APP N端片段的神经营养作用

APP是β-淀粉样肽的前体蛋白,由695-770个氨基酸组成,其N端水解产物可分泌至细胞外环境。APP具有促进神经细胞生长作用,其中319-335肽段即APP17肽能提高动物的学习记忆能力,其他APP片段是否具有神经营养功能未见报道。本研究通过观察APPN端片段对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响以及对实验性糖尿病动物行为的影响,希望发现APP促进神经细胞生长的其他肽段。用化学合成APP N端多肽片段,以SY5Y细胞MTT代谢率、细胞计数、LDH漏出率和实验性糖尿病小鼠水迷宫试验结果为观察指标。结果APP64肽、29肽、11肽均有促进SY5Y细胞生长的作用,APP11肽可提高糖尿病动物水迷宫测试成绩。说明可溶性APP的N端可能具有神经营养作用,我们认为保持此作用的最短片段为APP11肽,此肽段的发现为进一步研究APP的构效关系奠定了基础。

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)N端片段。方法:采用PCR技术从含人MASP1cDNA的质粒pGEM-MASP1中扩增MASP1-N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T-1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBL-CLR、重组MBL的结合活性。结果:从pGEM-MASP1中扩增得到约860bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4900bp和860bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR、重组人MBL蛋白结合。结论:获得了表达人MASP1N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件。

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2N端片段的原核表达

目的在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)N端片段。方法应用PCR技术从含人MASP2 cDNA的质粒pGEM-MASP2中扩增MASP2-N端基因片段,将其克隆至pGEX4T-1原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP2-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与MBL-CLR结合的活性。结果从pGEM-MASP2中扩增得到约840 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4900 bp和840 bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr 60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR蛋白结合。结论获得了表达人MASP2 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP2N端片段/GST融合蛋白,为MASP2分子的进一步研究提供了条件。

乙型脑炎病毒E蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达

利用 PCR扩增乙型脑炎病毒 E蛋白基因 5′端片段 ,克隆入原核表达载体 p ET-2 8a,转化大肠杆菌 BL2 1 ( ED3 )。经 IPTG诱导表达后 ,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明 ,所表达的E蛋白片段的分子量约为 3 .4万 ,表达量约占菌体总蛋白的 3 5%。 JEV E蛋白片段在大肠杆菌中的成功表达 ,为制备 JE实验室诊断抗原和分析

EB病毒gp85N端片段的原核表达与初步鉴定

目的构建EB病毒基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85N端截短片段的抗原性。方法采用基因工程技术,以B95-8细胞(美洲绒猴外周血B淋巴细胞经EBV转化后的细胞系)[1]培养上清为模板,用PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片段。PCR产物经HindⅢ和XhoⅠ双酶切,插入原核表达载体pGEX-5T中,构建pGEX5T-85N重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白用Westernblot鉴定,并免疫BALB/c小鼠。结果序列分析表明,插入片段的序列与GenBank登录的参考序列完全一致。重组表达的蛋白的相对分子质量(Mr)约为45000,同预期的大小相符。以纯化的可溶性重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经ELISA检测获得了高效价的抗血清,且抗gp85单克隆抗体(mAb)可识别所表达的gp85N抗原。Westernblot显示,该抗原可与小鼠免疫血清起特异性反应。结论表达并纯化的EB病毒截短的gp85N重组蛋白具有良好的抗原性,为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供了条件。

