miR-1-3p通过调控STC2抑制人食管鳞状细胞癌细胞的恶性生物学行为

目的探讨miR-1-3p对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞的恶性生物学行为的影响及其可能的作用机制。方法利用基因表达数据库(GEO)筛选ESCC中差异表达的miRNA。采用qRT-PCR检测人ESCC细胞KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE510和Eca109及正常食管上皮细胞HET-1A中miR-1-3p的表达水平。CCK-8试剂盒、划痕愈合和Transwell实验以及流式细胞术分别检测转染miR-1-3p mimic对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡能力的影响。使用生物信息学工具预测miR-1-3p的靶基因,Kaplan-Meier法分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中STC2表达水平与患者预后的关系。采用FISH检测miR-1-3p的亚细胞定位,双荧光素酶报告基因验证miR-1-3p与STC2的靶向关系。RNA免疫沉淀(RIP)实验检测miR-1-3phe STC2的结合。Western blot法检测转染miR-1-3p mimic对ESCC细胞中STC2及内质网应激相关蛋白p-PERK、p-eIF2α、ATF4表达水平的影响。CCK-8、划痕愈合、Transwell实验和流式细胞术分别检测过表达和敲低STC2对ESCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的影响。结果ESCC细胞中miR-1-3p的表达水平均低于HET-1A细胞(均P<0.05),转染miR-1-3p mimic可抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),促进ESCC细胞凋亡(均P<0.001)。生物信息学工具预测miR-1-3p的靶基因为STC2,ESCC组织中STC2的表达水平高于正常食管上皮组织,与预后呈负相关(均P<0.05)。miR-1-3p位于胞质,并可直接与STC2 mRNA结合。转染miR-1-3p mimic可下调STC2、p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白的表达水平(均P<0.05)。过表达STC2可促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),抑制ESCC细胞凋亡(均P<0.05)。敲低STC2可抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),促进ESCC细胞凋亡(均P<0.05)。结论miR-1-3p通过靶向调控STC2抑制ESCC细胞的恶性生物学行为,促进ESCC细胞凋亡,可能是通过抑制内质网应激发挥作用。

miR-141-3p对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的抑制和改善作用

背景:研究表明,胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子有抑制纤维环细胞凋亡的作用。miR-141-3p微小RNA在骨髓基质细胞中随着年龄的增加而增加,且与炎症信号通路的活化存在一定关系,提示其可能成为腰椎间盘突出症的治疗靶点。目的:探究miR-141-3p通过调控胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的影响。方法:选取50只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常组、模型组、miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组、miR-141-3p mimics组,每组10只。除正常组外,其余大鼠采用自体髓核移植法进行腰椎间盘突出症建模。建模成功后,对miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组和miR-141-3p mimics组大鼠鞘内分别注射10μL 20μmol/L miR-NC,miR-141-3p inhibitor,miR-141-3p mimics,均每天注射1次,连续注射28 d;正常组、模型组同期同位置注射同体积生理盐水。采用热缩足潜伏期阈值评价大鼠下肢疼痛,实时荧光定量PCR检测背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达,ELISA法检测背根神经节组织炎症因子,免疫印迹法检测背根神经节组织胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子蛋白表达,并分析miR-141-3p与胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子的相关性。结果与结论:miR-NC组各项指标与模型组比较,差异均无显著性意义。①大鼠热缩足潜伏期阈值:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。②背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。③背根神经节组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素1含量:模型组明显高于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显高于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显低于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。④背根神经节组织胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子蛋白表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。⑤胰岛素样生长因子1与miR-141-3p呈正相关(r=0.904,P<0.001),血小板源性生长因子与miR-141-3p呈正相关(r=0.879,P<0.001)。⑥结论:miR-141-3p可显著改善腰椎间盘突出症大鼠下肢疼痛,抑制背根神经节炎症,其机制可能与促进胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子表达有关。

安罗替尼通过调控miR-16-5p/PD-1轴抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖并促进凋亡

目的 探讨安罗替尼对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 将非小细胞肺癌细胞系A549和H1299分别采用安罗替尼、miR-16-5p激动剂和/或PD-1过表达载体进行处理。CCK-8实验和EDU实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-16-5p相对表达量;Western blot检测程序性细胞死亡-1蛋白(PD-1)的表达。双荧光素酶报告实验确定miR-16-5p和PD-1的靶向关系。用A549细胞构建裸鼠成瘤模型,检测安罗替尼对体内肿瘤生长的影响。结果 安罗替尼在A549和H1299细胞中以剂量依赖的方式显著增加miR-16-5p表达,同时降低PD-1表达,并且抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p过表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p能靶向PD-1,且负调控PD-1表达。siRNA下调PD-1表达后明显抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡(P<0.05)。过表达PD-1则可逆转安罗替尼介导的miR-16-5p对A549和H1299细胞的促增殖和抗凋亡作用(P<0.05)。体内实验证实,安罗替尼能够明显抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论 安罗替尼可有效抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,减少体内肿瘤生长,其作用机制与miR-16-5p/PD-1信号轴相关。

