasts,osteoclast,p38 signaling pathway”为英文检索词,排除陈旧、重复以及可信度低的观点,将检索到的文献进行归纳、总结和分析,选取76篇具有代表性的文章。结果与结论:(1)长链非编码RNA通过多种途径参与骨质疏松症的防治,包括促进骨髓间充质干细胞的成骨分化、促进成骨细胞分化和成骨细胞分泌活性、抑制破骨细胞增殖和对骨的吸收作用,以及调节成骨相关细胞通路的激活或抑制,激活p38MAPK信号通路延缓骨质疏松症进展,抑制该信号通路抑制破骨细胞的吸收作用,从而影响骨质疏松的发生和发展。(2)相应长链非编码RNA的过表达或低表达会通过p38MAPK信号通路来影响成骨细胞和破骨细胞的增殖或分化,调节骨重塑过程,进而影响骨质疏松症的发生和发展。大量的基础研究结果显示,长链非编码RNA和p38MAPK信号通路或许可以成为骨质疏松症治疗中的潜在应用和临床转化价值;且相应的长链非编码RNA过表达或低表达慢病毒、转染质粒,相应的p38MAPK信号通路抑制剂等在体外细胞实验及动物模型中都被证实有靶向调控作用。(3)因此,通过靶向调控长链非编码RNA和p38MAPK信号通路来调节骨髓间充质干细胞的分化和功能,或通过长链非编码RNA和p38MAPK信号通路来抑制破骨细胞的增殖分化,或许能提供一种创新的治疗策略,可以延缓骨质疏松症的进展。

叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

六味地黄汤对阿霉素肾病小鼠尿蛋白及肾小球p-p38 MAPK、α-actinin-4、synaptopodin的影响

目的探讨六味地黄汤对阿霉素肾病(adriamycin nephropaghy,ADRN)小鼠尿蛋白的干预作用及可能机制。方法30只SPF级雄性C57BL/6小鼠随机选取5只为空白组,余下小鼠以单次尾静脉注射阿霉素(0.01 g·kg^(-1))复制ADRN模型,2周后将造模成功的小鼠随机分为模型组、贝那普利组及低、中、高剂量六味地黄汤组,每组5只。空白组、模型组予等体积注射用水灌胃,贝那普利组予0.0013 g·kg^(-1)贝那普利灌胃,低、中、高剂量六味地黄汤组分别予9.75、19.5、39 g·kg^(-1)六味地黄汤灌胃,每日1次,连续8周。自动生化仪检测小鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清肌酐、血清钾;HE染色法、电镜观察小鼠肾脏病理改变及足突形态;免疫组织化学法、Western bolt检测小鼠肾脏磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)、α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)、突触孔蛋白(synaptopodin)的表达;RT-PCR检测小鼠肾脏α-actinin-4、synaptopodin mRNA表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、24 h尿量、血清白蛋白降低,24 h尿蛋白定量升高(P<0.05);肾小球系膜细胞增生,部分系膜区扩大、肾小管蛋白管型,间质可见炎性细胞浸润,足突广泛融合;α-actinin-4蛋白及mRNA、p-p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.05),synaptopodin蛋白及mRNA表达降低(P<0.05)。与模型组比较,各干预组病理改变及足突融合均得到不同程度改善,贝那普利组及中、高剂量六味地黄汤组24 h尿蛋白定量减少,高剂量六味地黄汤组p-p38 MAPK蛋白表达降低(P<0.05),低、中、高剂量六味地黄汤组synaptopodin蛋白及mRNA表达均升高(P<0.05)。贝那普利组及低、中、高剂量六味地黄汤组组间比较,各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论六味地黄汤可能通过抑制p38 MAPK通路活化和上调α-actinin-4、synaptopodin蛋白及mRNA表达,改善肾脏病理及足突融合,减轻足细胞损伤,减少ADRN小鼠尿蛋白。

