红刺老苞醇提物对MH7A细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

目的通过PI3K/Akt信号通路,探讨红刺老苞对类风湿关节炎的作用机制。方法在滑膜细胞(MH7A)中添加LPS建立类风湿关节炎(RA)模型,通过CCK-8法筛选药物浓度;实验分为空白对照组、模型组、红刺老苞高剂量组、红刺老苞中剂量组、红刺老苞低剂量组;取不同浓度的红刺老苞醇提物作用于MH7A细胞;用流式细胞术检测细胞凋亡的情况;ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-1β的水平;Western-blot法检测PI3K、p-AKT、Becline1蛋白的表达。结果经不同浓度红刺老苞醇提物(750、650、550μg/mL)处理后,细胞凋亡率随药物浓度上升而增加,凋亡率分别为(3.07±0.03)%、(5.27+0.30)%、(8.04+0.02)%;与对照组相比,模型组细胞上清中IL-1β、TNF-α含量明显升高(P<0.05),而红刺老苞高、中、低剂量组IL-1β、TNF-α水平较模型组明显降低(P<0.05);模型组PI3K、P-AKT蛋白表达较对照组相比明显升高(P<0.05),Becline1表达量降低(P<0.05);与模型组比较,红刺老苞高、中、低剂量组PI3K、p-AKT蛋白表达明显降低(P<0.05),Becline1表达量升高(P<0.05)。结论红刺老苞醇提物能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进自噬,抑制RA滑膜细胞增殖及炎性因子的表达。

枫杨提取物对MH7A细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:观察枫杨不同提取物对人类风湿关节炎成纤维滑膜细胞MH7A增殖和凋亡的影响,初步探讨其诱导MH7A细胞凋亡的可能机制。方法:制备枫杨乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物后分别作用于MH7A细胞,检测其增殖情况。取增殖抑制作用最好的提取物作用于MH7A细胞,检测其凋亡情况,Caspase-3和Caspase-9的酶活性; Cyt-C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和BAX的蛋白表达,P53、BAX、BAK、Bcl-2和Bcl-xL的mRNA表达。结果:与枫杨石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物相比,枫杨乙醇提取物可明显抑制MH7A细胞增殖,诱导其凋亡,使细胞内Caspase-3和Caspase-9的酶活性升高,Cyt-C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和BAX的蛋白表达升高,Bcl-2的蛋白表达下降; P53、BAX、BAK的mRNA表达升高,Bcl-2、Bcl-xL的mRNA表达降低。结论:枫杨乙醇提取物可明显抑制MH7A细胞增殖,诱导其凋亡,并调控Cyt-C、P53、Caspase家族、Bcl-2家族相关蛋白的表达。因此推测该提取物可能通过影响线粒体凋亡途径诱导人类风湿关节炎成纤维滑膜细胞MH7A的凋亡,抑制其增殖。

基于MH7A细胞迁移、凋亡及NLRP3炎性小体探讨金铁锁总皂苷治疗类风湿关节炎的作用机制

目的:探讨金铁锁总皂苷对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖、迁移、凋亡及相关炎性因子的影响及其机制。方法:培养MH7A细胞,给予不同浓度的金铁锁总皂苷(0.05、0.10、0.15μg/mL)干预后,采用Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测MH7A细胞凋亡;细胞划痕法测定MH7A细胞迁移;接着将细胞分为空白对照组、模型组、mcc950(1μmol/L)阳性对照组及金铁锁总皂苷各浓度(0.05、0.10、0.15μg/mL)组,采用MTS比色法检测MH7A细胞增殖;蛋白免疫印迹法、免疫荧光、q-PCR检测各组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白表达;ELISA试剂盒及q-PCR检测炎性因子IL-1β、IL-18、IL-6炎性因子的释放及mRNA表达。结果:与空白对照组比较,金铁锁总皂苷呈浓度依赖性显著升高MH7A细胞凋亡率(P<0.01);中、高浓度金铁锁能显著抑制MH7A细胞迁移(P<0.01)。与模型组比较,不同浓度金铁锁总皂苷能显著降低TNF-α导致的炎症因子IL-1β、IL-18、IL-6的释放及其mRNA表达,并能抑制TNF-α诱导的MH7A细胞内NLRP3、ASC mRNA及蛋白表达(P<0.01)。结论:金铁锁总皂苷能抑制NLRP3炎性小体激活,其机制可能与抑制MH7A细胞的增殖、迁移和诱导其凋亡有关。