血清反应因子全长及N端片段过表达慢病毒载体的构建及其对心脏干细胞分化的影响

目的探讨血清反应因子全长(SRF-Full)及N端片段(SRF-N,1-254aa)对TGF-β1诱导c-Kit+心脏干细胞(cardiac stem cell,CSC)分化的影响。方法从c DNA文库扩增大鼠SRF-Full及SRF-N表达序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin),转化感受态细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定。将SRF-Full及SRF-N过表达质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T,包装慢病毒。磁激活细胞分选法分离乳SD大鼠c-Kit+CSC,将SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒感染CSC并经TGF-β1诱导,定量PCR分析下游分化基因mRNA水平的变化。结果成功扩增出SRF-Full及SRF-N编码序列并正确连接入线性化载体,获得的阳性转化子经测序无误。将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后,获得滴度为2×108TU/m L的慢病毒颗粒,Western blot检测到预期Flag融合蛋白。重组慢病毒感染CSC后细胞核中见e GFP信号。TGF-β1诱导CSC出现心肌细胞分化基因(Nkx2.5、Gata4、c Tn I)及平滑肌细胞分化基因(SM22α)的表达,内皮细胞分化(v WF)无影响,SRF-Full促进CSC的心肌细胞分化,而SRF-N则抑制这种分化。结论成功构建SRFFull及SRF-N过表达重组慢病毒质粒。SRF-Full促进而SRF-N减弱TGF-β1诱导CSC的心肌细胞分化。

慢性心力衰竭患者血浆N端片段脑钠肽与心脏功能指标的相关性研究

目的探讨慢性心力衰竭(CHF)患者血浆N端片段脑钠肽(NT-proBNP)水平与心功能的相关性及其临床意义。方法本实验为病例-对照研究。选取74例为CHF组和26例健康对照组,心力衰竭的诊断标准采用欧洲心脏病学会(ESC)心力衰竭工作组推荐的标准,心功能按纽约心脏病学会(NYHA)分级,将CHF患者分4个亚组:Ⅰ级11例、Ⅱ级18例、Ⅲ级25例、Ⅳ级20例。用化学发光免疫分析法测定CHF患者(CHF组,心功能Ⅰ～Ⅳ级)及26例体检正常者(对照组)血浆NT-proBNP的水平,超声心动图测定CHF组及对照组左室射血分数(LVEF)和左室舒张末期内径(LVEDD),统计学方法以SPSS11.5软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差(χ—±s)表示,计量资料组间比较采用非配对t检验,结果以P<0.05具有统计学意义,各变量间进行Pearson相关分析。结果①CHF组与对照组患者血浆BNP水平比较及其与心功能分级的关系:对照组和CHF组心功能Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级患者NT-proBNP平均水平分别为(161±114)和(466.6±8.65)、(559±88)、(1359.52±408)、(5114±2535)pg/mL,CHF组各亚组的NT-proBNP水平与对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。CHF组组间两两比较NT-proBNP水平,有显著性差异(P<0.01),并随着心功能分级的增加和心功能的恶化,NT-proBNP水平逐渐增加,二者呈正相关(r=0.708,P<0.01)。②心力衰竭组患者按LVEDD分两组,LVEDD≥60mm组16例,LVEDD<60mm组58例,前者血浆NT-proBNP水平[(5812±2354)pg/mL]显著高于后者[(1008±607)pg/mL,P<0.01],而LVEDD<60mmCHF组血浆NT-proBNP水平与对照组比较显著升高(P<0.01)。CHF组LVEF<40%患者的血浆NT-proBNP水平([3059±2558)pg/mL]显著大于LVEF>50%患者([562±177)pg/mL,P<0.01]。血浆NT-proBNP水平与LVEF呈负相关(r=-0.848,P<0.01),与LVEDD呈正相关(r=0.935,P<0.01)。结论NT-proBNP是反映心功能受损的敏感指标,与心功能状态及左心室重塑有明显的相关性。NT-proBNP的检测可对不同程度的CHF患者进行评估,对指导CHF治疗、评价预后均具有重要临床价值。