槲皮素调控MAPK通路对绝经后骨质疏松大鼠骨形成的影响

目的探讨槲皮素调节MAPK信号通路对绝经后骨质疏松大鼠模型骨形成的影响。方法将SPF级SD雌性大鼠分为假手术组、模型组、槲皮素低、高剂量组及补佳乐组。通过ELISA法检测大鼠血清雌激素E2水平、骨代谢标志物CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平、炎性指标IL-6、TNF-α、IL-1β水平;HE染色观察大鼠骨组织形态学变化;TRAP染色观察N.Oc/BS;显微CT扫描大鼠股骨形态,测定大鼠股骨BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp;WB检测MAPK信号通路相关蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠血清E2、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平降低,IL-6、TNF-α、IL-1β水平增加,N.Oc/BS增加,BMD、Tb.N、Tb.Th降低,Tb.Sp增大(P<0.05);与模型组相比,槲皮素低、高剂量组及补佳乐组大鼠血清E2、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平增加,IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低,N.Oc/BS降低,BMD、Tb.N、Tb.Th增高,Tb.Sp减小(P<0.05)。假手术组骨组织形态结构正常;模型组骨皮质厚度变薄,骨小梁数量减少且断裂,排列稀疏;槲皮素低、高剂量组及补佳乐组出现新生骨小梁,数量增加,骨组织形态、结构相对完整、清晰。与假手术组相比,模型组MAPK信号通路相关蛋白水平增加(P<0.05);与模型组相比,槲皮素低、高剂量组及补佳乐组MAPK信号通路相关蛋白水平降低(P<0.05)。结论槲皮素能够调节绝经后骨质疏松大鼠雌激素水平,改善骨代谢异常,缓解骨微结构变化,对骨质疏松具有保护作用。可能是通过抑制MAPK信号通路相关蛋白表达、减少破骨细胞形成、减少骨吸收来实现的。

吡拉西坦通过MAPK通路治疗大鼠脊髓损伤的疗效观察与机制研究

目的:探讨吡拉西坦通过丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路治疗脊髓损伤大鼠的作用机制。方法:将54只体重为80~100 g的6周龄SD雌性健康大鼠采用随机数字表法分为假手术组、脊髓损伤组、吡拉西坦组,每组18只。脊髓损伤组、吡拉西坦组使用打击器建立脊髓损伤模型,假手术组不损伤脊髓。吡拉西坦组按照5 ml·kg-1标准予尾静脉注射吡拉西坦,连续干预3 d,每日1次;其他2组注射等剂量、等次数、等时长的生理盐水。分别于术后1、3、7 d处死大鼠并取材,观察并比较大鼠脊髓损伤行为学评分(Basso,Beattie and Bresnahan locomotor rating scale,BBB)的变化,使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测脊髓炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平变化,HE染色观察脊髓损伤大鼠的形态学变化,免疫组化观察水通道蛋白-4(aquaporin 4,AQP4)表达水平,蛋白质免疫印迹法(western blotting,WB)观察脊髓损伤后MAPK信号通路在大鼠脊髓中的激活状态。结果:假手术组1、3、7 d的BBB评分均为21分;脊髓损伤组分别为(1±1)、(4±1)、(7±2)分;吡拉西坦组分别为(1±1)、(5±1)、(9±2)分;脊髓损伤组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05);吡拉西坦组与脊髓损伤比较,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,假手术组形态未见异常。脊髓损伤组在术后1 d时,脊髓组织出现出血、变性;术后3 d,脊髓组织内出现片状坏死区;术后7 d,脊髓组织开始缓慢修复。吡拉西坦组术后1 d,脊髓损伤出血面积较脊髓损伤组减小;术后3 d,坏死区域较脊髓损伤组减少,细胞核消失范围较脊髓损伤组缩小;术后7 d,脊髓开始缓慢恢复。假手术组大鼠造模后1、3、7 d脊髓组织中AQP4染色较淡;脊髓损伤组AQP4染色加深,面积增大;吡拉西坦组AQP4染色较脊髓损伤组变淡,较假手术组阳性细胞略增多,染色微深。造模第1、3、7天,脊髓损伤组IL-6,IL-10,IL-1β和TNF-α水平高于手术组和吡拉西坦组(P<0.05)。与脊髓损伤组比,吡拉西坦组HE染色脊髓出血及坏死区域面积减小,免疫组化显示AQP4染色变淡。WB结果显示,造模第3天,脊髓损伤组pERK,p-JNK和p-p38水平高于假手术组和吡拉西坦组(P<0.05)。结论:吡拉西坦不仅在促进脊髓损伤后的运动功能恢复方面表现出显著效果,而且在减少病变面积、调节AQP4表达以减轻水肿,以及通过调控MAPK信号通路降低炎症反应方面均显示出积极的治疗潜力。