梣酮对LPS介导MH7A细胞增殖和迁移的影响

目的研究梣酮对LPS介导类风湿关节炎滑膜成纤维细胞系MH7A增殖和迁移的影响。方法 MH7A细胞随机分为对照组、LPS组及梣酮低、中、高剂量组(10、20、50μmol/L),各梣酮组预给药后LPS诱导MH7A细胞24 h。然后,CCK-8法检测细胞活性,试剂盒法检测LDH释放,BrdU掺入法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移,Western blot法检测MMP1、MMP9、MMP13、p-JNK、p-STAT3蛋白表达。结果梣酮对MH7A细胞活性、LDH释放无明显影响(P>0.05)。与LPS组比较,梣酮组显著抑制细胞增殖、侵袭和迁移(P<0.05),显著降低MMP1、MMP9、MMP13、p-JNK、p-STAT3蛋白表达(P<0.05),并呈剂量依赖性。结论梣酮可抑制LPS介导MH7A细胞增殖和迁移,可能是通过调控JNK、STAT3信号通路实现的。

桔梗皂苷D对MH7A细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的:观察桔梗皂苷D(PD)对人类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞MH7A增殖和凋亡的影响及机制。方法:体外培养MH7A细胞,用不同浓度(5、10、15、20、25及30 mg/L)PD分别作用于MH7A细胞24 h,同时设置不含PDD的空白对照组,采用CCK-8实验检测PD对MH7A细胞增殖的影响;取有效增殖抑制的最低药物浓度作用于MH7A细胞,用Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞术检测PD对MH7A细胞凋亡的影响、PI单染法流式细胞术检测PD对MH7A细胞周期分布的影响、Western blotting法检测PD对MH7A细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响。结果:与空白对照组比较,PD在5 mg/L浓度以上时,随着药物浓度的增加,MH7A细胞增殖率均降低、细胞凋亡率增加、G0/G1期细胞比例增加,差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组比较,PD药物各浓度组Caspase-9蛋白和Bax蛋白相对表达量升高,以10及15 mg/L组升高显著,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);PD药物各浓度组细胞内Bcl-2蛋白相对表达量均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:PD能抑制MH7A细胞增殖和诱导其凋亡,推测其作用机制可能是将MH7A细胞阻滞在G0/G1期和调控线粒体凋亡途径相关蛋白的表达。

miR-27a通过TLR4/NF-κB信号通路对类风湿关节炎滑膜细胞生物学行为的影响

目的:探讨miR-27a通过Toll样受体(TLR)4/NF-κB信号通路对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞生物学行为的影响。方法:选择行膝关节置换术的30例RA患者(RA组)和同期因创伤急诊截肢的18例患者(对照组)的滑膜组织,采用qRT-PCR法检测miR-27a的表达。将RA成纤维样滑膜细胞MH7A分为4组:空白对照组,不进行任何处理;TNF-α组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理24 h;TNF-α+miR-NC组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理后转染miR-NC;TNF-α+miR-27a mimic组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理后转染miR-27a mimic,采用qRT-PCR法检测组织或细胞中miR-27a的表达量,CCK-8法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况,双荧光素酶报告实验验证TLR4 mRNA与miR-27a的靶向关系,Western blot法检测细胞中TLR4、NF-κB、磷酸化TLR4(p-TLR4)和磷酸化NF-κB(p-NF-κB)蛋白的表达情况。结果:对照组和RA组滑膜组织中miR-27a的表达量分别为(1.00±0.08)和(0.36±0.05),RA组低于对照组(P<0.001)。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组细胞中miR-27a表达量下降,TNF-α+miR-27a mimic组miR-27a表达量升高;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimic组细胞中miR-27a表达量升高(P<0.05)。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力增强,细胞凋亡率降低;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimic组细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力减弱,细胞凋亡率升高(P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实TLR4是miR-27a的靶基因。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组p-TLR4/TLR4、p-NF-κB/NF-κB升高;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimics组p-TLR4/TLR4、p-NF-κB/NF-κB降低(P<0.05)。结论:miR-27a可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,降低RA成纤维样滑膜细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进其凋亡。

