丝氨酸蛋白酶、尿β2-MG、VEGF与妊娠期高血压孕妇病情严重程度的相关性研究

目的:研究丝氨酸蛋白酶(corin)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、血管内皮生长因子(VEGF)在妊娠期高血压孕妇中的水平及与病情严重程度相关性。方法:选取30例妊娠期高血压孕妇和30名健康妊娠孕妇,分为妊高组和健康组;根据妊娠期高血压严重程度分为轻度12例和重度18例;分别检测corin、尿β2-MG、VEGF水平,分析妊娠期高血压孕妇corin、尿β2-MG、VEGF水平与病情严重程度相关性。结果:妊高组的VEGF水平均低于健康组(P<0.05);corin、尿β2-MG水平高于健康组(P<0.05~P<0.01)。重度妊高组的corin、尿β2-MG水平明显高于轻度妊高组,VEGF水平明显低于轻度妊高组(P<0.05~P<0.01);孕中期corin、尿β2-MG水平均低于孕晚期,VEGF水平高于孕晚期(P<0.05~P<0.01)。结论:corin、尿β2-MG、VEGF在妊娠期高血压孕妇中表达异常,与病人病情严重程度有关,可能参与妊娠期高血压的发病过程。

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2基因的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶－２（ＭＡＳＰ－２）编码区基因。方法采用 ＲＴ－巢式 ＰＣＲ技术从 人胎肝组织总ＲＮＡ扩增目的cＤＮＡ片段，克隆人ｐＧＥＭ－Ｔ载体，酶切图谱分析和测序鉴定。结果获得了编码合信号 顺序的ＭＡＳＰ－２肽链全长cＤＮＡ，将其与pＧＥＭ－Ｔ载体连接，转化大肠杆菌ＴＧ１，建立了ＭＡＳＰ－２的重组克隆。酶切图 谱与微机分析结果无异；序列分析表明，与报道的人 ＭＡＳＰ－２ｃＤＮＡ序列一致。结论成功克隆了人 ＭＡＳＰ－２基因，为深 入研究补体凝集素途径的激活机制和甘露聚糖结合凝集素基因突变引起免疫缺损的发病机制奠定了基础。

肝细胞肝癌患者血浆中甘露聚糖结合凝集素和甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2的表达水平

目的检测肝细胞肝癌患者血浆中甘露糖结合凝集素(MBL)、MBL相关丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)的表达水平,探讨其与肝细胞肝癌发生发展的相关性。方法用酶联免疫吸附测定方法检测64例肝细胞肝癌患者及30例健康人血浆中MBL及MASP-2的表达水平,并用统计学方法分析患者血浆中MBL及MASP-2的浓度与各临床指标的相关性。结果肝细胞肝癌患者血浆中MBL和MASP-2的浓度均显著高于健康人群(P=0.014、0.002),MBL/MASP-2比值在健康人群与肝细胞肝癌患者中的差异无统计学意义,此外,患者血浆中MBL与MASP-2并无相关性。在肝细胞肝癌患者中,血浆MBL水平与肿瘤的血管侵犯(r=0.253,P=0.047)和总胆红素水平(r=0.283,P=0.024)呈正相关;血浆中MASP-2水平与肝细胞肝癌的TNM分期呈正相关(r=0.276,P=0.027),而与血浆白蛋白呈负相关(r=0.-0.317,P=0.015)。经ROC曲线分析,MBL和MASP-2曲线下面积分别为0.665(P=0.010)和0.694(P=0.003),对肝细胞肝癌诊断的敏感性分别为50%和89.1%。结论补体凝集素途径的关键分子MBL、MASP-2与肝细胞肝癌患者的炎症状态和疾病进展相关,参与了肝癌的发生与发展。

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2N端片段的原核表达

目的在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)N端片段。方法应用PCR技术从含人MASP2 cDNA的质粒pGEM-MASP2中扩增MASP2-N端基因片段,将其克隆至pGEX4T-1原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP2-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与MBL-CLR结合的活性。结果从pGEM-MASP2中扩增得到约840 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4900 bp和840 bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr 60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR蛋白结合。结论获得了表达人MASP2 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP2N端片段/GST融合蛋白,为MASP2分子的进一步研究提供了条件。