基于MAPK/NF-κB信号通路探讨调气止咳方对咳嗽变异性哮喘大鼠气道炎症的影响及机制

目的基于MAPK/NF-κB信号通路探讨调气止咳方(麻黄、苦杏仁、浙贝母、黄芩、瓜蒌子等)对咳嗽变异性哮喘大鼠气道炎症的影响及机制。方法采用卵清蛋白致敏复制咳嗽变异性哮喘大鼠模型。将SD大鼠随机分组为空白组、模型组、地塞米松组(0.5 mg·kg^(-1))、孟鲁司特组(1.0 mg·kg^(-1))及调气止咳方低、中、高剂量组(9.6、19.2、38.4 g·kg^(-1)),每组10只;灌胃给药,每日1次,连续14 d。观察大鼠一般状况并记录雾化后2 min内大鼠的咳嗽次数;采用HE染色、Masson染色法观察大鼠肺组织病理变化;ELISA法检测血清白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;Western Blot法检测肺组织p38 MAPK、p-p38、NF-κB p65、p-p65蛋白表达水平;RT-qPCR法检测肺组织p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠的咳嗽次数显著增加(P<0.01),肺损伤病理评分及胶原纤维面积比显著升高(P<0.01);血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著升高(P<0.01);肺组织中p-p38、p-p65、p-p38/p38、p-p65/p65蛋白表达均显著上调(P<0.01),p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠的咳嗽次数显著减少(P<0.01),肺损伤病理评分及胶原纤维面积比显著降低(P<0.01),血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.01),肺组织中p-p38、p-p65蛋白表达及p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表达均明显下调(P<0.05,P<0.01);调气止咳方高剂量组大鼠肺组织中p-p38/p38、p-p65/p65蛋白表达比值均显著下调(P<0.01)。与地塞米松组和孟鲁司特组比较,调气止咳方高剂量组大鼠的咳嗽次数明显减少(P<0.05);与地塞米松组比较,调气止咳方高剂量组大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显降低(P<0.01);与孟鲁司特组比较,调气止咳方高剂量组大鼠的血清IL-1β、TNF-α水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论调气止咳方能够改善卵清蛋白诱导的咳嗽变异性哮喘大鼠的咳嗽症状,减轻气道炎症细胞浸润及气道重塑,降低炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平,其机制可能与调控MAPK/NF-κB信号通路有关。

左归丸对帕金森病轻度认知障碍患者P38 MAPK信号通路及认知功能的影响

目的探究左归丸对帕金森病轻度认知障碍(PD-MCI)患者P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路及认知功能的影响。方法80例肝肾阴虚型PD-MCI患者随机均分为观察和对照组,对照组采用丁苯酞软胶囊口服治疗,观察组在对照组治疗基础上加左归丸加味治疗,均治疗8周;观察两组患者的疗效、中医证侯积分、P38 MAPK蛋白表达、认知行为功能[蒙特利尔认知评估量表(MoCA)、日常生活行为能力量表(ADL)、简易智力状态检查量表(MMSE)]、炎症反应[尿酸(UA)、同型半胱氨酸(Hcy)]水平及治疗期间的不良反应。结果与对照组比较,观察组总有效率更高(P<0.05);治疗8周时,两组患者头或肢体震振、肢休拘痉、颈背僵直、腰膝酸软、胁肋疼痛、头晕头痛得分均较治疗前降低,且观察组低于对照组(P<0.05);两组患者P38 MAPK及p-JNK蛋白表达均较治疗前下降,且观察组低于对照组(P<0.05);与治疗前比较,治疗8周时两组肝肾阴虚型PD-MCI患者MMSE、MoCA得分均上升,ADL得分均下降;且观察组MMSE、MoCA得分高于对照组,而ADL得分低于对照组(P<0.05);与治疗前比较,治疗8周时两组患者肝肾阴虚型PD-MCI患者UA升高、Hcy下降,观察组Hcy低于对照组(P<0.05),治疗8周时两组UA水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组患者治疗期间的不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论左归丸联合丁苯酞治疗PD-MCI可改善患者的认知功能,其机制可能与调节P38 MAPK蛋白表达和炎症反应有关。

