MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较3种方案[方案A:单纯慢病毒组;方案B:先药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇)诱导再加慢病毒组;方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组]诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果与结论:(1)细胞形态学改变:经3种方案诱导后细胞形态均发生了改变,方案B在诱导第11天细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团;(2)RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:同一诱导时间点3种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高,方案B的GCG基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA、PDX1基因表达量以及INS和GLUT2基因表达量最高;(3)双硫腙染色鉴定锌离子:3种方案诱导第11天部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中部分小岛状细胞被染成棕红色,颜色较深(阳性表达);(4)结果表明,MAFA和PDX1共过表达可促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化;MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案优于单纯基因修饰方案。

MafA基因与糖尿病关系的研究进展

糖尿病是威胁人类健康的重大疾病之一,其发病过程中都要涉及胰腺β细胞受损和胰岛素绝对或相对分泌不足的问题。随着研究的进展,人们发现包括MafA基因在内的转录因子是胰腺β细胞分化、成熟以及胰岛素的分泌不可或缺的重要因子。MafA基因表达抑制将导致胰腺β细胞功能受损。

腺病毒转染MafA诱导人脐带间充质干细胞表达胰腺细胞特异性基因

背景:人脐带间充质干细胞经化学药物或共培养等方法诱导后胰岛素分泌量低,转染胰腺发育特异性基因诱导干细胞向成熟β细胞分化是近年来的研究热点。目的:探讨MafA基因转染后人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:腺病毒携带外源性β细胞发育的关键转录因子Maf A(Ad-MafA-EGFP),转染入第3代人脐带间充质干细胞,诱导后7 d观察细胞的形态学变化,应用PCR检测细胞中胰腺细胞特异性基因(glucagon、Pdx1、Nkx2.2)的表达。结果与结论:(1)经Ad-Maf A-EGFP转染后,倒置相差显微镜下观察人脐带间充质干细胞形态未见明显变化;(2)荧光显微镜下观察Ad-MafA-EGFP已进入细胞内;(3)经Ad-MafA-EGFP诱导后,人脐带间充质干细胞中人源性胰腺前体细胞glucagon、Pdx1、Nkx2.2基因表达增高,为人脐带间充质干细胞进一步分化成熟胰腺β细胞提供实验依据。

MafA逆转录病毒表达载体的构建及其在肝原始细胞中的稳定表达

目的:构建表达MafA(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A)的逆转录病毒表达载体,并建立稳定表达MafA的肝原始细胞系(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)。方法:通过PCR方法克隆MafA基因全长.将其构建到pBMN—Z—IRES-Neo逆转录病毒载体中获得pBMN—MafA—Neo载体;将该载体导入Phoenix包装细胞系,收集病毒上清并感染LEPCs,筛选稳定表达MafA的LEPCs;RT-PCR方法检测MafA表达对LEPCs分子表型的影响。结杲:成功构建pBMN—MafA-Neo载体,并获得稳定表达MafA基因的肝原始细胞系(LEPCs—MafA)。LEPCs-MafA细胞GK和GLUT2基因表达高于LEPCs。结论:成功获得稳定表达MafA的肝原始细胞系,为研究MafA诱导肝干细胞向胰腺细胞转分化奠定了基础。

脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖及PDX-1、MafA表达水平的影响

背景:1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,以胰腺β细胞选择性破坏,导致患者体内胰岛素分泌绝对不足为特征。脐血干细胞具有多分化潜能,在体内外均可以诱导分化为胰岛细胞,发挥出一定的降糖作用。目的:探讨脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖水平及胰腺组织PDX-1、Maf A表达的影响。方法:30只SD大鼠随机分为3组,每组10只,治疗组和模型组大鼠建立1型糖尿病模型,造模成功后,治疗组尾静脉一次性注射脐血干细胞,正常组给予相同体积的生理盐水,模型组给予相同体积的脐血干细胞缓冲液。采用口服葡萄糖耐量试验评价大鼠胰岛功能,苏木精-伊红染色观察大鼠胰腺形态,Western blot和PCR检测胰腺组织PDX-1、Maf A蛋白和m RNA表达。结果与结论:1模型组和治疗组大鼠0,30,60,90 min的血糖值均显著高于正常组,差异均有显著性意义(P<0.05);120 min时间点模型组血糖值显著高于正常组(P<0.05);治疗组则与正常组之间差异无显著性意义(P>0.05)。2模型组胰岛数量出现下降,边界模糊不清,呈不规则形态,治疗组胰岛数量出现一定的减少,但尚维持清晰的结构。3治疗组PDX-1及Maf A表达水平与正常组比较差异无显著性意义(P>0.05),但显著高于模型组(P<0.05)。以上结果表明,脐血干细胞可以显著降低1型糖尿病大鼠的血糖水平,改善胰岛功能及胰腺组织形态,并具有上调PDX-1、Maf A表达的作用。

MafA基因治疗糖尿病的研究进展

糖尿病是一种严重危害人类健康的疾病。1型糖尿病主要因胰岛β细胞破坏引起胰岛素绝对缺乏,2型糖尿病患者晚期也以胰岛素分泌严重不足为主,需要外源性胰岛素治疗。MafA蛋白在胰腺中表达,是胰岛素基因转录的有效活化剂。与Pdx-1和Beta2联合作用,MafA基因发挥明显的促胰岛素生成作用。如果能利用MafA基因诱导糖尿病患者体内胰腺外细胞表达胰岛素,替代病变的胰腺β细胞,将极大的改善糖尿病患者的预后。

糖异平通过TXNIP/miR-204/MAFA信号通路调控胰岛β细胞功能治疗糖耐量减低机制探讨

糖耐量减低是2型糖尿病的后备军,糖耐量减低阶段就已出现胰岛β细胞功能异常,改善胰岛β细胞功能,阻止糖耐量减低进展为糖尿病,具有积极意义。TXNIP/miR-204/MAFA信号通路在调节胰岛β细胞功能方面发挥重要作用。糖耐量减低属于中医“消渴”范畴,糖异平治疗糖耐量减低优势显著,疗效明显。从TXNIP/miR-204/MAFA信号通路角度探讨胰岛β细胞功能障碍,有助于从分子水平探讨糖异平治疗糖耐量减低的作用机理,为中医药治疗糖耐量减低提供科学依据。

小鼠不同细胞间组蛋白修饰变化对MafA基因转录表达的影响

目的通过比较不同细胞类型之间MafA基因转录起始区的组蛋白修饰差异,探讨组蛋白修饰对MafA基因转录表达的作用。方法采用染色质免疫共沉淀-实时定量PCR法检测小鼠胰岛素瘤β细胞(NIT-1)、NIH小鼠成纤维细胞(NIH3T3)及小鼠胚胎干细胞(mES)三者中的MafA和MLH1基因转录起始区组蛋白修饰(H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化)的状况。同时采用实时定量RT-PCR检测上述三种细胞各基因mRNA表达水平。分析基因的H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化修饰与基因表达之间的相互关系。结果 (1)以mES细胞为参照,NIT-1细胞MafA基因的转录起始区的H3K4m3修饰水平明显增高(P<0.05),H3K9m3修饰水平明显降低(P<0.05);NIH 3T3细胞MafA基因的转录起始区的H3K9m3修饰水平明显增高(P<0.05),H3K4m3修饰水平明显降低(P<0.05);(2)MafA基因的仅在NIT-1细胞表达,其表达与H3K4m3修饰存在直线相关(相关系数0.995);与H3K9m3修饰存在直线负相关(相关系数-0.751);(3)管家基因MLH1的表达与所检测组蛋白修饰无相关性。结论 H3K9m3与H3K4m3修饰能相互协调,共同调控MafA基因的表达,对胚胎干细胞向β细胞分化具有重要的意义。