水飞蓟素通过调控miR-124-3p/WEE1轴影响胶质瘤细胞恶性生长的机制研究

目的探讨水飞蓟素(SM)对胶质瘤细胞恶性生长的影响以及对miR-124-3p/WEE1轴的调控机制。方法将胶质瘤U87细胞分为对照组,SM低、中、高浓度组,SM高浓度+miR-124-3p抑制剂组(SM高+miR-124-3p inhibitor组)。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blotting检测细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及凋亡相关蛋白的表达,实时定量PCR检测细胞中miR-124-3p和WEE1 mRNA水平,荧光素酶活性实验验证miR-124-3p和WEE1之间的靶向关系,建立NOD/SCID小鼠颅内移植瘤模型并进行给药和分析。结果与对照组比较,不同浓度SM处理组的细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数、cyclin D1蛋白表达、WEE1 mRNA表达水平降低,G0/G1周期细胞数、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及miR-124-3p表达升高(P<0.05);进一步转染miR-124-3p inhibitor后发现,SM对胶质瘤细胞恶性行为的抑制作用被逆转。小鼠体内实验显示,SM处理组肿瘤的质量和体积均低于模型组(P<0.05),且小鼠体质量无显著变化(P>0.05)。结论SM可通过上调miR-124-3p靶向下调WEE1抑制胶质瘤细胞的恶性生长。

冠心病患者血清VCAM-1、miR-145、Gal-3、SFRP5水平变化

目的探讨冠心病患者血清血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、miR-145、半乳糖凝集素-3(Gal-3)、分泌型卷曲蛋白5(SFRP5)水平变化及意义。方法选取冠心病患者80例为冠心病组,另收集健康志愿者40名为健康对照组。采集清晨空腹肘静脉血,酶联免疫吸附法测定血清VCAM-1、Gal-3、SFRP5浓度;RT-PCR检测血清miR-145表达水平。根据冠脉造影检查诊断的病变支数分为单支病变、双支病变、多支病变。收集两组受试者人口学特征及冠心病患者实验室指标;进行1 a随访,记录不良预后发生情况(病情加重再入院、死亡)。结果冠心病组患者血清VCAM-1、Gal-3水平明显高于健康对照组,miR-145、SFRP5水平明显低于健康对照组(均P<0.01)。急性心肌梗死组患者血清VCAM-1、Gal-3水平明显高于不稳定型心绞痛组、稳定型心绞痛组患者,血清miR-145、SFRP5水平明显低于不稳定型心绞痛组、稳定型心绞痛组患者(均P<0.05)。多支病变患者血清VCAM-1、Gal-3水平明显高于双支病变和单支病变患者,血清miR-145、SFRP5水平明显低于双支病变和单支病变患者(均P<0.05)。预后不良组患者血清VCAM-1、Gal-3水平明显高于预后良好组患者,miR-145、SFRP5水平明显低于预后良好组患者(均P<0.01)。VCAM-1、miR-145、Gal-3、SFRP5水平是冠心病患者预后的独立影响因素;ROC曲线分析显示,血清VCAM-1、miR-145、Gal-3、SFRP5水平联合检测对冠心病患者预后具有较高的预测价值(AUC=0.928)。结论冠心病患者血清VCAM-1、Gal-3水平高表达,miR-145、SFRP5水平低表达,且与冠心病分类、冠脉病变支数密切相关,联合检测对预后具有较高的预测价值。

miR-155通过SOCS1/STAT3途径调控类风湿性关节炎中炎症反应和Th17/Treg失衡

目的在类风湿性关节炎(RA)中探究miR-155和细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)的表达及作用机制。方法采用RT-PCR和流式细胞术检测miR-155和Th17、Treg细胞在RA患者(RA组)和对照组(HC组)外周血中的表达差异;生物信息学和双荧光素酶基因报告实验检测miR-155和SOSC1的调控关系;分离RA患者外周CD4^(+)T细胞,将沉默miR-155与SOCS1表达的miR-155 inhibitor和si-SOCS1及各自的阴性对照序列分别或联合转染入CD4+T细胞中,并将细胞分为:miR-NC组、miR-155 inhibitor组、miR-155 inhibitor+si-NC组和miR-155 inhibitor+si-SOCS1组。使用Th17诱导分化液处理上述细胞后,采用流式细胞术检测各组CD4+T细胞中Th17比率,Western blot实验检测细胞中p-STAT3/STAT3比值。结果与HC组相比,RA患者中miR-155、Th17比率升高(P<0.01),Treg细胞比率降低(P<0.01);miR-155可靶向抑制SOCS1表达。与miR-NC组相比,miR-155 inhibitor组、miR-155 inhibitor+si-NC组和miR-155 inhibitor+si-SOCS1组中Th17比率、p-STAT3/STAT3比值均降低(P<0.01);与miR-155 inhibitor组相比,miR-155 inhibitor+si-SOCS1组CD4^(+)T细胞中Th17比率、p-STAT3/STAT3比值均升高(P<0.05)。结论在RA患者中表达升高的miR-155可能通过SOCS1/STAT3途径来介导CD4^(+)T细胞的Th17分化,从而参与RA患者外周Th17/Treg细胞失衡。