温胆汤通过调控p38 MAPK信号通路干预内淋巴积水形成的研究

目的基于p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路探讨温胆汤对内淋巴积水形成的影响。方法将30只豚鼠随机分为对照组、模型组、低剂量温胆汤组、中剂量温胆汤组、高剂量温胆汤组,每组6只。采用腹腔注射6μg/kg醋酸去氨加压素10 d的方法,对除对照组外的其他组豚鼠建立内淋巴积水模型;第11天开始,低、中、高剂量温胆汤组分别灌胃6.1 g/kg、12.2 g/kg、24.4 g/kg温胆汤颗粒剂,对照组和模型组灌胃等量双蒸水。持续灌胃10 d后处死豚鼠,免疫组化法检测耳蜗组织中炎症因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)]和水通道蛋白2(AQP2)阳性表达情况,qRT-PCR法检测耳蜗组织中AQP2和p38 MAPK mRNA表达情况,Western blot法检测耳蜗组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达情况。结果与对照组比较,模型组耳蜗组织中IL-1β、IL-6、AQP2阳性表达吸光度值和AQP2 mRNA相对表达量、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均明显升高(P均<0.05),p38MAPK mRNA相对表达量无明显变化(P>0.05);与模型组比较,温胆汤各组耳蜗组织中IL-1β、IL-6、AQP2阳性表达吸光度值和AQP2 mRNA相对表达量、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均明显降低(P均<0.05),p38MAPK mRNA相对表达量均无明显变化(P均>0.05)。结论温胆汤可以有效改善醋酸去氨加压素诱导的豚鼠内淋巴积水,其机制可能与调控p38 MAPK信号通路和AQP2表达有关。

艾灸督脉组穴对血管性痴呆大鼠海马p38 MAPK信号通路及细胞凋亡的影响

目的基于p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路探究艾灸督脉组穴对血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠的脑保护机制。方法将60只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(12只)和实验组(48只);实验组大鼠采用双侧颈总动脉永久结扎法复制VD大鼠模型,随后将模型复制成功的大鼠分为模型组、艾灸组、阻滞剂组、艾灸+阻滞剂组,每组12只;艾灸组大鼠取“百会”“大椎”“风府”穴,采用温和灸法治疗,每次30 min,每日1次,治疗6 d,休息1 d,连续治疗4周;阻滞剂组在模型复制前30 min腹腔注射p38 MAPK阻滞剂(10μmol/L SB203580),模型复制成功后隔日注射1次,每次每只大鼠按1 mL/kg注射10μmol/L SB203580,连续注射4周;艾灸+阻滞剂组大鼠在阻滞剂组干预方法基础上进行艾灸治疗。采用Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能,TUNEL法检测大鼠海马组织CA1区神经元凋亡率,Western blot法和RT-qPCR法分别检测大鼠海马组织CA1区p38 MAPK、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达水平。结果与模型组比较,艾灸组、阻滞剂组、艾灸+阻滞剂组大鼠平均逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05),穿越平台次数显著增加(P<0.05),海马组织CA1区神经元凋亡率显著降低(P<0.05),p38 MAPK、Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P<0.05);艾灸+阻滞剂组大鼠平均逃避潜伏期较艾灸组、阻滞剂组显著缩短(P<0.05),穿越平台次数显著增加(P<0.05),海马组织CA1区神经元凋亡率显著降低(P<0.05),p38 MAPK、Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。结论艾灸督脉组穴对VD大鼠的认知功能具有一定的改善作用,其作用机制可能与调控p38 MAPK信号通路抑制海马神经元凋亡有关。

PLA2G4C通过p38/MAPK信号通路介导线粒体自噬促进DLBCL进展的实验研究

目的研究磷脂酶A2ⅣC组(phospholipase A2 groupⅣC,PLA2G4C)在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中的作用及其可能调节机制。方法通过免疫印迹法(Western blot)检测PLA2G4C在DLBCL组织和细胞中的表达。构建PLA2G4C过表达或敲低表达的DLBCL细胞系,后用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)或p38抑制剂SB203580处理细胞24h。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PLA2G4C转染效率;Western blot检测PLA2G4C蛋白、线粒体自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/Ⅰ,MAP1 LC3Ⅱ/Ⅰ),Beclin1,p62,PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和Parkin],p38/丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)通路相关蛋白[磷酸化p38/MAPK(phosphorylated-p38/MAPK,p-p38/MAPK)]表达水平;CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡能力。进一步构建异种移植瘤裸鼠模型,观察PLA2G4C对裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬的影响。结果DLBCL患者淋巴瘤组织中PLA2G4C蛋白表达显著高于反应性增生淋巴结组织(3.47±0.42 vs 1.01±0.02),差异具有统计学意义(t=-37.002,P<0.001);DLBCL细胞中PLA2G4C蛋白水平显著高于人淋巴母细胞样细胞系和B细胞淋巴瘤细胞系,差异具有统计学意义(F=73.771,P<0.001)。沉默PLA2G4C显著降低DLBCL细胞活力和侵袭能力,诱导细胞凋亡(t=6.909~11.390);过表达PLA2G4C后结果与之相反(t=2.392~19.778),差异具有统计学意义(均P<0.001)。且过表达PLA2G4C显著促进线粒体自噬的发生,而CQ或SB203580处理则可显著逆转PLA2G4C过表达对DLBCL细胞生物学行为及线粒体自噬的作用。体内裸鼠实验显示,敲低PLA2G4C显著抑制移植瘤裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬相关蛋白表达,差异具有统计学意义(t=13.816~25.926,均P<0.001)。结论PLA2G4C在DLBCL中表达显著上调,可能通过促进p38/MAPK信号通路介导的线粒体自噬,促进肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,参与DLBCL的发生发展。