基于NLRP3介导的细胞焦亡探讨痹通方含药血清对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞损伤的保护作用及机制

目的探讨痹通方含药血清对脂多糖(LPS)诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)的细胞焦亡的保护作用机制及对NLRP3通路的影响。方法SD大鼠随机分成3组:空白对照组,痹通方低、高剂量组分别给予4.2 g/(kg·d)、16.8 g/(kg·d)灌胃;空白对照组给予等量蒸馏水灌胃。连续灌胃10 d后制备含药血清。将细胞分为5组:空白对照组,LPS处理组,痹通方含药血清低、高剂量组,MCC950组。收集上述各组细胞,CCK8检测细胞活力,RT-qPCR检测各组细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-18、IL-1β、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、MIP-1α基因表达水平及Western blotting检测AIM2、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、cleaved-GSDMD、GSDMD、NLRP3蛋白表达。免疫荧光染色法检测NLRP3表达情况。结果与空白组比较,LPS处理组细胞活力下降(P<0.01),TNF-α、IL-18、IL-1β、MCP-1、MIP-1αmRNA表达升高(P<0.01),AIM2、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、cleaved-GSDMD、GSDMD、NLRP3蛋白表达升高(P<0.01);免疫荧光结果显示,与空白对照比较,模型组NLRP3荧光强度显著升高(P<0.01)。与LPS处理组相比,给予NLRP3抑制剂MCC950组和痹通方含药血清组均可改善上述指标变化。结论痹通方能有效抑制NLRP3炎症小体表达,减少MH7A细胞焦亡及改善炎症损伤,其机制可能与调控NLRP3通路相关。

大黄素对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞自噬的影响

目的基于cGAS/STING信号通路研究大黄素对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)自噬的潜在作用。方法采用CCK-8法检测MH7A细胞增殖的结果,并根据细胞存活率筛选出药物的浓度,并加入自噬抑制剂3-MA进一步验证大黄素对自噬的影响;采用MDC法检测MH7A细胞自噬情况;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测cGAS、STING、p-STING、LC3-I、LC3-II、P62和Beclin-1的蛋白表达水平。结果MDC染色结果提示,大黄素能够增强MH7A细胞自噬;Western blot结果提示,大黄素可降低MH7A细胞自噬相关蛋白cGAS、STING、p-STING和P62的表达,增加LC3-II和Beclin-1的表达。加入自噬抑制剂3-MA后,MH7A细胞P62蛋白表达升高,LC3-II和Beclin-1蛋白表达降低。结论大黄素可能通过下调cGAS/STING信号通路加速自噬,抑制MH7A细胞增殖。