miR-141-3p靶向调控HMGB1对LPS诱导的A549细胞损伤的影响

目的探讨miR-141-3p通过靶向调控高迁移率族蛋白1(HMGB1)对脂多糖(LPS)诱导的A549细胞损伤的影响。方法以Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象,将miR-141-3p mimics、mimics NC、HMGB1基因过表达质粒(pcDNA3.1-HMGB1)和空载质粒(Vector)分别或共转染至A549细胞中,再采用10μg/ml LPS处理24 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞增殖活性;比色法检测各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞中白介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p与HMGB1之间的靶向调控关系。结果LPS干预后,A549细胞增殖活性及细胞中miR-141-3p表达水平降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及上清液中LDH活性升高(P<0.05)。过表达miR-141-3p可增强LPS处理后的A549细胞增殖活性(P<0.05),降低细胞凋亡率及细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和上清液中LDH活性(P<0.05)。然而,HMGB1基因过表达可逆转miR-141-3p对LPS诱导A549细胞损伤的改善作用。双荧光素酶报告基因实验证实,HMGB1是miR-141-3p下游靶基因。结论miR-141-3p可抑制LPS诱导的A549细胞凋亡,降低炎症因子表达水平,改善A549细胞损伤,其作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。

过表达miR-124-1基因的骨髓间充质干细胞外泌体调控小胶质细胞M2型极化对脑卒中的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)外泌体(exosomes,Exo)过表达miR-124-1基因(Exo/124-1)调控小胶质细胞(microglia,MG)的M2型极化对脑卒中的影响。方法分离培养大鼠BMMSCs,收集其Exo(BMMSCs-Exo),采用流式细胞术、Western blot与透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分别对其进行检测鉴定。30只大鼠简单随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、Exo移植组(Exo组)、空病毒(Empty lentivirus,Elv)转染Exo移植组(Exo-Elv组)及Exo/124-1移植组(Exo/124-1组),每组6只。Sham组仅行假手术,其余各组均复制大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)模型。模型复制1 d与14 d后,各移植组动物于右侧脑室植入相应移植物,Sham组、模型组注入相同剂量生理盐水作对照。术后2 h及1、3、7、14、21、28 d,分别对各组动物行改良神经系统严重程度评分(modified neurological severity scores,mNSS)。三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色检测其梗死体积。在基因与蛋白水平分别检测各组28 d脑组织MG的M1型分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]、M2型分子(CD206)的表达情况。结果成功获取并鉴定了BMMSCs及其Exo。Exo/124-1显著表达miR-124-1。所有动物(假手术组除外)术后出现神经功能缺损。术后7~28 d,Exo/124-1组的mNSS明显低于MCAO/R组(P<0.05)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01);术后28 d,Exo/124-1组的脑梗死体积、TNF-α的表达明显小于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01),CD206的表达显著高于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01)。结论BMMSCs-Exo携带miR-124-1基因可能调控MG的M2型极化,抑制M1型介导的炎症反应,促进脑卒中大鼠神经功能的恢复。

miR-19b-3p靶向IGF-1参与绒毛膜癌发生发展的机制研究

目的探究miR-19b-3p靶向胰岛素样生长因子-1(IGF-1)参与绒毛膜癌增殖、侵袭和转移的机制。方法以人绒毛膜癌细胞系JEG-3为研究对象,A组:miR-19b-3p mimics组,B组:miR-19b-3p mimics NC组,C组:miR-19b-3p inhibitor组,D组:miR-19b-3p inhibitor NC组,E组:空白对照组。A组、B组、C组、D组按照分组情况进行相应转染,E组不做任何处理。分别用Real-time PCR和Western blot检测五组miR-19b-3p RNA和IGF-1蛋白表达水平,采用CCK-8法测定细胞增殖,采用划痕实验和Transwell小室侵袭实验测定细胞迁移和侵袭能力,并进行比较;采用双荧光素酶(Dualluciferase)报告实验验证miR-19b-3p对IGF-1的靶向关系。结果与E组的(0.98±0.13)相比,A组miR-19b-3p mRNA表达水平(2.23±0.16)明显上调,C组miR-19b-3p mRNA表达水平(0.73±0.08)明显下调(P<0.05)。与E组的(1.03±0.03)nmol/L相比,A组IGF-1蛋白表达水平(1.48±0.12)nmol/L明显上调,C组IGF-1蛋白表达水平(0.76±0.05)nmol/L明显下调(P<0.05)。72 h时,与E组的(5.03±0.14)%相比,A组细胞增殖活力(10.34±0.87)%明显增加,C组细胞增殖活力(2.42±0.13)%明显下调(P<0.05);与E组的(1.09±0.07)mm相比,A组细胞划痕迁移距离(1.45±0.08)mm明显增加,C组细胞划痕迁移距离(0.73±0.07)mm明显减少(P<0.05)。与E组的(103.00±7.00)个相比,A组侵袭细胞数(173.00±4.00)个明显增加,C组侵袭细胞数(82.00±1.00)个明显减少(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示:miR-19b-3p转染WT-IGF-1的细胞荧光素酶活性(0.57±0.08)Kat低于miR-NC的(0.95±0.06)Kat(P<0.05);miR-19b-3p转染MUT-IGF-1的细胞荧光素酶活性(0.98±0.05)Kat与miR-NC的(0.96±0.06)Kat比较无明显差异(P>0.05)。结论miR-19b-3p靶向上调IGF-1促进绒毛膜癌JEG-3细胞增殖、侵袭、迁移。

miR-132-3p/CAMTA1对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠施万细胞的调控作用