构建类固醇抵抗哮喘Balb/c小鼠模型与MAPK信号通路相关性

目的 构建类固醇抵抗型哮喘Balb/c小鼠模型,初步检测MAPK信号通路关键蛋白表达。方法 纳入SPF级Balb/c小鼠20只,分5组,正常对照组(Ctrl组),哮喘组(BA组),哮喘+地塞米松组(BA+DEX组),类固醇抵抗哮喘组(SRA组),类固醇抵抗哮喘+地塞米松组(SRA+DEX组),采用卵清蛋白(OVA)致敏,H&E染色法观察肺组织病理学改变、ELISA法检测肺泡灌洗液(BALF)细胞计数、IgE水平、炎性因子水平变化证实造模成功;Western Blot检测MAPK信号通路关键蛋白的表达量。结果 (1)H&E染色:SRA+DEX组与SRA组比较:支气管管壁增厚、粘膜上皮细胞增生程度差异不明显、支气管周围炎细胞浸润数量减少不明显。(2)SRA组与BA组比较:BALF中的细胞总数增加,EOS百分比下降,给予激素治疗后,BA+DEX组与BA组比较:BALF中的细胞总数、EOS、NEUT百分比下降、MNCs百分比增加;SRA+DEX组与SRA组比较:BALF中的细胞总数、EOS、NEUT百分比下降、MNCs百分比增加。(3)BA组血清中IgE、BALF中的IL-4、IL-17A、IFN-γ含量较Ctrl组显著升高,给予激素治疗后与BA组相比,BALF中的IL-4、IL-17A、 IFN-γ含量降低;SRA+DEX组与SRA组BALF中的IL-4、IFN-γ含量降低,IL-17A无明显改变。(4)SRA组与BA组比较p-p38磷酸化蛋白水平呈下调、 p-ERK1/2蛋白呈上调的趋势。结论 成功构建类固醇抵抗哮喘小鼠模型,初步发现MAPK信号通路蛋白异常表达与类固醇抵抗型哮喘相关。

基于p38 MAPK/NF-κB信号通路探讨藏红花素对糖尿病心肌病大鼠的影响

目的基于p38丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB(p38 MAPK/NF-κB)信号通路探讨藏红花素对糖尿病心肌病(DCM)大鼠的影响。方法取45只Wistar大鼠,随机选择8只作为正常组,其余大鼠采用高糖高脂饮食12周并负荷一次性30 mg/kg链脲佐菌素的方法构建DCM模型。将32只造模成功的大鼠随机分为模型组、藏红花素组、藏红花素+p38 MAPK抑制剂组和藏红花素+p38 MAPK激动剂组,每组8只。藏红花素组给予50 mg/kg藏红花素腹腔注射,藏红花素+p38 MAPK抑制剂组给予50 mg/kg藏红花素和5 mg/kg SB203580腹腔注射,藏红花素+p38 MAPK激动剂组给予50 mg/kg藏红花素和2 mg/kg ANS腹腔注射,正常组和模型组给予等体积生理盐水腹腔注射,均1次/d。连续注射12周后,心脏超声检测大鼠心功能指标[左心室收缩末期压(LVESD)、左心室舒张末期压(LVEDD)、左心室短轴缩短率(LVFS)],ELISA法检测血清心肌酶[谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)]和炎症因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平,苏木精-伊红、马森染色观察心肌组织病变和纤维化情况,RT-PCR法、免疫组织化学法检测心肌组织中p38 MAPK、NF-κB p65、转化生长因子-β1(TGF-β1)、I型胶原蛋白(Col-I)mRNA和蛋白表达情况。结果与模型组比较,藏红花素组、藏红花素+p38 MAPK抑制剂组大鼠LVESD、LVEDD及血清AST、LDH、CK-MB、IL-1β、IL-18、TNF-α水平均明显降低(P均<0.05),LVFS明显升高(P<0.05);心肌组织病变和纤维化情况均明显改善,心肌组织损伤评分和胶原容积分数均明显降低(P均<0.05);心肌组织中p38 MAPK、NF-κB p65、TGF-β1、Col-I mRNA相对表达量和蛋白表达积分吸光度均明显降低(P均<0.05)。与藏红花素组比较,SB203580可显著增强藏红花素对DCM大鼠心功能指标、心肌酶和炎症因子水平、心肌组织病变和纤维化情况、p38 MAPK/NF-κB信号通路相关因子mRNA和蛋白表达的调控作用,ANS则明显逆转藏红花素对DCM大鼠的上述作用。结论藏红花素可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路减轻炎症反应和组织纤维化,从而对DCM大鼠起到保护作用。