黑骨藤中咖啡酰基奎宁酸类化合物体外抗类风湿性关节炎机制研究

目的探讨黑骨藤中分离得到的8个咖啡酰基奎宁酸类单体化合物抑制人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖的作用,并对其活性较好的2个化合物进行可能的分子机制研究。方法采用50μg·L^(-1) TNF-α活化MH7A细胞。MTS法测定8个单体化合物对MH7A细胞增殖的影响;ELISA法测定细胞上清液中IL-1β、PGE_2含量;Griess试剂法测定NO的含量;Western blot检测各组细胞中COX-2、iNOS、NF-κB及MAPK通路相关蛋白表达。结果与TNF-α模型组比较,8个单体化合物均可不同程度抑制MH7A细胞的增殖和细胞因子的分泌(P<0.05,P<0.01),在200μmol·L^(-1)浓度下,3-O-咖啡酰基奎宁酸(3-CQA)作用最明显,其次是1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸(1,3-DCQA);Western blot结果表明,3-CQA和1,3-DCQA均能明显降低COX-2、iNOS、NF-κB p65、p-IκB的蛋白水平,以及MAPK信号通路相关蛋白ERK、JNK、p38的磷酸化程度(P<0.01)。结论黑骨藤中咖啡酰基奎宁酸类化合物具有较好的抗类风湿性关节炎活性,其作用机制可能与抑制MAPK信号通路的激活,降低NF-κB活性,抑制下游炎症因子表达,进而减轻炎症反应有关。

不同产地宽叶荨麻对人类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的研究不同产地宽叶荨麻对人类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞MH7A增殖和凋亡的影响。方法分别以庄河、鲁甸、阿坝、巴株产宽叶荨麻70%乙醇提取物处理MH7A细胞,24 h后用MTT法检测细胞增殖率。通过测定DNA片段化检测细胞凋亡率。结果 4种产地的宽叶荨麻都显示了一定的抑制MH7A细胞增殖的作用。其中鲁甸产宽叶荨麻显示了较强的抑制作用,因此进一步考察了鲁甸产宽叶荨麻不同组分对MH7A细胞增殖的影响,其中经大孔吸附树脂吸附以80%EtOH-H2O洗脱部分(LD80)显示了较强的抑制MH7A细胞增殖的作用。DNA片段化分析结果表明,LD80能显著引起MH7A细胞凋亡。结论鲁甸产宽叶荨麻能够抑制MH7A细胞增殖和诱导MH7A细胞凋亡。

槲皮素对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞炎症因子和基质金属蛋白酶的表达的影响

目的探讨槲皮素对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)炎症因子和基质金属蛋白酶的表达的影响及可能机制。方法选用人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)为研究对象,TNF-α诱导MH7A细胞,用不同浓度的槲皮素干预,RT-PCR法检测对IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、MMP-13的变化的影响,Western blot法检测对NF-κB的影响。结果槲皮素浓度依赖性地降低TNF-α诱导的MH7A细胞IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、MMP-13的表达,对TNF-α诱导的MH7A细胞NF-κB的磷酸化有明显的抑制作用。结论槲皮素可有效地减轻类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞炎症因子及基质金属蛋白酶的表达,其机制可能和抑制NF-κB的表达相关,槲皮素是治疗类风湿性关节炎的潜在有效药物。

无尾果抗类风湿关节炎的有效部位筛选研究

目的观察无尾果不同提取部位对人风湿性关节炎成纤维滑膜细胞(MH7A)相关细胞因子分泌及凋亡的影响,初步筛选其抗类风湿关节炎(RA)的有效部位。方法采用肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导MH7A细胞建立类风湿关节炎滑膜细胞模型,并以无尾果总提物、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和石油醚部位进行干预。采用CCK8法检测MH7A细胞的增殖活性,并计算半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术检测MH7A细胞凋亡;ELISA法检测TNF-α诱导MH7A细胞分泌白细胞介素(IL)-6、IL-4、IL^(-1)β、血管内皮生长因子(VEGF)、NF-κB受体活化因子配体(RANKL)水平;Western Blot法检测MH7A细胞的凋亡相关蛋白表达水平。结果无尾果总提物、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和石油醚部位对MH7A细胞的IC_(50)值分别为223.9、99.4、123.7、497.9、>1000μg·m L^(-1)。与正常对照组比较,模型组细胞上清液中的IL-6、IL^(-1)β、IL-4、VEGF和RANKL含量显著升高(P<0.01),凋亡细胞显著增多(P<0.01),促调亡因子Bax、Caspase-9、Caspase-3和抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,无尾果总提物组、水部位组和正丁醇部位组均可显著诱导MH7A细胞凋亡(P<0.01);显著降低IL-6、IL^(-1)β、VEGF和RANKL水平(P<0.01),升高IL-4水平(P<0.01);水部位组和正丁醇部位组能明显上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-9和Caspase-3的表达(P<0.01),抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.01)。结论无尾果提取物诱导MH7A细胞凋亡及抗炎作用可能是其抗RA的机制之一,水部位和正丁醇部位为其主要药效部位。