血清反应因子N端片段对鼻咽癌细胞增殖及迁移能力的影响

目的:探讨血清反应因子N端剪切片段(SRF-N)对鼻咽癌(NPC)细胞增殖和迁移能力的影响与机制。方法:应用SRF全长(SRF-Full,1~508 aa)、SRF-N(1~254 aa)及阴性对照(NC)慢病毒颗粒感染人NPC细胞系6-10B,经嘌呤霉素抗性筛选结合Western blot检测Flag标签化融合蛋白的表达获得单克隆细胞株,CCK-8实验分析细胞活力的改变,划痕损伤修复实验和Transwell实验分析细胞迁移能力,细胞-基质黏附实验分析细胞黏附能力,Western blot检测细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)和上皮-间充质转化(EMT)相关指标的表达,双萤光素酶报告基因实验检测SRF-Full和SRF-N对Snail1启动子的调节效应。结果:成功用SRF-Full、SRF-N及NC慢病毒感染6-10B细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合Flag标签蛋白的表达获得相应的单克隆细胞株,分别标记为6-10B^(SRF-Full)、6-10B^(SRF-N)和6-10B^(NC)。与6-10B^(NC)细胞相比,6-10B^(SRF-Full)细胞活力、迁移能力和与基质的黏附能力均显著增强(P<0.01),而6-10B^(SRF-N)细胞较6-10B^(SRF-Full)细胞活力、迁移能力及黏附能力均显著下降(P<0.01)。6-10B^(SRF-Full)细胞中波形蛋白(vimentin)、神经钙黏素(N-cadherin)和Snail1的表达水平较6-10B^(NC)细胞显著升高(P<0.01),上皮钙黏素(Ecadherin)表达水平显著下降(P<0.01);而6-10B^(SRF-N)细胞中vimentin、N-cadherin和Snail1的表达水平较6-10B^(SRF-Full)细胞显著下降(P<0.05),E-cadherin表达水平显著上升(P<0.05)。双萤光素酶活性实验结果表明,与NC相比,SRFFull显著激活Snail1启动子(P<0.001);与SRF-Full相比,SRF-N显著抑制Snail1启动子活性(P<0.01)。结论:SRF-Full促进而SRF-N抑制NPC细胞的增殖和迁移;SRF-N抑制Snail1启动子活性而介导NPC的EMT;SRF-N具有潜在的抗NPC作用。

血浆B型脑钠肽前体N端片段水平检测在肺心病心功能不全中的诊断及预后评估意义

目的:探讨血浆B型脑钠肽前体N端片段水平检测在肺心病心功能不全中的诊断及预后评估意义。方法:采用雅培公司的雅培i2000SR(化学发光法)检测56例肺心病患者血浆NT-proBNP水平,由临床症状,体征、心电图、X线检查及心脏彩色多普勒检查对56例肺心病心功能不全患者进行心功能分级,42名健康人作为正常对照组。结果:肺心病患者的血浆的NT-proBNP水平要比健康人士的高,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。同时患者的血浆NT-proBNP水平伴随心功能不全分级依次进行递增,且比较差异均有统计学意义(P<0.05)。预后良好的患者血浆NT-proBNP水平要比预后不良的低,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,患者血浆NT-proBNP水平要比治疗前低,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:血浆NT-proBNP水平是反映心功能状态的客观指标,对肺心病心功能不全患者的诊断、病情评估、预后预测均有重要价值。

稳定性冠心病患者脑型利钠肽N端片段（NT-proBNP）与心血管事件及死亡率的关系

背景：明确心血管事件高危人群对最佳实施一、二级预防措施非常重要。 目的：研究血浆脑型利钠肽N端片段（prohormone braintype natriuretic peptide，NT—proBNP）水平是否能独立于现有其他诊断性检查预测心血管事件和死亡。 设计、地点及参试者：HSS研究（Heart and Soul Study）于2000年-2002年入选987例来自加利福尼亚州的稳定性冠心病患者进行前瞻性队列研究，平均随访3．7年（范围，0．1—5．3年）。