MafA基因重组腺病毒的构建及其对小鼠肝癌细胞的影响

目的利用AdEasy-1系统构建胰岛素转录因子之一的MafA基因重组腺病毒（Ad-MafA）,并观察其对小鼠肝癌细胞的影响。方法将质粒cDNA3/MafA扩增、酶切获得MafADNA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒（CMV）启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-MafA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-MafA,经293细胞包装后得到含MafA全长DNA片段的重组腺病毒AdMafA;将Ad-MafA体外感染小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）,以RT-PCR和Westernblot检测MafA在hepa1-6细胞的表达。结果连接、重组后通过酶切法筛选出pAd-MafA,经293细胞包装,5d后观察到绿色荧光蛋白（GFP）明显表达,通过反复感染HEK细胞扩增得到高滴度的重组腺病毒,Ad-MafA体外感染肝癌细胞1d后,MafA基因表达和蛋白表达明显增加。结论利用新型腺病毒载体AdEasy-1系统可在短期内制备同时表达GFP和MafA的重组腺病毒（Ad-MafA）,Ad-MafA体外感染小鼠肝癌细胞可显著提高MafA的表达,这将为基因治疗糖尿病提供新的手段。

TAT-MafA融合蛋白诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素

借助蛋白质转导技术,利用胰岛β细胞转录因子MafA诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素,为糖尿病的治疗提供新的方法。将TAT基因与MafA基因一起插入p32a(+)载体中,构建TAT-MafA融合蛋白原核表达载体,转化BL21获得表达菌株,经IPTG诱导和Ni柱亲和层析纯化TAT-MafA融合蛋白,用1μM浓度的该融合蛋白孵育IEC-6细胞12h和24h后,分别进行进胞检测和胰岛素表达检测。实验结果表明,细胞免疫荧光和Western-blot方法检测到经TAT-MafA融合蛋白作用12h后的IEC-6细胞中有该蛋白,并经细胞免疫荧光和RT-PCR的方法检测出TAT-MafA作用24h后的IEC-6细胞中有胰岛素的表达。因此,TAT-MafA融合蛋白可以高效进入小肠细胞系IEC-6细胞,并且进胞后仍保持MafA原有的生物学活性,能启动胰岛素基因的表达,诱导IEC-6成为胰岛素表达细胞。

基于“脾气散精”理论探讨助脾散精法通过TXNIP/miR-204/MafA信号通路防治IGT的机制研究设想

胰岛β细胞功能不足是糖耐量减低(IGT)发病关键,TXNIP/miR-204/MafA信号通路参与调节胰岛β细胞功能。脾不散精是IGT发病的主要病机,助脾散精法是IGT的主要治法,通过调节信号通路改善胰岛β细胞功能。TXNIP、miR-204、MFA均与胰岛β细胞功能密切相关,TXNIP参与调控miR-204的表达,MafA作为miR-204的下游作用靶点,表达参与调节胰岛β细胞的功能。本文基于“脾气散精”理论,从TXNIP/miR-204/MafA信号通路角度探讨胰岛细胞功能不足,有助于深入探讨助脾散精法治疗IGT的作用机理,为中医药治疗IGT提供新的研究思路。

Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因在宫内发育迟缓大鼠胰腺发育中的表达

目的:探讨宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)大鼠在胚胎期和新生后Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因的表达。方法:清洁级SD大鼠,雌雄鼠1∶3合笼交配,孕鼠按受孕顺序随机分为2组(IUGR组和对照组)。IUGR组自妊娠第1天至分娩给予正常对照组饲料进食量的半量;对照组妊娠全程任意摄取饲料;应用显微分离及提取技术取大鼠胚胎发育第14.5天、第19.5天及新生大鼠胰腺组织;采用HE染色,光镜观察胰腺不同发育时期形态学变化;使用RT-PCR技术检测胚胎发育第14.5天,第19.5天及新生大鼠胰腺Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因的表达情况。结果:①与对照组大鼠相比,IUGR组胰腺在发育各期均有形态学上的改变,表现为组织松散,结构不清晰,胰岛数量及面积减少;②Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因全程均有表达;③Insulin、MafA基因随胎龄的增长表达量增多,与对照组相比,IUGR组Insulin基因表达无明显差异(P>0.05),而MafA基因表达较之减少(P<0.05);④FoxO1、Pdx1基因均在胚胎早期表达较多,随胎龄的增长表达量下降,且与对照组相比,IUGR组Pdx1基因表达无明显差异(P>0.05),FoxO1表达较对照组减少(P<0.05)。结论:宫内发育迟缓对胰腺发育相关基因Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA的表达有影响。