吗啡预处理对心力衰竭大鼠p38MAPK信号转导通路的影响

目的 探讨吗啡预处理对心力衰竭大鼠p38MAPK信号转导通路的影响。方法 选取30只体重200~220 g的SD健康SPF级实验大鼠,适应环境1周后,用盐酸阿霉素(ADR)腹腔注射造模心力衰竭(除对照组给生理盐水外,其余按1.5 ml/kg注射,1次/周,共6周,8 d后左心室短轴缩短率(LVFS)<30%表示模型建立成功)。40只大鼠中,20只造模,10只为正常对照,第8周将造模成功的20只大鼠随机分为模型组和吗啡预处理组,每组各10只,正常对照组和模型组不干预,吗啡预处理组灌注吗啡0.050 mg/kg,输注5 min,停5 min,重复3次。实验完成后,处死大鼠并进行腹腔静脉采血,随后通过离心分离上清液,用ELISA方法测定血浆中的BNP、ET-1和IL-6含量;同时,使用生理记录仪测量左心室的收缩末压(LVSP)、舒张末压(LVEDP),以及其内压的最大上升(+dp/dtmax)和下降(-dp/dtmax)速度;取大鼠心肌组织进行Western blot检测p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达;用RT-PCR检测p38MAPK mRNA的表达。结果 模型组和吗啡预处理组的左心室收缩压(LVSP)明显低于对照组,而左心室舒张末期压力(LVEDP)则高于对照组。左心室内压的最大上升速率(+dp/dtmax)在这两个组中均低于对照组,最大下降速率(-dp/dtmax)则高于对照组。吗啡预处理组的这些指标介于模型组和对照组之间,所有差异均具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组、吗啡预处理组血清BNP、ET-1和IL-6含量均升高,与模型组比较,吗啡预处理组上述指标降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组与吗啡预处理组大鼠心肌组织中p38MAPK、p-p38MAPK的表达显著升高,吗啡预处理组表达介于两组之间,差异有统计学意义(P<0.05)。mRNA表达实验表明,模型组与吗啡处理组的心肌p38MAPK mRNA表达高于正常对照组,模型组高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 本研究成功构建了心力衰竭大鼠模型。结果显示,吗啡预处理对部分心功能指标有显著改善,同时能降低血清中相关因子的浓度,并调节心肌组织中的关键蛋白和mRNA表达。这些发现表明,吗啡可能通过影响p38MAPK信号传导通路来发挥保护作用。

流体静压力通过Ca^(2+)/CaMKⅡ/MAPK信号通路调控髁突软骨细胞增殖与凋亡

目的:考察30 kPa流体静压力调控髁突软骨细胞增殖及凋亡的分子机制。方法:体外培养大鼠髁突软骨细胞,分为4组:正常压力组、30 kPa压力组、KN93对照组、30 kPa压力+KN93组。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)标记法测定细胞增殖。流式细胞术法检测细胞凋亡比例。荧光探针法检测细胞内Ca^(2+)水平。Western blot法检测细胞钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)、p-c-Jun、c-Jun、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、p-p38、p38蛋白表达。结果:与正常压力组相比,30 kPa压力组细胞增殖率均降低;凋亡率均提高;细胞内Ca^(2+)水平升高;CaMKⅡ蛋白表达上调,(p-c-Jun)/(c-Jun)、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)、(p-p38)/(p38)的比值均增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。与30 kPa压力组相比,30 kPa压力+KN93组细胞增殖率均提高;凋亡率均降低;细胞内Ca^(2+)水平降低;CaMKⅡ蛋白表达下调,(p-c-Jun)/(c-Jun)、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)、(p-p38)/(p38)的比值均降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:30 kPa静压力持续作用髁突软骨细胞,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,提高细胞内Ca^(2+)水平,其作用机制为Ca^(2+)通过CaMKⅡ激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号通路。