葡萄球菌核酸酶R型N端片段SNR141的1.9(?)分辨率晶体结构分析

葡萄球菌核酸酶R型(SNaseR)是葡萄球菌核酸酶(SNaseA)的类似物。SNR141是R型核酸酶N端片段系列中的一个,已在E.coli中高度表达和纯化,并且已用于新生肽链折叠的研究。采用悬滴气相扩散法,获得了适合X射线分析用的SNR141单晶体。晶体属于P4_1空间群,晶胞参数为α=b=48.2(?),c=63.8(?)。采用同晶差值Fourier技术,立体化学最小二乘方法和XPLOR程序并辅以电子密度图的人工拟合,测定并精化了SNR141的1.9(?)分辨率晶体结构。最终模型的R因子为19.8％,键长和键角与标准键长和键角的均方根偏差分别为0.016(?)和3.3°。晶体结构的结果表明,从SNaseRC端切除8个残基后,扰动了残基Tyr113的构象,妨碍了酶与底物的结合,使N端片段SNR141的生物酶活力下降为天然酶的80％。

B型脑钠肽前体N端片段水平检测对脑梗塞的临床意义

目的探讨血浆B型脑钠肽前体N端片段水平检测对脑梗塞的临床意义。方法：采用美国贝克曼公司的ACCESS2免疫分析系统（化学发光法）检测50例脑梗塞患者血浆NT—proBNP水平，50名健康人作为正常对照组。结果：脑梗塞患者的血浆的NT—proBNP水平要比对照组的高，比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：血浆NT—proBNP高水平与脑梗塞患者有很大的相关性，具有重要的价值可作为脑梗塞患者病死率的有效预测因子。

慢性心力衰竭患者脂联素、B型脑钠肽前体N端片段与心功能的关系

心力衰竭（简称心衰）是各种心血管疾病最主要的死亡原因，其发病率呈逐年上升的趋势，因此探讨心衰的发生发展机制，为其防治提供理论依据一直是研究重点。脂联素（adiponectin）为脂肪细胞分泌的血浆蛋白，具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖摄取量、改善胰岛素抵抗（IR）、抗动脉粥样硬化及抗炎作用，

葡萄球菌核酸酶R型N端片段:SNR141的晶体生长及初步晶体学分析

葡萄球菌核酸酶(SNase A,EC3.1.4.7)由149个氨基酸残基组成(分子量16.807ku),不含巯基和二硫键,它水解DNA和RNA的磷酸酯键并释放出3’-磷酸单核苷酸和二核苷酸SNase A最初从金黄色葡萄球菌中得到,随后这个酶的基因被克隆并在若干表达体系中进行表达.它的晶体结构已在高分辨率测得,结构表明它唯一的色氨酸残基(W140)包埋在一个疏水环境中.SNase A一直作为研究酶学。

血清骨钙素N端中分子片段的测定及临床应用

目的 研究各年龄组血清骨钙素N端中分子 (N MID)片段的含量 ,了解其稳定性 ,并探讨与各种骨代谢疾病的关系。方法 用电化学发光免疫测定法 (ECLIA)测定血清骨钙素N MID片段 ,其中对照组 183例 ,各种骨代谢疾病患者 99例。将样品放置于室温和 4℃中 ,于不同时间分别测定血清骨钙素N MID片段和全段骨钙素。结果 女性绝经后含量显著升高 ,男性各年龄组差异无统计学意义 ,女性高于男性 ,各类疾病组与对照组比较差异均有显著性。样品在室温和 4℃冷藏 ,骨钙素N MID片段很稳定 ,而全段骨钙素逐渐下降。结论 用ECLIA法测定血清骨钙素N MID片段 ,灵敏度高 ,稳定性 ,能很好地反映骨转换的变化 ,是骨代谢疾病研究非常有价值的敏感指标。

异常凝血酶原N端F1片段及其抗血清的制备

正常人血浆经钡盐吸附、分段盐析、DE-52离子交换层析分离纯化到正常凝血酶原,然后经牛凝血酶酶切、DE-52离子交换层析分离到凝血酶原片段1,再经加热脱羧后得到异常凝血酶原的N端F1片段.将该片段免疫家兔,获得的抗血清与肝细胞性肝癌(HCC)患者血浆有抗原抗体反应,而与正常人血浆无反应,为研制新型的HCC检测试剂盒奠定了基础.