目的探讨miR-132-3p通过钙调素结合转录因子1(CAMTA1)对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠(FNI)中施万细胞的调控作用。方法用I-125粒子辐射大鼠施万细胞,并在细胞中转染miR-132-3p mimic、miR-132-3p inhibitor以及sh-CAMTA1。免疫荧光检测S100B和β-TubulinⅢ荧光强度。RT-qPCR检测miR-132-3p的表达,Western blot检测CAMTA1蛋白表达。EdU染色评估细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。同时,构建FNI大鼠模型并在大鼠面部植入I-125粒子,HE、LFB染色以及IF染色评估大鼠面神经组织的病理损伤。StarBase v2.0数据库和双荧光素酶报告实验验证miR-132-3p和CAMTA1的靶向关系。结果S100B和β-TubulinⅢ在大鼠施万细胞中显著表达。I-125粒子辐射组中miR-132-3p表达降低(P<0.001),抑制细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.001)。过表达miR-132-3p或敲降CAMTA1显著促进施万细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.05),敲降miR-132-3p则具有相反的作用。机制研究显示,miR-132-3p靶向负调控CAMTA1。体内实验结果显示,过表达miR-132-3p通过抑制CAMTA1的蛋白表达,减弱I-125粒子对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。结论过表达miR-132-3p抑制CAMTA1的表达,促进施万细胞的增殖和迁移,抑制I-125对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。

NONHSAT248596.1内源性竞争miR-146a-5p调控骨关节炎软骨退变的机制

背景:目前已有针对lncRNA\miRNA\mRNA的共表达网络对骨关节炎发生发展调控机制的研究,课题组前期研究已通过数据库筛选出符合条件的NONHSAT248596.1和miR-146a-5p,尚缺乏体内实验来验证上述调控机制。目的:探究NONHSAT248596.1在基质细胞衍生因子1/4型趋化因子受体轴介导体内骨关节炎软骨退变进程中对miR-146a-5p发挥的竞争性内源性RNA调控作用。方法:取36只新西兰兔,通过向右侧后肢膝关节注射基质细胞衍生因子1溶液建立骨关节炎模型,采用随机数字表法分4组,lncRNA组、miRNA组、ceRNA组、对照组分别向造模膝关节内注射NONHSAT248596.1过表达的慢病毒载体、miR-146a-5p过表达的慢病毒载体、miR-146a-5p+NONHSAT248596.1过表达的慢病毒载体及空慢病毒载体。造模第4,8,12周,取膝关节软骨组织和软骨下骨组织进行相关检测。结果与结论:①苏木精-伊红与番红O固绿染色显示,4组软骨组织都有不同程度的退变表现,造模第4周时,lncRNA组软骨组织中的软骨细胞肿胀、细胞极性消失,细胞外基质破坏,出现表层糜烂、裂缝形成和软骨组织局部或全层缺失,并随时间延长软骨损伤程度逐渐加重,4组中miRNA组关节软骨炎症进展最缓慢;②qRT-PCR检测显示,相同时间点下,lncRNA组软骨组织中NONHSAT248596.1、4型趋化因子受体、基质金属蛋白酶3,9及13的mRNA表达量高于其他3组(P<0.05),miR-146a-5p、聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的mRNA表达量低于其他3组(P<0.05);造模后第8,12周,miRNA组软骨组织中的NONHSAT248596.1、4型趋化因子受体、基质金属蛋白酶3,9及13的mRNA表达量低于ceRNA组、对照组(P<0.05),miR-146a-5p、聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的mRNA表达量高于ceRNA组、对照组(P<0.05);③Western Blot检测显示,相同时间点下,lncRNA组软骨组织中的聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白表达量始终低于其他3组(P<0.05);miRNA组造模后第8,12周软骨组织中的聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白表达量高于ceRNA组、对照组(P<0.05);④结果表明,miR-146a-5p作为NONHSAT248596.1的作用靶点会受到其竞争性内源性RNA的作用造成活性被抑制,NONHSAT248596.1作用于miR-146a-5p后调控基质细胞衍生因子1/4型趋化因子受体轴,影响骨关节炎软骨组织中基质金属蛋白、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达,造成细胞外基质的降解及蛋白多糖的丢失。