游泳运动对慢性非细菌性前列腺炎大鼠p38MAPK/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨游泳运动对慢性非细菌性前列腺炎(CAP)大鼠p38MAPK/NF-κB信号通路的影响。方法:雄性SD大鼠分为运动组、CAP模型组、正常组,每组10只,注射消痔灵制备大鼠模型,运动组每天游泳运动1次,时间为50min,6d/周,共游泳运动4周,模型组和正常组不开展游泳运动;末次游泳运动结束后2h,股动脉取血处死大鼠,采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测大鼠血清p38MAPK、NF-κB p65、IL-1β、IL-4、TNF-α含量,观察三个组别大鼠前列腺组织病理学改变。结果:4周游泳运动结束后,模型组和运动组大鼠血清内p38MAPK、NF-κB p65、IL-1β、IL-4、TNF-α含量显著高于正常组(P<0.05),运动组大鼠血清内上述观察指标显著低于模型组(P<0.05);相关分析显示,CAP大鼠血清内IL-1β、IL-4、TNF-α水平与p38MAPK、NF-κB p65表达呈显著正相关(P<0.01),p38MAPK与NF-κB p65呈显著正相关(P<0.01);病理观察显示,与正常组比较,模型组大鼠前列腺组织慢性炎症病变明显,与模型组比较,运动组大鼠前列腺血管扩张程度、炎细胞浸润数量及范围、管腔狭窄及间质水肿纤维化的情况均有所减轻。结论:游泳运动能够抑制CAP大鼠血清内p38MAPK、NF-κB p65表达,下调IL-1β、IL-4、TNF-α水平,对大鼠CAP炎症发挥缓解作用。

抑制P38MAPK信号通路表达减轻大鼠神经病理性疼痛的机制

目的探究抑制P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)信号通路表达减轻大鼠神经病理性疼痛的机制。方法选取60只雄性无特定病原体(SPF)级大鼠(体质量200~220 g,3月龄左右),随机抽取10只作为假手术组,其余大鼠建立大鼠慢性压迫性损伤(CCI)模型。将成模大鼠[造模成功率为80%(40/50)]随机分为模型组、P38MAPK抑制剂组,造模后第6天分别鞘内注射生理盐水、P38MAPK抑制剂,2次/d,连续5 d。术后1、7、11 d测定各组大鼠机械性痛阈、运动功能评分。术后第11天处死大鼠,采用免疫组化法测定大鼠背根神经节P38MAPK、环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达。计量资料采用重复测量方差分析。结果假手术组大鼠机械性痛阈变化不明显;模型组大鼠第7天开始痛阈水平降低,至第11天降至最低;P38MAPK抑制剂组第7天痛阈水平降低,第11天升高(P<0.05),且高于模型组(P<0.05);模型组与P38MAPK抑制剂组在第7天出现明显运动功能障碍,第11天模型组运动功能障碍程度增加,第11天P38MAPK抑制剂组运动功能障碍程度减轻(P<0.05),且运动功能评分低于模型组(P<0.05);假手术组P38MAPK免疫阳性细胞表达<P38MAPK抑制剂组<模型组[(7.35±0.63)%比(25.36±1.85)%比(60.23±2.17)%](P<0.05);假手术组COX-2蛋白阳性细胞表达<P38MAPK抑制剂组<模型组[(5.21±2.23)%比(15.14±2.01)%比(33.43±3.02)%](P<0.05)。结论P38MAPK信号通路与神经病理性疼痛发生有关,抑制P38MAPK信号通路表达可减轻大鼠神经病理性疼痛。

KDM6B通过MAPK信号通路调控肾癌细胞的增殖和迁移

目的研究赖氨酸特异性去甲基酶6B(KDM6B)表达对肾透明细胞癌增殖和迁移侵袭的影响。方法通过基因表达谱交互分析数据库分析KDM6B表达与肾透明细胞癌临床分期与预后的关系。将肾透明细胞癌患者的肿瘤组织石蜡切片进行KDM6B免疫组化染色并统计与临床病理特征的相关性,使用敲低对照小干扰RNA以及敲低KDM6B小干扰RNA对人肾透明细胞癌细胞株ACHN和Caki-1细胞分别进行转染,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及Western blot验证转染效率,使用CCK8实验检测转染后肾透明细胞癌细胞增殖能力的变化,克隆形成实验检测细胞形成克隆的能力,使用Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力的变化。使用Western blot实验检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中磷酸化的细胞外信号调节激酶蛋白(p-ERK)及细胞外信号调节激酶蛋白的表达水平。结果肾透明细胞癌组织中KDM6B的高表达与良好的疾病分期与预后密切相关。在两种细胞系中转染siKDM6B均能成功敲低KDM6B的表达。敲低KDM6B表达后肾透明细胞癌细胞ACHN和Caki-1的细胞增殖能力显著增强,细胞克隆形成能力明显增强,细胞迁移侵袭能力显著增强。敲低KDM6B表达后p-ERK表达水平显著增加。结论KDM6B抑制MAPK信号通路激活及肾透明细胞癌细胞进展,该蛋白可能成为诊断肾透明细胞癌的生物标记物以及治疗肾透明细胞癌的潜在靶点。

