lncRNA MEG8通过调控miR-367-3p/PTEN介导慢性阻塞性肺疾病发展的分子机制研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)MEG8通过调控miR-367-3p/磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)介导慢性阻塞性肺疾病(COPD)发展的分子机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测16HBE细胞和COPD组织lncRNA MEG8表达水平;在香烟烟雾提取物(CSE)刺激后的16HBE细胞中过表达lncRNA MEG8及加入miR-367-3p inhibitor后同时敲减lncRNA MEG8或PTEN,采用MTT法、流式细胞术、酶联免疫吸附试验和免疫印迹法检测细胞凋亡、细胞增殖和炎症因子水平的变化;利用双荧光素酶报告系统对lncRNA MEG8、miR-367-3p、PTEN的靶向关系进行验证。结果 MEG8在CSE刺激的16HBE细胞和COPD临床组织样本中表达降低(P<0.05)。相比于CSE组,过表达MEG8后CSE刺激的16HBE细胞凋亡和炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平降低(P<0.05),促凋亡蛋白Bax、Caspase3和Cleaved-caspase3表达水平降低(P<0.05),凋亡抑制因子Bcl-2表达水平升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验验证了MEG8可靶向抑制miR-367-3p(P<0.05),同时miR-367-3p可靶向抑制PTEN的表达(P<0.05),进而抑制CSE刺激的16HBE细胞的凋亡和炎症反应(P<0.05)。在CSE刺激下,相较于Control组,加入miR-367-3p inhibitor可显著上调16HBE细胞中PTEN的蛋白表达水平(P<0.05),增强细胞增殖活性(P<0.05),减少细胞凋亡(P<0.05),显著下调促凋亡蛋白Bax、Caspase 3和Cleaved-caspase3的表达水平(P<0.05),上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.05),抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.05),随后敲降MEG8或PTEN可恢复PTEN的蛋白表达水平(P<0.05),抑制细胞增殖活性(P<0.05),逆转miR-367-3p inhibitor导致的细胞凋亡(P<0.05)以及对凋亡相关蛋白的调控作用(P<0.05),增强炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.05)。结论 MEG8通过调控miR-367-3p/PTEN轴抑制CSE刺激的16HBE细胞的凋亡和炎症反应,并可能为临床COPD的治疗提供新的治疗策略。

LncRNA MEG8靶向miR-203调控人牙周膜干细胞成骨分化的机制研究

目的:体外研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)MEG8调控人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力并探究其调控机制。方法:体外分离、纯化培养hPDLSCs,q PCR检测hPDLSCs成骨诱导前后lnc RNA MEG8和成骨相关基因Runx2、Osx、Ocn、Opn的表达改变;通过MEG8过表达及sh RNA慢病毒转染hPDLSCs并鉴定转染效率;通过Western blot检测RUNX2、OSX、OCN、OPN的表达变化,茜素红染色法检测hPDLSCs成骨诱导后钙化结节的生成情况;借助生物信息学方法分析lnc RNA MEG8的候选靶基因,并通过双荧光素酶报告实验进一步验证潜在靶基因;通过共转染miR-203 mimics和lnc RNA MEG8过表达慢病毒,分析共转染后hPDLSCs成骨分化能力的变化。结果:Runx2、Osx、Ocn、Opn成骨基因及lnc RNA MEG8的表达在hPDLSCs成骨诱导后显著上调;敲降lnc RNA MEG8可抑制hPDLSCs成骨分化并下调RUNX2、OSX、OCN、OPN蛋白的表达,而在hPDLSCs中过表达lnc RNA MEG8,则结果相反;通过相关性分析发现miR-203与lnc RNA MEG8呈负相关;进一步通过生物信息学分析lnc RNA MEG8的潜在靶基因含有miR-203,双荧光素酶报告实验验证miR-203为MEG8的靶基因;共转染实验结果发现miR-203 mimics可逆转lnc RNA MEG8对hPDLSCs成骨分化的促进作用。结论:Lnc RNA MEG8可靶向调控miR-203促进hPDLSCs成骨分化能力,提示lnc RNA MEG8可作为牙周炎的潜在干预和治疗靶点。