LINC00240调节miR-124-3p/UHRF1轴对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨LINC00240调节miR-124-3p/环指域泛素样蛋白1(UHRF1)轴对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法qRT-PCR检测食管鳞状癌(ESCC)组织与癌旁组织,ESCC细胞系(ECA109、TE-13、EC9706和KYSE-150)与正常食管上皮HET-1A细胞中LINC00240、miR-124-3p、UHRF1 mRNA表达水平;以ECA109细胞为研究对象,分组分别为shRNA-NC组(转染shRNA阴性对照)、sh-LINC00240组(转染LINC00240 shRNA)、sh-LINC00240+miR-124-3p-inhibitor组(共转染sh-LINC00240与miR-124-3p-inhibitor)、sh-LINC00240+inhibitor-NC组(共转染sh-LINC00240与inhibitor-NC),并以未经处理的ECA109细胞为对照组,Western Blot检测P21、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、UHRF1蛋白表达;CCK-8检测细胞增殖;Transwell检测细胞侵袭及迁移;双荧光素酶验证miR-124-3p与LINC00240、UHRF1关系。通过裸鼠注射ECA109细胞建立裸鼠移植瘤实验,单细胞悬液(4×10^(6)细胞/ml)用一次性无菌注射器皮下注射到裸鼠背部,并依次分为模型组、NC组、干扰LINC00240组,分离肿瘤,分析肿瘤质量及成瘤个数。结果ESCC组织及细胞中LINC00240、UHRF1 mRNA表达显著增加,miR-124-3p表达显著降低(P<0.05)。sh-LINC00240组增殖率、侵袭与迁移数、LINC00240、MMP-2、UHRF1 mRNA及蛋白表达较对照组、shRNA-NC组显著降低,P21、miR-124-3p表达显著增加(P<0.05);sh-LINC00240+miR-124-3p-inhibitor组增殖率、侵袭与迁移数、MMP-2、UHRF1 mRNA及蛋白表达较sh-LINC00240+inhibitor-NC组显著增加,P21、miR-124-3p表达显著降低(P<0.05),LINC00240表达差异无统计意义(P>0.05)。miR-124-3p与LINC00240、UHRF1具有靶向关系。干扰LINC00240组较模型组、NC组肿瘤质量、成瘤个数显著减少(P<0.05)。结论干扰LINC00240可抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭,可能与上调miR-124-3p/UHRF1轴有关。

miR-10b通过激活KLF4/Notch-1/STAT3信号途径加速腹主动脉瘤的进展

目的:miR-10b促进动脉瘤的进展但其机制未明确,本实验通过检测miR-10b对KLF4/Notch-1/STAT3途径的影响阐明其机理。方法:双荧光素酶实验验证miR-10b的靶基因。取20只apoE-/-小鼠构建腹主动脉瘤模型,其中10只尾静脉注射miR-10b过表达的慢病毒,分别记为模型组和miR-10b组。另取10只apoE-/-小鼠作为假手术组,28 d后解剖小鼠腹主动脉行病理学染色、Western-blot实验。将血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用后的THP-1巨噬细胞根据是否转染miR-10b mimic及其Nc对照、是否添加抑制剂分组:(1)Nc组;(2)miR-10b mimic组;(3)Nc+KLF4抑制组;(4)miR-10b mimic+KLF4抑制组;(5)Nc+Notch-1抑制组;(6)miR-10b mimic+Notch-1抑制组;(7)Nc+STAT3抑制组;(8)miR-10b mimic+STAT3抑制组,检测细胞内蛋白水平。结果:检测双荧光素酶活性得知miR-10b可靶向作用于基因KLF4。小鼠血管病理实验发现,与正常小鼠相比,动脉瘤模型小鼠的血管明显增粗、组织结构异常,miR-10b可加重血管病变;CD68+巨噬细胞、蛋白Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9在假手术组、模型组与miR-10b逐渐增多,而α-SMA、蛋白KLF4逐渐减少。(1)、(2)两组细胞间,后者KLF4表达较少、而Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9表达显著偏多;KLF4抑制剂抑制KLF4表达,而Notch-1显著增多;Notch-1被抑制而减少表达,p-STAT3也随之减少;p-STAT3被抑制表达,MMP-2与MMP-9表达量也明显降低。结论:miR-10b通过作用于KLF4/Notch-1/STAT3信号途径,引起动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9表达增加,从而加速动脉瘤的进程。

miR-126-3p.1通过SLC7A5调控间变性甲状腺癌细胞糖酵解的作用机制

目的 探讨miR-126-3p.1对间变性甲状腺癌(ATC)细胞糖酵解的作用,并分析其潜在的机制。方法 通过TCGA数据库检索miR-126-3p.1在甲状腺癌中的表达及与甲状腺癌诊断、预后的关系。运用荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)实验检测人正常甲状腺细胞Htori-3、人间变性甲状腺癌细胞SW1736、人乳头瘤状甲状腺癌细胞TPC-1中miR-126-3p.1、溶质运载家族7成员5(SLC7A5)的表达;将TPC-1细胞分为agomiRNA(转染agomiRNA)组、agomiR-126-3p.1(转染agomiR-126-3p.1)组、si-NC(转染si-NC)组、si-SLC7A5(转染si-SLC7A5)组、agomiR-126-3p.1+pcDNA(共转染agomiR-126-3p.1和pcDNA)组、agomiR-126-3p.1+pcDNA-SLC7A5(共转染agomiR-126-3p.1和pcDNA-SLC7A5)组,各组细胞用脂质体法转染至SW1736细胞。细胞计数试剂(CCK8)、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)法检测细胞增殖能力;ELISA法检测细胞葡萄糖摄取、乳酸生成能力;蛋白免疫印迹(WB)实验检测细胞SLC7A5蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验检测细胞荧光活性。结果 TCGA显示miR-126-3p.1在甲状腺癌中低表达。与Htori-3相比,SW1736、TPC-1细胞miR-126-3p.1低表达,SLC7A5表达显著升高(均P<0.05)。与agomiRNA组相比,agomiR-126-3p.1组细胞miR-126-3p.1表达显著升高,TPC-1细胞增殖率、EdU阳性率、相对葡萄糖消耗率、相对乳酸生成率、TPC-1细胞SLC7A5蛋白表达量均降低(P<0.05)。与antagomiRNA组相比,antagomiR126-3p.1组TPC-1细胞SLC7A5蛋白表达量显著升高(P<0.05)。敲减SLC7A5对TPC-1细胞具有相似作用。miR-126-3p.1靶向负调控SLC7A5,并且二者在甲状腺癌中呈负相关(R=-0.266,P<0.05)。过表达SLC7A5降低miR-126-3p.1表达,减弱miR-126-3p.1对SW1736细胞增殖、糖酵解的抑制作用(均P<0.05)。结论 miR-126-3p.1可能通过调控SLC7A5参与癌细胞的增殖、糖酵解,具有潜在的治疗价值。