着床丝氨酸蛋白酶-2(ISP2)蛋白在小鼠卵子和早胚组织中的表达及其定位

目的:了解ISP2蛋白在小鼠卵细胞和早胚组织中的表达情况。方法:收集小鼠未成熟卵、成熟卵、受精卵和着床前胚泡,利用特异性抗ISP2抗体,采用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术对ISP2在卵细胞和早期胚胎组织中的表达模式以及亚细胞定位进行检测分析。结果:在小鼠未受精卵、受精卵和着床前胚泡中均能检测到特异的ISP2蛋白信号;通过激光共聚焦显微镜观察到ISP2在细胞膜上的信号强于其在细胞质。结论:ISP2蛋白在小鼠卵子和早胚组织中均有表达,并主要分布在细胞膜上。

甲状腺肿瘤患者血清中甘露糖结合凝集素和相关的丝氨酸蛋白酶-2的水平及意义

目的探讨甲状腺肿瘤患者血清中甘露糖结合凝集素和相关的丝氨酸蛋白酶-2的水平及意义。方法 24例甲状腺乳头状癌患者(乳头状癌组)、28例甲状腺腺癌患者(腺癌组)及26例正常健康人作为对照(对照组),采用酶联免疫吸附法分别检测患者及对照人员血清内甘露糖结合凝集素及丝氨酸蛋白酶-2水平,并进行比较分析。结果乳头状癌组血清内甘露糖结合凝集素及丝氨酸蛋白酶-2水平均高于腺癌组及对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),且腺癌组甘露糖结合凝集素及丝氨酸蛋白酶-2水平与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲状腺乳头状癌患者血清内甘露糖结合凝集素及丝氨酸蛋白酶-2水平较高,说明两种物质与甲状腺肿瘤的发生有关,作为免疫因子,对肿瘤抵抗起到一定作用。

人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2C端基因的克隆与鉴定

目的:获得人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2(MASP-2)C端编码基因,并表达人MASP-2C端片段,为制备单克隆抗体及应用于临床相关疾病的检测奠定分子学基础。方法:采用RT-PCR技术从人胎肝组织总RNA中扩增人MASP-2C端的cDNA,克隆入pGEX-6p-2表达载体,酶切图谱分析和序列分析鉴定。结果:获得编码人MASP-2C端片段的cDNA,并且与pGEX-6p-2载体连接,转化大肠杆菌XL1-blue,成功构建人MASP-2C端片段cDNA的重组克隆。重组质粒酶切图谱分析和DNA测序分析,人MASP-2C端片段cDNA的重组克隆与GenBank中人MASP-2C端的cDNA序列一致。结论:成功克隆了人MASP-2C端片段cDNA,并在大肠杆菌中表达人MASP-2C端多肽片段。

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2的研究进展

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)是补体凝集素途径关键酶,位于染色体1p36上,约20 kb,由686个氨基酸残基构成。通过病原相关分子模式识别病原体,与凝集素结合,以酶原形式存在的MASP-2活化,继而激活后续级联反应,致使入侵的病原体被机体清除破坏。MASP-2基因多态性普遍存在,过高或过低的MASP-2水平都不利于免疫系统正常运行,影响着多种疾病的易感性及发展进程。MASP-2血清浓度在不同疾病及同一疾病不同阶段的不尽相同。MASP-2与肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的发生发展密切相关。

跨膜丝氨酸蛋白酶2-成红细胞特异性转化基因相关基因、成红细胞特异性转化基因变异体1及成红细胞特异性转化基因变异体4在前列腺癌中的表达及临床意义

目的分析跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)-成红细胞特异性转化基因相关基因(ERG)、TMPRSS2-成红细胞特异性转化基因变异体1(ETV1)、TMPRSS2-成红细胞特异性转化基因变异体4(ETV4)在前列腺癌中的表达及临床意义。方法2018年4月至2020年9月我院收治的82例前列腺癌患者,采用免疫组化法检测癌组织及癌旁正常组织中TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4表达。分析上述因子表达与前列腺癌临床病理特征的关系及诊断前列腺癌的价值。结果前列腺癌组织中TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4阳性表达率均高于癌旁正常组织(P<0.05)。临床分期C+D、Gleason评分≥5分者TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4阳性表达率高于临床分期A+B、Gleason评分<5分(P<0.05)。RTMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4联合检测曲线下面积(AUC)、敏感度、特异度分别为0.814、0.925、0.865,均高于各项指标单独检测(P<0.05)。结论TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4在前列腺癌患者中呈过度表达,通过联合检测上述因子对前列腺癌的诊断与鉴别诊断有良好的应用价值。