牛Meg8基因5′末端的克隆及生物信息学分析

利用RACE方法从奶牛中克隆得到了Meg8基因的5′端cDNA序列（GenBank登录号：HQ407410~HQ407413）,序列比对发现该基因存在4种可变剪接体。选取牛Meg8基因的5′侧翼区作为研究对象,生物信息学在线分析发现：在人、绵羊、鼠、猪、狗和马这几个物种中,牛Meg8基因5′侧翼区与绵羊相似性最高,为80.45%;该区域内存在2个SINEs、1个Si mple repeat,未发现CpG岛;可能存在2个启动子位点,位于牛Meg8基因的Exon1前3 402~4 118 bp和1 200~1 367 bp处,并富含Sp1、SRY、CdxA、GATA-1、MZF1等多个潜在的转录因子位点。Meg8基因5′侧翼区密集存在的转录因子可能与基因的转录起始有关。可变剪接体及侧翼区域的诸多转录因子可能是Meg8基因行使调控功能的原因,本研究结果将为阐明该基因的功能及其调控机理提供分子基础。

LncRNA MEG8影响结肠癌细胞恶性进展

目的探究lncRNA MEG8对结肠癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用,阐明其作用机制。方法利用实时荧光定量PCR(Real Time-Quantitative PCR,RT-qPCR)检测MEG8和miR-1827表达;Western blotting和CCK-8检测蛋白表达和细胞增殖;Transwell和流式细胞术检测细胞侵袭和凋亡;双荧光素酶报告基因试验和RNA免疫沉淀反应(RNA Immunoprecipitation,RIP)验证MEG8与miR-1827结合。结果MEG8通过结合miR-1827负调控miR-1827表达。与人正常结肠上皮细胞相比,MEG8在结肠癌细胞中表达下调,而miR-1827表达上调。过表达MEG8或干扰miR-1827抑制HT29细胞增殖和侵袭,促进凋亡。沉默miR-1827逆转干扰MEG8诱导的细胞增殖和侵袭上升,凋亡和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路活性下降。结论LncRNA MEG8通过下调miR-1827,促进ERK/JNK通路活性,阻碍结肠癌细胞HT29增殖和侵袭,促进凋亡。

牛体细胞核移植中Meg8基因DNA甲基化及印迹状态分析

为了确定Meg8基因内部CpG岛的甲基化在调控Meg8基因印记中的可能作用,本研究应用亚硫酸盐测序法分析Meg8基因内含子3上的17个CpGs位点等位基因特异的DNA甲基化状态。结果发现,2条亲本链的甲基化程度都比较高(>80%),但T链甲基化水平显著高于C链(P<0.05),并且C链只有1种甲基化模式。分析Meg8基因在出生后48h死亡的体细胞核移植牛肺中的甲基化和印迹状态,发现Meg8基因甲基化水平在核移植牛和自然繁殖牛中都比较高,但核移植牛的甲基化程度显著高于正常繁殖牛(P<0.05),并且只有1种完全甲基化的模式,而Meg8基因在核移植个体中的印记表达没有紊乱,仍表现为单等位基因表达,初步推测Meg8内含子3CpGs岛的甲基化可能没有参与调控Meg8基因的印记表达。

MEG8对阿尔茨海默病微环境下血脑屏障通透性的影响及其作用机制

目的探讨长链非编码RNA—MEG8对阿尔茨海默病(AD)微环境下血脑屏障通透性的影响及作用机制。方法应用β淀粉样蛋白(Aβ)处理人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3(AD-ECs),模拟体外AD微环境下血脑屏障。实时荧光定量PCR检测正常人脑微血管内皮细胞(ECs)和AD-ECs中MEG8的表达。稳定转染沉默MEG8质粒后,应用微孔电阻系统检测跨内皮阻抗(TEER),TMB显色法测量辣根过氧化物酶(HRP)渗出量。免疫荧光法比较对照组、转染MEG8阴性对照组(sh-NC组)、转染MEG8沉默质粒组(sh-MEG8组)紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的分布变化,Western blotting检测ZO-1和occludin的表达。结果MEG8在ADECs中的表达显著高于ECs(P<0.01)。与sh-NC组比较,sh-MEG8组TEER值显著升高,HRP渗出量显著降低(均P<0.01)。紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin在AD-ECs边界呈现相对连续的分布。与sh-NC组比较,sh-MEG8组紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达显著增加(均P<0.01)。结论MEG8在AD-ECs中表达上调,沉默MEG8表达显著降低AD微环境下血脑屏障的通透性,其作用机制可能是通过改变ZO-1和occludin的细胞分布,增加ZO-1和occludin的蛋白表达实现的。

