多核酶表达系统在HEK293细胞中对多药耐药相关蛋白(MRP1)的表达抑制作用(英文)

为了研究多核酶表达系统在HEK293细胞中对多药耐药相关蛋白表达抑制的作用,我们构建了含有20个可以自身切割的顺式作用核酶和10个靶向MRP1基因特定位点的反式作用核酶的多核酶表达系统。利用RT-PCR、Western blot和MTT分析了多核酶系统分别与MRP1靶基因质粒和MRP1全长基因质粒共转染的HEK293细胞。结果显示,多核酶表达系统能够明显降低荧光融合蛋白在HEK293细胞中的表达。RT-PCR分析表明,MRP1靶mRNA降低程度与多核酶表达系统所含的反式作用核酶数目有关。Western blot分析显示了与RT-PCR相似的结果。MTT分析表明,多核酶表达系统能够逆转由MRP1基因转染HEK293细胞产生的多药耐药性。结果提示,含有多个核酶的表达系统对MRP1基因的抑制效应优于单核酶的表达系统。因此,该策略可能用于基因治疗肿瘤或其他疾病。

MRP1/CD9蛋白在人肝细胞癌中的表达及其意义

目的探讨MRP1/CD9蛋白在人肝细胞癌(HCC)中的表达及其与癌侵袭转移的关系.方法构建肝癌组织芯片.样本包括肝细胞癌及癌旁肝组织152例,癌栓22例,肝内转移癌4例,肝外转移癌17例.正常对照肝组织5例.应用免疫组织化学(免疫组化)方法检测肝癌组织芯片中样本MRP1/CD9蛋白的表达.结果 27%(41/152)肝细胞癌原发灶表达MRP1/CD9蛋白.伴癌栓形成HCC中MRP1/CD9蛋白表达率低于无癌栓形成者(分别为21.82%和40.48%; P<0.05).巨块型肝癌中MRP1/CD9蛋白表达率亦低于直径在10cm以下者(分别为5%和34.82%; P<0.01).MRP1/CD9蛋白表达尚与HCC病理分级及血清AFP水平有关:病理分级2级的阳性表达率高于3～4级(分别为39.02%和22.52%;P=0.043),血清AFP≤20μg/L者阳性表达率高于>20μg/L者(分别为41.94%和22.50%;P=0.029).结论肝细胞癌MRP1/CD9蛋白表达水平低下可能与癌组织侵袭转移有关.

环孢素A对THP-1细胞的增敏作用及与多药耐药相关蛋白-1的关系

目的:观察环孢素A(CsA)处理急性单核细胞白血病细胞株THP-1后对柔红霉素(DNR)的耐药性及与多药耐药相关蛋白-1(MRP1)表达的关系,探讨CsA对THP-1细胞的化疗增敏作用及相关机制。方法:噻唑蓝(MTT)法、荧光分光光度法、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)法分别检测CsA处理前后50% THP-1细胞生长受抑的DNR浓度(IC50)、THP-1细胞内DNR含量及分布的变化。免疫细胞化学法、Western blot法检测CsA处理前后THP-1细胞MRP1蛋白表达量的变化。结果:CsA处理后THP-1细胞的IC50明显下降(1.5364±0.1751 vs 0.5588±0.0547,P<0.01),细胞内DNR含量明显增加(21.40±1.71 vs 131.96±16.45,P<0.01),且胞浆内分布更加均匀;同时MRP1蛋白表达量增高(0.2665±0.0042 vs 0.3169±0.0062,P<0.01)。结论:CsA可增加THP-1细胞对DNR的敏感性,降低其耐药性,并提示CsA对THP-1细胞耐药性的改变不是通过降低其MRP1蛋白表达量来实现的。

单分子力谱研究活细胞上多药耐药相关蛋白1的表达

采用原子力显微镜的单分子力谱(SMFM)技术研究了多药耐药相关蛋白1(MRP1)与其抗体间的相互作用,并考察了人舌癌细胞系TCA8113经高剂量平阳霉素(BLM)反复间歇诱导前后细胞表面MRP1的表达差异.实验结果表明,MRP1与其抗体之间存在特异性相互作用力,当针尖运动速率为2.5μm/s时,作用力大小约为(182±35)pN;而且药物诱导后MRP1在人舌癌细胞上的表达明显增强.本工作为了解活细胞水平上MRP1的表达提供了新方法,有助于肿瘤细胞多药耐药性(MDR)的研究.

鼠源抗人乳腺癌MRP1/ABCC1噬菌体Fab抗体库的构建

鼠源抗人乳腺癌多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1/ABCC1)噬菌体Fab抗体库的构建首先是利用乳腺癌组织匀浆液作为免疫原免疫BALB/c小鼠,成功免疫后提取小鼠脾组织的总RNA逆转录为cDNA。然后设计小鼠IgG各亚型的特异性Fab引物,PCR扩增Fd和L基因并依次连接到噬菌体载体pComb3中。重组体pComb3-Fab转化至E.coli XL1-Blue菌中,最后经辅助噬菌体VCSM13超感染,成功构建噬菌体Fab抗体库。以化学合成的MRP1/ABCC1膜表位10肽为抗原进行3轮淘选、富集,对淘选后获得的各级噬菌体抗体库进行ELISA检测和鉴定。成功获得的抗MRP1/ABCC1-10肽三级噬菌体Fab抗体库将为抗人乳腺癌MRP1/ABCC1 Fab抗体的制备提供保障。

低频重复经颅磁刺激对氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠海马CA3区PGP、MRP1、MVP表达的影响