MafA与胰岛素抵抗研究进展

糖尿病是目前较为常见疾病之一, 严重危害人体健康. 其发病机制为胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗. 随着研究进展,发现胰岛素正常分泌有赖于胰岛素基因片段的正常表达调控, 其中 MafA 是较为重要的调控因子,MafA 基因表达受抑制将会导致胰岛中 β 细胞功能受损,发生胰岛素抵抗. 而上调 MafA 的表达可作为治疗糖尿病的一个新的靶点,笔者就 MafA 与胰岛素抵抗的相关研究综述如下.

MafA真核表达载体的构建及在人肝癌细胞中的表达

目的:构建肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)真核表达载体pEGFP-N2/MafA,pEGFP-C1/MafA,观察MafA在人肝癌细胞HepG-2细胞内的表达。为研究Mafa基因功能和作用机制奠定基础。方法:提取胰腺总RNA,经RT-PCR获得MafA基因片段,在两端分别引入Hind Ⅲ和Sal Ⅰ的酶切位点,重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2,pEGFP-C1中,用脂质体方法转染至人肝癌细胞HepG-2细胞中,通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测MafA基因和insulin Ⅱ基因的表达。结果:通过RT-PCR获取了MafA基因并成功克隆入载体,转染的细胞有绿色荧光蛋白表达及MafA基因表达,但没检测到insulin Ⅱ基因表达。结论:成功构建质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,并成功表达MafA基因,但没有insulin Ⅱ基因的表达。

PDX-1/MafA与 Akt/PKB通路调控NIDDM发病机理

非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)是一种复杂和多因素的代谢性疾病,胰岛素抵抗(IR)被认为是引发NIDDM的始发因素。近年来,NIDDM的发病及调控机制已被大量研究。该文综述了PDX-1/MafA、Akt/PKB信号通路在NIDDM发病机理中的作用,以期从分子层面上筛选治疗NIDDM的天然产物(NPs),这将为NPs作为强化剂在低GI食物中进行营养强化,开发适合NIDDM患者食用的低GI-NPs食物提供理论依据。

甘薯叶黄酮对糖尿病小鼠胰腺中MafA蛋白表达影响研究

探讨甘薯叶黄酮(FIBL)对糖尿病小鼠糖MafA蛋白表达的影响。采用链脲佐菌素(STZ)诱导Ⅱ型糖尿病(NIDDM)小鼠动物模型,然后将动物分成正常对照组、模型对照组、FIBL低剂量灌胃组、FIBL高剂量灌胃组、罗格列酮灌胃组,药物连续灌胃28 d,检测MafA在糖尿病小鼠胰腺表达量的变化。结果表明小鼠胰腺组织MafA蛋白量增加。甘薯叶黄酮能刺激糖尿病小鼠的MafA基因,使其表达量增加,从而达到降血糖的作用。

宫内发育迟缓新生大鼠胰腺中MafA的表达

【目的】观察宫内发育迟缓(intrauterine growth restriction,IUGR)新生大鼠胰腺中MafA的表达。【方法】清洁级Wister大鼠,雌雄鼠5∶1合笼,孕鼠按受孕顺序随机分为两组(低蛋白组和对照组),低蛋白组自妊娠第1天至分娩给予低蛋白饲料,对照组妊娠全程给予标准饲料。测量IUGR组和对照组新生大鼠空腹血糖及糖负荷后的血糖,摘取胰腺组织,称重,采用HE染色,光镜观察胰腺形态学变化,应用免疫组织化学法检测新生大鼠胰腺组织中MafA的表达。【结果】IUGR组新生大鼠空腹血糖低于对照组,给予糖负荷后,IUGR组血糖下降较慢,至120min仍明显高于对照组(P<0.05);胰重显著低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,IUGR组胰腺表现为组织松散,胰岛数量及面积减少,胰腺中MafA的表达明显低于对照组(P<0.05)。【结论】宫内蛋白营养不良可致大鼠发生IUGR,IUGR新生大鼠胰腺中MafA的表达下降,这可能是影响新生大鼠胰腺发育和功能完善的机制之一。