长链非编码RNA lncRNA MEG8通过靶向miR-181a-5p调控脑胶质瘤细胞的增殖与转移潜能

目的阐明lncRNA MEG8在脑胶质瘤发生中的潜在作用和调控机制。方法公共数据库分析lncRNA MEG8在脑胶质瘤的表达量及与肿瘤预后关系, 荧光定量PCR验证lncRNA MEG8和微RNA(miRNA, miR)-181a-5p在本中心脑胶质瘤生物样本库中的表达水平。质粒和miRNA模拟物分别被转染进入脑胶质瘤细胞上调lncRNA MEG8和miR-181a-5p表达, 通过CCK-8增殖、Transwell实验、双荧光素酶报告检测lncRNA MEG8和miR-181a-5p对脑胶质瘤细胞增殖及转移能力的影响及潜在的调控机制。结果与邻近正常组织相比, lncRNA MEG8在脑胶质瘤组织中呈低表达, 其表达水平与患者的无瘤生存期密切相关。上调lncRNA MEG8的表达可显着抑制脑胶质瘤细胞的增殖能力、降低转移能力;miR-181a-5p在脑胶质瘤组织中呈高表达, 其表达水平与lncRNA MEG8呈负相关关系, 且miR-181a-5p可逆转lncRNA MEG8的抑癌功能。结论 LncRNA MEG8通过表达下调miR-181a-5p的表达水平从而抑制脑胶质瘤细胞增殖及转移能力, 是脑胶质瘤的潜在治疗靶点。

长链非编码RNA母系表达基因8靶向微小RNA-497-5p调控血管瘤血管内皮细胞的增殖和凋亡

目的探讨长链非编码RNA母系表达基因8(MEG8)靶向微小RNA(miR)-497-5p对血管瘤血管内皮细胞的增殖和凋亡的影响。方法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测河南中医药大学第一附属医院2017年1月至2018年6月收集的52例血管瘤组织和与其对应的瘤旁正常皮肤组织中MEG8和miR-497-5p的表达水平。血管瘤血管内皮细胞HemEC分为si-NC组、si-MEG8组、miR-NC组、miR-497-5p组、si-MEG8+anti-miR-NC组、si-MEG8+anti-miR-497-5p组。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法(Westernblotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)和P21、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl相关X(Bax)蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证MEG8和miR-497-5p的靶向关系。结果与瘤旁正常皮肤组织相比,血管瘤组织中MEG8表达水平[(0.82±0.08)比(0.33±0.03)]升高(P<0.05),miR-497-5p表达水平[(0.34±0.03)比(0.84±0.08)]降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-MEG8组HemEC细胞存活率[(39.61±4.06)%比(103.50±11.04)%]、cyclinD1和Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),凋亡率[(26.57±2.73)%比(8.33±0.85)%]、P21和Bax蛋白表达升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-497-5p组HemEC细胞存活率[(48.87±5.09)%比(104.11±10.64)%]、cyclinD1和Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),凋亡率[(21.26±2.45)%比(8.33±0.85)%]、P21和Bax蛋白表达升高(P<0.05)。MEG8和miR-497-5p直接特异性结合。与si-MEG8+anti-miR-NC组比较,si-MEG8+anti-miR-497-5p组HemEC细胞存活率[(86.10±8.81)%比(40.23±4.35)%]、cyclinD1和Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05),凋亡率[(15.32±1.67)%比(26.81±2.94)%]、P21和Bax蛋白表达降低(P<0.05)。结论抑制MEG8通过靶向miR-497-5p能够抑制血管瘤血管内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,进而遏制血管瘤的发生发展。