LncRNA-NEAT1调控miR-182-5p表达对狼疮性肾炎肾系膜细胞损伤的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)核旁丛组装转录本1(NEAT1)在狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)中通过微小RNA(miR)-182-5p/叉头盒蛋白O1(FoxO1)/β-连环蛋白(β-catenin)轴对肾系膜细胞损伤的影响。方法收集2019年3月至2021年7月凉山州第二人民医院收治的32例LN患者(LN组)外周血和32例体检健康者(健康对照组)外周血,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测外周血单个核细胞中NEAT1以及miR-182-5p、FoxO1、β-catenin mRNA表达水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β含量。采用20%LN患者血清处理肾系膜细胞的方法构建LN肾系膜细胞模型,造模完成后将细胞分为对照组(正常培养,不转染)、模型组(加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NC组(转染si-NC后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1组(转染si-NEAT1后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1+anti-miR-NC组(共转染si-NEAT1和anti-miR-NC后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1+anti-miR-182-5p组(共转染si-NEAT1和anti-miR-182-5p后加入5μg/mL脂多糖培养)。qRT-PCR法检测各组细胞NEAT1、miR-182-5p表达水平;ELISA法测定各组细胞炎症因子水平;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞LDH含量;细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测各组细胞增殖活力;流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况;免疫印迹法检测各组细胞FoxO1、β-catenin蛋白表达水平。结果与健康对照组比较,LN组患者外周血单个核细胞中NEAT1、FoxO1、β-catenin mRNA表达水平以及血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著上升,miR-182-5p表达水平显著下降(P<0.05)。与对照组比较,模型组肾系膜细胞增殖活力、FoxO1和β-catenin蛋白水平以及LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均明显增加,miR-182-5p表达水平明显降低(P<0.05)。敲低NEAT1后,细胞增殖活力和炎症反应减弱,FoxO1和β-catenin蛋白表达明显下调(P<0.05);抑制miR-182-5p表达可减轻NEAT1敲低对LN肾系膜细胞模型细胞增殖、炎症因子及FoxO1、β-catenin蛋白表达的影响(P<0.05)。各组细胞间凋亡率无显著变化(P>0.05)。结论敲低NEAT1可通过靶向负调控miR-182-5p表达,抑制LN肾系膜细胞过度增殖,降低炎症反应,其可能与抑制FoxO1/β-catenin通路有关。