MafA基因部分敲除对于胰岛素产生的影响及机制研究

目的通过观察肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A（MafA）基因杂合子小鼠在胰岛素分泌、相关基因表达、血糖及血清胰岛素水平等方面的变化，探讨MafA基因在青少年起病的成人型糖尿病（MODY）发生中的作用。方法将动物分为MafA杂合子组及野生（C57BL／6J）对照组，采用腹腔葡萄糖耐量实验（IPGTT）观察杂合子小鼠血糖经时分布曲线及血清胰岛素的变化；胰岛素耐量实验了解两组动物对胰岛素的敏感性；半定量PCR法检测杂合子小鼠MafA、胰岛素以及PdXl和Beta2等基因的表达水平；组织免疫荧光法观察胰腺中胰岛的组织形态并进行ot、B细胞计数分析。结果（1）MafA杂合子小鼠在生后2周开始呈现血糖增高及体重减轻、胰岛素分泌明显下降（P〈0．05或P〈0．01），胰岛素敏感性未发生明显改变。（2）MafA杂合子小鼠胰岛体积较对照组明显增大，但胰腺细胞数量、p细胞的分布形态及比值无明显变化。（3）半定量PCR结果显示，与对照组相比，MafA杂合子小鼠MafA基因、胰岛素基因、Beta2基因表达水平均明显降低（均P〈0．05）．而胰高血糖素及Pdxl水平没有变化。结论MafA基因杂合子小鼠在出生早期即表现为血糖升高、体重减轻、胰岛素产生能力下降等。MafA基因的表达对糖尿病的发生起重要作用。该基因可能是一种新的MODY致病基因。

转录因子MafA在胰岛β细胞中的作用

胰岛素是一种可降低血糖水平的多肽类激素,只在胰岛β细胞中分泌。胰岛素基因的转录由多种转录因子引发。转录因子MafA具有β细胞特异性,其在激活胰岛素基因启动子和产生胰岛素的过程中起重要作用。MafA还可以调节多种在胰岛β细胞中起作用的蛋白的表达。MafA的丰度由多种因素在转录和翻译等水平进行调节。利用基因工程的方法使非β细胞过度表达MafA等转录因子,建立分泌胰岛素的细胞系,有可能成为糖尿病基因治疗的一个靶点。本文就转录因子MafA的特点、其在胰岛β细胞中的作用、MafA的表达与调节及其与糖尿病的关系作一综述。

MafA基因对糖尿病大鼠血糖影响的研究

目的研究MafA基因治疗对糖尿病（DM）大鼠血糖的影响。方法分治疗、DM、正常对照3组；以链脲佐菌素（STZ）诱导Wistar大鼠DM模型；治疗组经门静脉注射将MafA与脂质体等比例混合体转染至DM大鼠体内，观察3组血糖等变化。结果①治疗组血糖由20．6mmol／L～22．8mmol／L下降至13．6mmol／L～14．8mmol／L，平均下降约5mmol／L，血浆胰岛素水平明显升高，且均能维持2周左右；②治疗组血糖明显低于DM组（P〈0．05）；③治疗组血浆胰岛素水平明显高于DM组（P〈0．05）；④治疗组肝脏组织能检测到MafA的mRNA的表达，而DM组未检测到。免疫组化分析结果显示，治疗组肝脏组织可见胰岛素表达，而DM组肝脏组织未见胰岛素表达。结论DM大鼠经门静脉注射MafA与脂质体等比例混合体的基因治疗可有效降低血糖水平。