响应面法优化鹿筋蛋白提取工艺及体外抗类风湿性关节炎活性

目的:优化鹿筋蛋白提取工艺,探究其对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖及炎症因子分泌的影响。方法:以料液比、提取温度、提取时间为自变量,鹿筋蛋白含量为因变量,进行单因素实验,结合Box-Behnken试验设计,获得鹿筋蛋白最佳提取工艺。采用60 ng/mL肿瘤坏死因子-α(TNF-α)体外诱导MH7A细胞,MTT法测定不同浓度的(25、50、100、200μg/mL)鹿筋蛋白对MH7A细胞增殖抑制活性的影响;酶联免疫法测定细胞上清液中NO(一氧化氮)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α含量。结果:鹿筋蛋白最佳提取条件为料液比1∶21 g/mL、提取温度88℃、提取时间8.6 h,此条件下测得鹿筋蛋白含量为12.53%。体外活性实验结果表明,与模型组比较,不同浓度(25、50、100、200μg/mL)的鹿筋蛋白均可显著(P<0.05)抑制MH7A细胞的增殖和NO、IL-6、TNF-α的释放(P<0.05),模型组的NO、IL-6、TNF-α释放量分别为:4.07、21.95、16.31 pg/mL,在100μg/mL质量浓度下,鹿筋蛋白对上述三种炎症因子释放的抑制作用最显著(P<0.05),其释放量分别为:1.60、13.60、7.29 pg/mL。结论:鹿筋蛋白通过抑制TNF-α诱导的MH7A细胞增殖,同时减少炎症因子NO、IL-6、TNF-α的释放,发挥其抗类风湿性关节炎的作用。本研究为研究鹿筋蛋白的制备工艺提供参考,并证明鹿筋蛋白具有较好的体外抗类风湿性关节炎活性。

宽叶荨麻中化学成分对MH7A细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨从具有抗类风湿关节炎作用的宽叶荨麻中分离到的9个化学成分对人类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞MH7A增殖的影响。方法:分别以从宽叶荨麻中分离得到的9个化学成分(0～400 mg.L-1):RoseosideⅡ(C1),(6S,9R)-3-氧-α-紫罗兰醇-β-D-葡萄糖苷(C2),(6R,9R)-3-氧-α-紫罗兰醇-β-D-葡萄糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷(C3),芹菜素-6,8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(C4),木樨草素-7-O-新橙皮糖苷(C5),木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(C6),芦丁(C7),异落叶松脂素-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(C8),5α,6β-二羟基-胡萝卜苷(C9)处理MH7A细胞(2.5×104/mL),24 h后采用MTT法检测细胞增殖率,并通过测定DNA片段化检测细胞凋亡率。结果:在被检测的9个化合物中,化合物5α,6β-二羟基-胡萝卜苷显示了较强的抑制MH7A细胞增殖的作用,其IC50值为140 mg.L-1。DNA片段化分析结果表明,其能显著诱导MH7A细胞凋亡。结论:宽叶荨麻中化学成分5α,6β-二羟基-胡萝卜苷能够显著抑制MH7A细胞增殖并能诱导MH7A细胞凋亡。