lncRNA LUCAT1通过miR-199b-5p/AKAP1信号轴促进肝癌进展的机制

目的探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)肺癌相关转录物1(lung cancer associated transcript 1,LUCAT1)通过miR-199b-5p/A激酶锚定蛋白1(A-kinase anchoring protein 1,AKAP1)信号轴促进肝癌转移的机制。方法收集2020年1月至2021年10月在成都市新都区人民医院进行手术治疗的80例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者的肝癌及癌旁组织标本,采用RT-qPCR检测LUCAT1、miR-199b-5p、AKAP1 mRNA水平。将Huh7、HepG2细胞进行不同转染,pHRi-si-NC、pHRi-si-LUCAT1分别转染至Huh7、HepG2细胞,pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-NC、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-199b-5p、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-NC、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-AKAP1分别共转染至Huh7、HepG2细胞。双荧光素酶报告验证LUCAT1对miR-199b-5p、miR-199b-5p对AKAP1的调控关系;EdU染色、划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;RT-qPCR检测细胞LUCAT1、miR-199b-5p和AKAP1 mRNA水平;Western blot检测细胞Ki67、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9水平。向20只裸鼠皮下注射已转染pHRi-si-LUCAT1的Huh7细胞悬液,30 d后测定移植瘤体积、质量、LUCAT1、miR-199b-5p、AKAP1 mRNA、Ki67、MMP-2、MMP-9水平。结果①与癌旁组织相比,HCC组织LUCAT1(1.51±0.53比1.13±0.72;t=3.802,P<0.001)、AKAP1 mRNA(3.73±0.97比1.28±0.76;t=17.783,P<0.001)水平显著升高,miR-199b-5p(1.21±0.53比3.56±1.02;t=18.286,P<0.001)水平显著降低。②转染pHRi-si-LUCAT1后,miR-199b-5p水平显著升高(Huh7:3.71±0.28比1.00±0.10,t=15.787,P=0.004;HepG2:3.49±0.25比1.00±0.11,t=15.790,P=0.004),LUCAT1(Huh7:0.34±0.05比1.00±0.06,t=14.637,P=0.005;HepG2:0.41±0.06比1.00±0.07,t=11.084,P=0.008)和AKAP1 mRNA水平显著降低(Huh7:0.52±0.05比1.00±0.09,t=8.075,P=0.015;HepG2:0.55±0.06比1.00±0.13,t=5.444,P=0.032);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著降低(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.24±0.03比0.92±0.06,t=17.558,P=0.003;HepG2:0.10±0.03比0.51±0.03,t=16.738,P=0.004)、MMP-2(Huh7:0.20±0.03比0.90±0.05,t=20.793,P=0.002;HepG2:0.05±0.02比0.21±0.02,t=9.798,P=0.010)、MMP-9(Huh7:0.25±0.04比0.75±0.05,t=13.525,P=0.005;HepG2:0.15±0.03比0.59±0.04,t=15.242,P=0.004)表达水平显著降低;共转染pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-199b-5p后,miR-199b-5p水平显著降低(Huh7:1.42±0.11比3.65±0.25,t=14.142,P=0.005;HepG2:1.30±0.05比3.71±0.20,t=20.248,P=0.002),LUCAT1(Huh7:0.85±0.10比0.40±0.06,t=6.683,P=0.022;HepG2:0.90±0.08比0.45±0.04,t=8.714,P=0.013)和AKAP1 mRNA水平显著升高(Huh7:0.80±0.07比0.55±0.04,t=5.371,P=0.033;HepG2:0.85±0.08比0.51±0.04,t=6.584,P=0.022);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著升高(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.91±0.06比0.25±0.04,t=15.853,P=0.004;HepG2:0.92±0.07比0.18±0.03,t=16.830,P=0.004)、MMP-2(Huh7:0.62±0.05比0.22±0.03,t=11.882,P=0.007;HepG2:0.75±0.05比0.39±0.05,t=8.818,P=0.013)、MMP-9(Huh7:0.51±0.05比0.18±0.02,t=10.614,P=0.009;HepG2:0.89±0.06比0.34±0.04,t=13.211,P=0.006)表达水平显著升高;共转染pHRi-si-LUCAT1和pHRi-AKAP1后,miR-199b-5p水平显著降低(Huh7:1.82±0.12比3.55±0.30,t=9.274,P=0.011;HepG2:1.70±0.14比3.62±0.25,t=11.606,P=0.007),LUCAT1(Huh7:0.71±0.03比0.30±0.03,t=16.738,P=0.004;HepG2:0.75±0.05比0.35±0.04,t=10.820,P=0.008)和AKAP1 mRNA水平显著升高(Huh7:0.87±0.05比0.51±0.03,t=10.694,P=0.009;HepG2:0.90±0.09比0.54±0.04,t=6.331,P=0.024);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著升高(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.64±0.06比0.30±0.03,t=8.779,P=0.013;HepG2:0.75±0.06比0.25±0.03,t=12.910,P=0.006)、MMP-2(Huh7:0.80±0.05比0.34±0.04,t=12.443,P=0.002;HepG2:0.84±0.08比0.40±0.03,t=8.920,P=0.012)、MMP-9(Huh7:0.76±0.05比0.23±0.04,t=14.337,P=0.005;HepG2:0.76±0.05比0.31±0.04,t=12.173,P=0.007)表达水平显著升高;③转染pHRi-si-LUCAT1后,肿瘤体积[(523.67±64.33)mm^(3)比(1542.21±201.51)mm^(3),t=8.340,P=0.014)]和质量[(0.67±0.15)g比(1.87±0.22)g,t=7.806,P=0.016)]均显著减小,LUCAT1(0.47±0.10比1.00±0.14,t=5.336,P=0.033)、AKAP1(0.12±0.03比0.51±0.05,t=11.585,P=0.007)、Ki67(2.45±0.28比5.93±0.55,t=9.766,P=0.010)、MMP-2(2.35±0.25比5.74±0.51,t=10.338,P=0.009)、MMP-9(3.55±0.34比6.42±0.84,t=5.486,P=0.032)蛋白水平均显著降低,miR-199b-5p(1.68±0.17比1.00±0.16,t=5.045,P=0.037)水平显著升高。结论LncRNA LUCAT1通过miR-199b-5p/AKAP1信号轴促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭。

子宫内膜异位症不孕患者miR-145与Fascin-1、OCT4的相关性及临床意义

目的 研究子宫内膜异位症(EMs)不孕患者miR-145与Fascin-1、OCT4的相关性及临床意义。方法 选择2020年1月至2022年1月于重庆高新区第一人民医院行腹腔镜手术的100例EMs不孕患者作为研究组,留取异位子宫内膜组织;另取同期因宫腔粘连行宫腔镜手术的55例患者作为对照组,留取正常子宫内膜组织。检测两组以及EMs组中不同AFS分期患者内膜组织中miR-145、Fascin-1、OCT4的表达水平,分析EMs组中miR-145与Fascin-1、OCT4表达的相关性,随访EMs不孕患者术后1年的自然妊娠情况,比较EMs组中不同miR-145表达患者术后自然妊娠率。结果 EMs组子宫内膜组织中miR-145的表达水平及Fascin-1、OCT4的mRNA和蛋白表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);EMs组中AFSⅢ~Ⅳ期患者子宫内膜组织中miR-145的表达水平及Fascin-1、OCT4的mRNA和蛋白表达水平均高于Ⅰ~Ⅱ期患者,差异有统计学意义(P<0.05);EMs组患者子宫内膜组织中miR-145的表达水平与Fascin-1、OCT4的mRNA和蛋白表达水平均呈正相关(P<0.05);根据EMs组患者子宫内膜组织中miR-145表达水平的中位数分为miR-145高表达患者和低表达患者,miR-145高表达患者术后累积自然妊娠率低于miR-145低表达患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EMs不孕患者子宫内膜组织中miR-145表达增加与Fascin-1、Oct4表达增加及术后自然妊娠率降低有关。