血清内皮细胞特异分子-1、 脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂水平对2型糖尿病大血管病变诊断的临床价值

目的探讨血清内皮细胞特异分子-1(Endocan-1)、脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Vaspin)水平对2型糖尿病(T2DM)大血管病变(MVC)的临床诊断意义。方法选取72例患者,根据是否合并大血管疾病,分为T2DM组36例和MVC组36例;此外,选同期36例健康者作为对照组。利用酶联免疫吸附检测技术(ELISA)测定3组血清Endocan-1、Vaspin水平。结果T2DM组和MVC组血清Endocan-1水平均高于对照组,且MVC组高于T2DM组,差异有统计学意义(P<0.05)。MCV组Vaspin水平均低于T2DM组和对照组,T2DM组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Endocan-1与T2DM合并大血管疾病呈正相关,Vaspin与T2DM合并大血管疾病呈负相关。MVC组血清Endocan-1和Vaspin的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.910%、0.720%,截断值分别为1410 pg/mL、890 pg/mL,敏感度分别为81%、85%,特异度分别为76%、73%。结论血清Endocan-1、Vaspin的水平均与T2DM大血管病变相关,其可作为T2DM大血管病变的诊断依据。

重组着床丝氨酸蛋白酶-2(ISP2)在昆虫细胞中的表达

目的:利用昆虫细胞表达着床丝氨酸蛋白酶-2(implantation serine proteinase-2,ISP2)。方法:将ISP2cDNA克隆入核型多角体病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表达载体pVL1392,获得的重组表达载体pVL1392/ISP2,与BaculGoldTM线性杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,经多次扩增后获得高滴度的重组病毒AcNPV-ISP2。将此重组病毒感染昆虫细胞,收集转染细胞培养上清液。结果:用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Westernblot测得培养上清液中有表达蛋白,分子量为40kD左右。结论:用杆状病毒系统表达的ISP2能分泌到细胞外,有利于产物的分离纯化,为进一步研究ISP2在着床中的生物功能奠定了基础。

甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 EGF片段多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MBL-associated serine protease-2,MASP-2)EGF功能区蛋白的多克隆抗体并进行鉴定,为后续研究奠定基础。方法利用带有EGF基因片段的p GEX-6P-2原核载体诱导表达GST-EGF融合蛋白,并采用商品化GST-Beads进行纯化;将纯化的融合蛋白作为抗原,与弗氏完全佐剂充分混合后,免疫5周龄BALB/c雌性健康小鼠,制备多克隆抗体;利用琼脂双扩散法检测多克隆抗体的效价,并进一步应用Western blot鉴定多克隆抗体的特异性及效价。结果成功表达并纯化EGF蛋白,以此成功制备出特异性强的GST-EGF融合蛋白的多克隆抗体,与其他蛋白无交叉反应;琼脂双扩散法检测的EGF抗体效价为1∶8;Western blot检测的EGF抗体效价大于1∶2 000。结论成功制备出具有特异性强且效价高的GST-EGF蛋白的多克隆抗体。

人MIBL相关丝氨酸蛋白酶—1cDNA的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素（ＭＢＬ）相关丝氨酸蛋白酶－１（ＭＡＳＰ－１）基因。方法 以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板，采用ＲＴ－ＰＣＲ获取目的ｃＤＮＡ片段，克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体，进行酶切图谱分析和测序鉴定。结果 以ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了含信号顺序的全长ＭＡＳＰ－１ｃＤＮＡ，将其与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接，转化大肠杆菌ＴＧ１，建立了ＭＡＳＰ－１的ｃＤＮＡ克隆，酶切图谱与微机分析结果一致。序列分析表明。