附子汤对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞MH7A增殖和miR-155表达的影响

目的:观察附子汤对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞MH7A增殖的影响,研究附子汤对miR-155表达的影响并进一步探讨其抗类风湿性关节炎的作用机制。方法:体外培养MH7A细胞,设空白组、附子汤高剂量组(25 g·L^(-1))、低剂量组(12.5 g·L^(-1))和硫酸羟氯喹阳性药组(0.00625 g·L^(-1)),采用细胞增殖与活性检测(CCK-8)试剂盒法检测细胞增殖,流式细胞术检测MH7A细胞周期的改变;应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测药物处理后miR-155及其下游基因含SH2结构域的肌醇5-磷酸酶-1(SHIP-1)、蛋白激酶B3(Akt3)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Akt3和mTOR的蛋白表达。结果:附子汤体外在质量浓度6.25 g·L^(-1)以上时,能明显抑制MH7A增殖,且呈明显的量-效关系和时-效关系。与空白组比较,附子汤高、低剂量组G2/M期细胞比例均明显增加(P<0.05),高剂量组G0/G1期细胞比例明显降低(P<0.05),其细胞周期的阻滞作用呈明显的量效关系。与空白组比较,附子汤高、低剂量组miR-155的表达均明显下调(P<0.05);附子汤高剂量组SHIP1 mRNA表达明显上调、Akt3 mRNA表达明显下调(P<0.05),附子汤高、低剂量组mTOR mRNA表达均明显下调(P<0.05)。与空白组比较,附子汤高、低剂量组的PI3K、Akt3和mTOR的蛋白表达均明显下调(P<0.05)。结论:附子汤对MH7A细胞增殖具有显著的抑制作用,作用机制与下调miR-155的表达,从而促进SHIP-1的表达,抑制其下游PI3K/Akt3/mTOR信号通路的基因表达有关。

甘草查尔酮A通过调控MAPK信号通路抑制MH7A细胞增殖并诱导凋亡

目的:探讨甘草查尔酮A(licochalcone A,LCA)对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖和凋亡以及相关炎性因子的影响,并揭示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与LCA调控MH7A细胞增殖和凋亡的关系。方法:培养MH7A细胞,将细胞分为空白组,LCA各浓度给药组(10,20,40μmol·L^-1);采用噻唑蓝(MTT)比色法和DAPI染色检测MH7A细胞增殖情况;PI染色和流式细胞仪检测MH7A细胞周期,Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测MH7A细胞凋亡情况。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测LCA对炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测LCA对MAPK信号通路关键蛋白的影响,同时应用细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂PD98059处理,观察磷酸化(p)-ERK和IL-1β蛋白表达水平。结果:与空白组比较,LCA能剂量依赖性抑制MH7A细胞增殖,活细胞数量显著减少(P<0.01),而进入细胞周期早期凋亡的细胞数量显著增多(P<0.01)。此外,与肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10μg·L^-1)组比较,LCA能剂量依赖性逆转TNF-α导致的炎症因子IL-1βmRNA表达的升高(P<0.01)。与空白组比较,LCA能剂量依赖性的促进MAPK信号通路中关键蛋白ERK,氨基末端激酶(JNK)和p38的磷酸化表达(P<0.01)。与PD98059组比较,ERK的剂量依赖性磷酸化作用被抵消,同时LCA 10,20μmol·L^-1对IL-1β的抑制作用消失。结论:LCA能抑制MH7A细胞增殖和诱导其凋亡,可能与其促进MAPK通路相关蛋白磷酸化的表达继而抑制炎症因子的表达有关。