UCA1/miR-122-5p/CPEB1轴促进肺腺癌的顺铂耐药发生机制研究

目的探讨尿路上皮癌胚抗原1(UCA1)/miR-122-5p/pcDNA-胞质多聚腺苷酸元件结合蛋白1(CPEB1)轴促进肺腺癌的顺铂耐药发生机制研究。方法通过实时荧光反转录定量PCR(RT-qPCR)检测UCA1相关miRNA分子,并通过细胞转染获得miR-122-5p和CPEB1相关细胞株。通过双荧光素酶报告实验分别验证UCA1与miR-122-5p、CPEB1与miR-122-5p的结合。药物敏感性实验获得顺铂药物半抑制浓度(IC50);通过肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库分析CPEB1在肺腺癌中的表达情况以及与免疫细胞功能的关系。结果miR-122-5p在肺腺癌细胞中的表达水平明显升高,并通过双荧光素酶报告实验以验证UCA1与miR-122-5p结合,构建miR-122-5p抑制物和模拟物转染肺腺癌细胞株,发现miR-122-5p抑制后,顺铂IC50浓度下降,而miR-122-5p过表达后,顺铂IC50浓度升高。CPEB1在肺腺癌细胞中的表达水平明显降低,双荧光素酶报告实验证实CPEB1是与miR-122-5p结合,CPEB1过表达后,顺铂IC50浓度减低;对TCGA数据库分析显示肺腺癌组织CPEB1 mRNA明显低于癌旁组织,ROC曲线分析显示CPEB1表达水平能较好地用于诊断肺腺癌(AUC=0.849),进一步分析显示CPEB1表达水平与肺腺癌患者的细胞功能如T细胞、B细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞存在密切关联。结论UCA1与miR-122-5p存在结合位点,后者可影响肺腺癌的顺铂耐药,并与靶基因CPEB1结合;肺腺癌中CPEB1呈低表达,降低肺腺癌顺铂药物的敏感性。UCA1/miR-122-5p/CPEB1轴有望为干预肺腺癌顺铂耐药的靶点。

lncRNA HOTAIR通过靶向miR-1促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的:探讨长链非编码RNA HOT transcript antisenseRNA(HOT transcript antisense RNA,HOTAIR)对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及相关的分子机制。方法:使用RT-qPCR检测lncRNA HOTAIR和微小RNA-1(mircoRNA-1,miR-1)在癌旁组织、肺癌组织及肺癌细胞中的表达水平。过表达及沉默lncRNA HOTAIR后,CCK-8法、Transwell和细胞划痕实验检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞的增殖、迁移和侵袭情况。通过RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RNA binding protein immunoprecipitation assay, RIP)验证HOTAIR和miR-1的互作关系。随后,挽救实验检测miR-1后对A549细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。结果:与癌旁组织相比,肺癌组织中lncRNA HOTAIR表达升高,miR-1表达降低(P<0.05),在NSCLC细胞系中也具有相同趋势。沉默/过表达lncRNA HOTAIR抑制/促进A549细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。lncRNA HOTAIR能够靶向miR-1,干扰miR-1后能部分逆转沉默lncRNA HOTAIR对A549细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论:研究结果表明lncRNA HOTAIR能够通过靶向miR-1促进NSCLC A549细胞增殖、迁移和侵袭,是NSCLC的潜在分子靶点。

miR-150对T细胞PD-1表达及肺肿瘤生长的影响

目的:探讨miR-150对小鼠外周T细胞PD-1表达及肺移植肿瘤生长的影响。方法:选取miR-150基因敲除(miR-150KO)及其野生型正常对照(WT)小鼠,流式细胞数术检测miR-150KO小鼠外周T细胞数量及其活化表型分子CD69和免疫检查点分子PD-1的表达变化;采用Lewis肺癌细胞系(LLC)皮下注射制备miR-150KO和WT小鼠移植肿瘤模型,观察miR-150敲除对肺肿瘤生长的影响;采用抗PD-1抗体腹腔注射miR-150KO和WT荷瘤小鼠,观察其对两组小鼠的肿瘤生长抑制效果。结果:与WT小鼠相比,miR-150KO小鼠脾脏和淋巴结CD4^(+)T细胞比例和数量显著升高,外周血CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞比例和数量显著降低;miR-150敲除导致淋巴结和外周血CD4 T和CD8 T细胞中CD69^(+)细胞比例显著升高,同时导致外周血CD4 T和CD8 T细胞中PD-1^(+)细胞比例显著升高;与WT荷瘤小鼠相比,miR-150KO荷瘤小鼠肿瘤生长明显加快,同时miR-150KO荷瘤小鼠淋巴结和外周血CD4 T和CD8 T细胞中PD-1^(+)细胞所占比例显著升高。抗PD-1封闭抗体处理对miR-150KO荷瘤小鼠的肿瘤生长具有明显抑制作用。结论:miR-150敲除通过提高T细胞中PD-1表达促进小鼠肺肿瘤生长,同时增强抗PD-1抗体对肿瘤的免疫治疗作用。