着床丝氨酸蛋白酶-1/2在胚胎着床过程中的作用

着床丝氨酸蛋白酶-1(ISP1)和着床丝氨酸蛋白酶-2(ISP2)是于2001年首次报道的S1丝氨酸蛋白酶家族的新成员,迄今仅在小鼠卵细胞、受精卵和早胚、以及子宫组织中发现这两种蛋白酶的表达,具有较高的细胞和组织特异性。在体和离体实验证实,ISP1和ISP2在小鼠胚胎着床过程中发挥关键作用,是潜在的抗着床药物靶分子。现就10年来对ISP1和ISP2的研究进展作一综述。

分泌型天冬氨酸蛋白酶-2的研究进展

分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)-2是真菌生存所需的毒力因子,可以诱导抗体产生,参与白色假丝酵母菌的多方面致病过程。本文就Sap-2的命名、结构、生物化学特性、表达、影响因子、致病机制和应用等研究进展作一综述。

长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核表达

根据GenBank中的长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂(Haemaphysalis longicornisserine proteinase inhibitor-2,HLS2)基因序列设计特异性引物,以长角血蜱饥饿成蜱总RNA为模板,经RT-PCR扩增出1 164 bp的HLS2DNA片段。将其与pET-30a载体连接,构建pET-30a-HLS2表达载体,转化J M109大肠杆菌,筛选阳性克隆,经双酶切鉴定及测序分析后转化到E.coliBL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析。优化表达条件后纯化融合蛋白,用Western blotting鉴定其抗原性。结果表明,获得的HLS2 DNA片段与GenBank中的HLS2(序列号AB162827)序列的同源性为98%。构建的pET-30a-HLS2表达载体在大肠杆菌中表达了约为47000的HLS2融合蛋白,主要以包涵体形式存在,IPTG终浓度为1.0 mmol/L、28℃诱导7 h后融合蛋白的表达量最高。Western blotting显示该融合蛋白可与兔抗长角血蜱阳性血清反应。

类风湿关节炎患者血清MBL、MASP-2、HsCRP与C_3水平的相关性

目的研究类风湿关节炎(RA)患者血清中甘露糖结合凝集素(MBL)/MBL相关的丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)、Hs CRP和C3水平的相关性。方法收集50例RA患者(活动期和非活动期各25例)和40例健康对照者空腹静脉血,用酶联免疫吸附试验和免疫比浊试验分别检测血清MBL、MASP-2、Hs CRP和C3的水平。结果 RA组活动期和非活动期患者血清中MBL水平均显著低于健康对照组(10.05±2.14 ng/m L vs 26.97±11.78 ng/m L;14.79±3.93 ng/m L vs 26.97±11.78 ng/m L,P<0.05);RA组活动期和非活动期患者血清中MASP-2水平均显著低于健康对照组(75.90±9.21 ng/m L vs 251.78±34.50 ng/m L;107.8±14.90 ng/m L vs251.78±34.50 ng/m L)(P<0.05);RA组活动期和非活动期患者血清中Hs CRP水平显著高于健康对照组(40.53±34.81 mg/L vs1.42±1.70 mg/L;2.97±2.51 mg/L vs 1.42±1.70 mg/L,P<0.05),C3水平3组无差异;双变量Pearson相关性分析,RA患者组MBL与MASP-2含量均呈显著正相关(r=0.550,P=0.001)、与Hs CRP含量呈低度负性相关(r=-0.323,P=0.022);与C3含量无相关(r=0.022,P=0.882)。RA组MASP-2与Hs CRP含量呈低度负性相关(r=-0.453,P=0.001);与C3含量无相关(r=0.049,P=0.738)。经ROC曲线分析,Hs CRP曲线下面积最大(0.844,P=0.001),MASP-2和MBL曲线下面积较小(0.025,P=0.001;0.266,P=0.001),Hs CRP(84%)对RA诊断的敏感性高于MBL(10%)、MASP-2(40%)。结论 MBL与MASP-2水平与Hs CRP呈负相关关系,RA患者关节的炎症损伤程度越重,则血清MBL与MASP-2水平越低,提示MBL与MASP-2参与RA病理损伤过程,但二者的敏感性均较低,不能做为RA诊断及疾病活动程度评价的独立指标。