紫草素对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞功能的影响

为了观察紫草素对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移、黏附和侵袭能力影响,并从蛋白激酶B(Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路探索其作用机制,该实验采用TNF-α(20 ng·mL-1)体外诱导RA患者成纤维样滑膜细胞系(MH7A),加入不同浓度紫草素(0.025,0.05,0.1 pmol·L^-1)作用后,分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法、划痕试验、黏附试验及Transwell侵袭试验检测MH7A细胞的增殖活性以及迁移、黏附和侵袭能力,蛋白免疫印迹法检测MH7A细胞中Akt和MAPK信号通路分子的蛋白表达水平。结果显示,与对照组相比,TNF-α能明显诱导MH7A细胞的增殖、迁移、黏附和侵袭能力,升高Akt,c-Jun氨基末端激酶(JNK),p38及细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平;与TNF-α组相比,紫草素作用24 h对TNF-α诱导的MH7A细胞增殖活性没有明显影响,作用48 h能浓度依赖地降低TNF-α诱导增加的MH7A细胞增殖活性,作用24 h内还能显著降低TNF-α诱导异常升高的MH7A细胞迁移、黏附、侵袭能力及Akt,JNK,p38,ERK的磷酸化水平。这些结果提示紫草素可降低TNF-α诱导异常升高的MH7A细胞增殖、迁移、黏附和侵袭能力,其机制可能与下调Akt和MAPK信号通路的活化相关。

风湿祛痛胶囊对TNF-α诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞功能的影响

目的:研究风湿祛痛胶囊(FSQTC)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞增殖、迁移、黏附、侵袭和分泌功能的影响。方法:TNF-α(20μg·L^(-1))体外诱导RA患者成纤维样滑膜细胞(MH7A),加入不同浓度FSQTC(0. 02,0. 1,0. 5μg·L^(-1))作用后,分别采用噻唑蓝(MTT)比色法,转移小室(transwell)迁移、黏附及侵袭实验检测MH7A细胞的增殖活性、迁移、黏附及侵袭能力,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞上清中白细胞介素(IL)-1β及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的含量。结果:与空白组比较,TNF-α(20μg·L^(-1))能显著增加MH7A细胞的增殖、迁移、黏附、侵袭能力及分泌IL^(-1)β和VEGF的含量(P <0. 01);与TNF-α组比较,FSQTC(0. 02,0. 1,0. 5μg·L^(-1))作用24 h对TNF-α诱导的MH7A细胞增殖活性没有明显影响,作用48 h能浓度依赖地降低TNF-α诱导增加的MH7A细胞增殖活性(P <0. 05,P <0. 01),作用24 h还能显著降低TNF-α诱导升高的MH7A细胞迁移、黏附、侵袭能力及分泌IL^(-1)β和VEGF的含量(P <0. 05,P <0. 01)。结论:FSQTC可降低MH7A细胞增殖、迁移、黏附、侵袭及分泌IL^(-1)β和VEGF的能力。

基于血清药理学和血清药物化学研究红禾麻治疗类风湿性关节炎的潜在药效物质基础

该文主要基于血清药理学和血清药物化学研究红禾麻治疗类风湿性关节炎的潜在药效物质基础。首先采用血清药理学研究方法,体外培养人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A),用50 ng·mL的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理细胞,考察红禾麻含药血清对MH7A细胞增殖抑制率及前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)炎症因子分泌的影响。采用血清药物化学研究方法,以建立红禾麻提取物UHPLC-Q-TOF-MS指纹图谱为基础,对比红禾麻提取物、含药血清及空白血清的指纹图谱,寻找红禾麻体内的移行成分。同时运用谱效关系分析法,将含药血清图谱(指纹图谱特征峰峰面积)与效(含药血清的药效数据)进行相关性分析,从含药血清中筛选出红禾麻抗类风湿性关节炎的药效物质基础。结果发现红禾麻含药血清能够有效显著抑制TNF-α活化的MH7A细胞增殖并显著降低炎症因子PGE2、IL-6及IL-1β的分泌,具有治疗类风湿性关节炎的作用。30个体内移行成分在红禾麻含药血清中被检测到,其中有8个成分被确定是以原型入血,分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷,谱效关系分析显示,其中有12个特征峰(3、7、8、14、18、19、21、23、24、m6、m7、m15号)与药效有显著关联,新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸等对治疗类风湿性关节炎活性的贡献较大。该文初步阐明了红禾麻治疗类风湿性关节炎的药效物质基础,为揭示红禾麻抗类风湿性关节炎作用的物质基础奠定理论和实验基础。