目的研究低频重复经颅磁刺激(rTMS)对氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠海马CA3区P-糖蛋白(PGP)、多药耐药相关蛋白(MRP)1及主穹隆蛋白(MVP)表达水平的影响。方法 60只大鼠随机分为对照组,模型组,假刺激组,治疗组,每组15只。采用氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射构建癫痫大鼠模型,治疗组采用rT MS治疗,比较各组治疗过程中癫痫发作次数及CA3区PGP、MRP1及MVP的表达水平。结果治疗组癫痫发作频率低于模型组及假刺激组(P<0.05)。治疗组PGP、MRP1及MVP表达水平显著低于模型组及假刺激组(P<0.05),较对照组显著升高(P<0.05)。结论低频rTMS可抑制模型大鼠海马CA3区PGP、MRP1及MVP过度表达,低频rTMS的抗痫作用可能与之有关。

ATP结合盒式蛋白转运蛋白在结直肠腺癌中表达及其临床意义

目的探讨多药耐药基因(MDR)1、多药耐药相关蛋白(MRP)1及乳腺癌耐药蛋白(ABCG2)在结直肠腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用增强型二步法免疫组织化学方法检测MDR1、MRP1及ABCG2三个基因在116例结直肠腺癌组织中的表达,并分析其可能的临床预后价值。结果 MDR1、MRP1及ABCG2在结直肠腺癌的阳性表达率显著高于切端正常组织(P<0.05)。MDR1、MRP1及ABCG2的表达与病理学分级、淋巴结转移及Duke分期密切相关(P<0.05),而与年龄、性别及肿瘤发生部位无关(P>0.05)。在结直肠腺癌中MDR1、MRP1及ABCG2的表达呈显著正相关(P<0.05)。结论结直肠腺癌中存在原发性耐药现象,MDR1、MRP1及ABCG2可能在结直肠癌侵袭转移中存在协同作用。联合检测MDR1、MRP1及ABCG2在结直肠腺癌组织中的表达对化疗药物的选择、化疗方案优化及估计患者预后具有重要指导意义。

P-糖蛋白及多药耐药相关蛋白1抑制剂促进天麻素跨膜转运作用机制研究

目的体外细胞模型法及分子对接法研究P-糖蛋白（P-gP）及多药耐药相关蛋白1（MRP1）抑制剂促进天麻素跨膜转运的作用机制。方法MTT法考察天麻素对多药耐药基因1（MDR1）基因转染马丁达比犬肾上皮细胞（MDCK-MDR1）细胞的毒性，采用分子对接法预测天麻素与P-gP、MRP1结合方式及作用能力的强弱，MDCK-MDR1细胞模型分析天麻素的跨膜转运，以及P-gp抑制剂维拉帕米、MRP1抑制剂丙磺舒对天麻素跨膜转运的影响。结果天麻素在100~1000μg/mL的质量浓度内对细胞无毒性；天麻素与P-gp通过氢键及疏水作用形成稳定的复合物，与MRP1通过氢键、疏水作用及静电作用形成稳定的复合物，LibDock Score表明P-gp-维拉帕米、MRP1-丙磺舒复合物的稳定性强于P-gp-天麻素和MRP1-天麻素；天麻素基底侧（BL）→顶端侧（AP）的表观渗透系数（P_app BL→AP）大于P_app AP→BL，外排率（ER）为1．5左右，提示天麻素在MDCK-MDR1细胞为被动转运，且转运过程可能存在蛋白外排现象；天麻素配伍维拉帕米P_app显著增大（P〈0．05），ER值显著减小（P〈0．05），天麻素配伍丙磺舒后P。有所增大，ER有所减小，但无显著性差异。结论天麻素为P-gp底物，天麻素是否是MRP1的底物有待进一步考证，但维拉帕米及丙磺舒可通过竞争性结合P-gp和MRP1不同程度促进天麻素跨膜转运。

离子转运蛋白调控钝齿棒杆菌离子和pH稳态促进L-精氨酸合成

L-精氨酸是一种半必需氨基酸,广泛应用于食品、制药、饲料等行业。【目的】当前对L-精氨酸生产菌株的研究,极少涉及离子转运领域。在本研究中,发现在发酵时适量添加外源K+有利于促进钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5合成L-精氨酸。【方法】在C.crenatum SYPA5-5发酵培养基外源添加0.5 g/L和2.5 g/L的K3PO4,取对数期发酵样品进行转录组数据分析,挖掘出K+转运相关的阳离子转运ATP酶CTAP1以及单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A,研究其在C.crenatum SYPA5-5快速合成L-精氨酸阶段,对菌株生长及L-精氨酸合成的影响。【结果】对基因ctap1和mrp1分别进行敲除和过表达,深入研究突变株对L-精氨酸合成的影响。研究发现同时过表达离子转运蛋白CTAP1和Mrp1A更有利于胞内离子、pH稳态和渗透压调节,最终提高L-精氨酸的产量。在补料分批发酵中分别过表达Mrp1A、CTAP1以及同时过表达Mrp1A和CTAP1的菌株L-精氨酸产量分别达到61.4 g/L、63.9 g/L和65.3 g/L,产率分别为0.383 g/g、0.392 g/g和0.395 g/g,比C.crenatum SYPA5-5分别提高了34.9%、38.0%和39.1%。【结论】CTAP1是特异性的K+转运ATP酶,可以将培养基中的K+运输到胞内。同时Mrp1A可将胞内K+和Na+等单价阳离子运输到胞外,将胞外H+运输至胞内,中和胞内L-精氨酸所导致的碱性环境,从而维持胞内pH稳定。CTAP1和Mrp1A的研究为解析离子转运机制和L-精氨酸合成之间的联系奠定了基础。