龙血素B通过P38MAPK信号通路调控MC3T3-E1成骨分化和骨形成的机制

目的:探究龙血素B对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)成骨分化和骨形成的影响以及其通过P38MAPK信号通路调控成骨分化和骨形成的机制。方法:培养MC3T3-E1细胞,加入不同浓度(0、15、30、60、90、120μmol/L)龙血素B,采用CCK8法和流式细胞术(FCM)检测不同时间(24h、48h、72h)MC3T3-E1细胞增殖能力和凋亡情况,确定龙血素B促MC3T3-E1细胞成骨最佳的药物浓度及作用时间。培养MC3T3-E1细胞并分为空白组(不作干预),龙血素B组(加入龙血素B共培养),龙血素B+阻断剂组(加入龙血素B和P38抑制剂SB203580共培养),进行干预实验;采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒测定各组细胞ALP活性,qRT-PCR法检测各组细胞骨桥蛋白(OPN)基因、骨钙素(OCN)基因、骨唾液蛋白(BSP)基因表达水平,茜素红染色法观察各组细胞骨形成能力。结果:龙血素B可促进MC3T3-E1细胞增殖并抑制其凋亡,效果与浓度和干预时间相关,在90μmol/L浓度下干预48h促MC3T3-E1细胞生长作用最强;干预结束后第1、3、5天,龙血素B组细胞ALP活性较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞ALP活性较龙血素B组降低(P<0.05);龙血素B组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较龙血素B组降低(P<0.05);干预结束后第21天,龙血素B组细胞钙化结节区域面积较空白组增大,龙血素B+阻断剂组细胞钙化结节区域面积较龙血素B组减小(P<0.05)。结论:龙血素B可提高MC3T3-E1细胞增殖活性,并通过激活P38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化和骨形成。

基于ERK/p38 MAPK信号通路探究解毒活血汤治疗Ⅲ型前列腺炎的作用机制

目的探究解毒活血汤调控ERK/p38 MAPK信号通路治疗Ⅲ型前列腺炎的作用机制。方法采用去势手术+苯甲酸雌二醇(EB)诱导慢性前列腺炎大鼠模型。36只SD大鼠随机分为空白组(生理盐水,4 mL·kg^(-1))、模型组(生理盐水,4 mL·kg^(-1))、阳性药物对照组(前列康片混悬液,4 mL·kg^(-1))、解毒活血汤低(4 mL·kg^(-1))、中(8mL·kg^(-1))、高剂量组(12 mL·kg^(-1)),每组6只,所有实验动物连续给药30 d。苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠组织病理学变化;免疫组化法、RT-PCR、Western Blot技术检测相关炎症因子及蛋白表达水平。结果与正常对照组相比,慢性前列腺炎大鼠前列腺组织增生及水肿明显、炎症浸润增加,而阳性药物对照组及解毒活血汤各剂量组大鼠前列腺组织病变减轻或消失、炎症浸润减少,且与解毒活血汤剂量成正比;免疫组化表示模型组p38、P-p38、STAT3、P-STAT3表达较高,阳性药物对照组、不同剂量解毒活血汤组的p38、P-p38、STAT3、P-STAT3表达呈下降趋势,且均低于模型组。RT-PCR结果显示阳性药物对照组及解毒活血汤低、中、高剂量组均能降低大鼠前列腺组织中TNF-α、IL-2、IL-6的表达水平;Western Blot检测提示大鼠疾病发生进展过程中p38、P-p38、P-ERK1/2、STAT3、P-STAT3呈高表达状态,解毒活血汤能够降低其表达,从而降低相关炎症因子的过度激活。结论解毒活血汤能够抑制ERK/p38 MAPK信号通路的过度激活,从而降低IL-2、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达,以改善前列腺组织炎症反应。