类风湿性关节炎患者血清MBL MASP-2和DKK-1水平变化与患者预后相关性

目的:研究类风湿性关节炎(RA)患者血清甘露糖结合凝集素(MBL)、MBL相关的丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)和Dickkopf-1蛋白(DKK-1)水平变化及其与患者预后相关性。方法:选取2017年8月至2020年8月我院194例RA患者和102例健康体检者分别为研究组和对照组,检测入院时血清MBL、MASP-2和DKK-1水平,同时根据28个关节疾病活动评分(DAS28)将患者分为轻度组83例、中度组62例和重度组49例,按指南对RA患者给予达标治疗并根据疗效将患者分为达标组129例和未达标组65例,比较各组血清MBL、MASP-2和DKK-1水平,同时分析其对DAS28评分的影响和对疗效的预测价值。结果:研究组血清MBL和MASP-2水平低于对照组,血清DKK-1水平高于对照组;轻度组、中度组和重度组血清MBL和MASP-2逐渐降低,血清DKK-1水平和DAS28评分逐渐升高;达标组血清MBL和MASP-2水平高于未达标组,血清DKK-1水平低于未达标组,差异有统计学意义(P<0.05)。多元线性回归分析显示,血清MBL和MASP-2水平为影响DAS28评分的重要因素(P<0.05)。血清MBL和MASP-2水平与RA治疗效果存在密切联系,RA治疗未达标的logistics回归模型为Y=12.573-0.722×血清MBL-0.090×血清MASP-2+0.792×血清DKK-1。血清MBL、MASP-2、DKK-1及三者联合检测预测RA疗效的AUC分别为0.896、0.825、0.693和0.958,敏感度分别为72.09%、67.44%、80.62%和89.15%,特异度分别为90.77%、81.54%、52.31%和90.77%。结论:RA患者血清MBL和MASP-2水平明显降低,血清DKK-1水平明显升高,且与病情变化密切相关,可为评估疗效和预后提供参考。

碱性成纤维细胞生长因子对谷氨酸诱导的豚鼠视网膜内Caspase-3和Bcl-2表达的影响

目的：探讨过量谷氨酸毒性损伤后视网膜天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和凋亡相关蛋白Bcl-2的表达及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对兴奋毒性损伤的保护作用.方法： 豚鼠随机分为正常对照组、谷氨酸损伤组、bFGF治疗组.采用免疫组织化学方法和图像分析技术,对各组豚鼠视网膜内Caspase-3和Bcl-2的表达进行检测.结果： 对照组Caspase-3无明显表达,损伤组在节细胞层、内核层、内界膜和外界膜等处Caspase-3表达阳性面积百分率和密度明显上调,bFGF治疗组Caspase-3表达明显降低.对照组Bcl-2在节细胞层、神经纤维层及内核层内有弱阳性表达,损伤后变化不明显,bFGF治疗组Bcl-2的表达阳性面积百分率和密度明显上调,不仅在节细胞层、内核层和外界膜,在内界膜、外网状层、外核层也有明显表达.结论： bFGF能选择性减少视网膜兴奋毒性损伤后Caspase-3的表达,增加Bcl-2的表达,bFGF抗过量谷氨酸诱导的节细胞凋亡的机制之一可能是调节Mǘller细胞及节细胞内Caspase-3和Bcl-2的表达.

基质金属蛋白酶-2与肿瘤关系的研究进展

侵袭和转移是恶性肿瘤的显著特征，肿瘤细胞外基质（ECM）的降解是肿瘤侵袭转移关键步骤之一。基质的降解主要依靠蛋白水解酶的作用。根据酶的结构和功能的特点．蛋白水解酶可分为六类：脯肽酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和基质金属蛋白酶（Matrix Metall02proteinase，简称MMP）。如今越来越多的证据表明，肿瘤细胞转移侵袭的能力与其产生或诱导金属蛋白酶类的能力密切相关。现已发现26余种金属蛋白酶．其中金属蛋白酶-2在肿瘤的浸润和转移中起了关键作用。