基于深度学习的核素骨显像联合血清肿瘤坏死因子-α、骨钙素N端中分子片段对肺癌骨转移的诊断价值

目的:探讨基于深度学习的核素骨显像联合血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、骨钙素N端中分子片段(N-MID)对肺癌骨转移的诊断价值。方法:选取2019年2月—2022年2月白银市第一人民医院收治的80例肺癌患者进行回顾性分析,根据病理学诊断结果是否伴有骨转移分为两组,37例无骨转移患者纳入对照组,43例伴有骨转移患者纳入观察组。所有患者行^(99)Tc^(m)-亚甲基二磷酸盐(^(99)Tc^(m)-MDP)骨显像及血清标志物(TNF-α、N-MID)检测。比较两组血清标志物水平,分析^(99)Tc^(m)-MDP骨显像、血清标志物(TNF-α、N-MID)以及二者联合对肺癌骨转移的诊断结果及价值。结果:观察组TNF-α、N-MID水平高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000)。联合诊断的假阳性、假阴性率低于单项检测诊断,差异有统计学意义(P<0.05)。^(99)Tc^(m)-MDP骨显像、血清标志物二者联合检测的受试者工作特征曲线下面积、敏感度、特异度高于^(99)Tc^(m)-MDP骨显像、血清标志物单独检测,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:基于深度学习的核素骨显像联合血清标志物能够提升对肺癌骨转移的诊断效能,值得临床推广。

骨折后血清骨钙素N端中分子片段与糖代谢指标的相关性分析

目的探讨骨折后血清骨钙素N端中分子片段(N-MID OC)与糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、C-肽(C-P)的相关性。方法采用回顾性研究方法,将196例单一闭合性骨折男性患者纳入骨折组,将64例健康男性纳入健康对照组,比较2组的一般资料和生化指标水平。将骨折患者按N-MID OC四分位数分为4个亚组,比较4组患者HbA1c、FPG、FINS、C-P水平。分析血清N-MID OC水平与糖代谢指标及生化指标的相关性。结果骨折组年龄、体质量指数、血肌酐、HbA1c与健康对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);骨折组白细胞、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、FPG、FINS、C-P水平高于健康对照组,血小板、血红蛋白、钙离子、25-羟维生素D;和N-MID OC水平低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。不同亚组骨折患者的年龄和血小板、FPG、N-MID OC水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,N-MID OC与年龄(r=-0.280,P<0.001)、HbA1c(r=-0.081,P=0.011)、FPG(r=-0.196,P=0.006)均呈负相关;调整年龄因素后,多元线性回归分析显示,FPG是单一闭合性骨折患者血清N-MID OC的独立影响因素(β=-0.147,P=0.036,95%CI为-0.663~-0.023)。结论骨折创伤后糖代谢与血清N-MID OC存在相关性,这可能是影响骨代谢的因素。

N端脑钠肽诊断伴肾功能不全心衰的准确性评价

目的:评价N端脑钠肽(NT-proBNP)诊断伴肾功能不全心衰的准确性。方法:选取50～70岁伴肾功能不全心衰患者104例,测定体重、体表面积和血肌酐(Crea)浓度,计算肌酐清除率(eGFR),并分为三组:eGFR在60～90ml/min为实验I组,eGFR在30～60ml/min为实验II组,eGFR<30ml/min为实验III组,分别测定各组血浆NT-proBNP水平。对照组为50～70岁无心衰、肾功能正常人50例。应用ROC软件计算曲线下面积,评价应用NT-proBNP诊断伴不同程度肾功能不全心衰的准确性。结果:实验I组的NT-proBNP明显高于对照组(P<0.05),实验II组和实验III组的NT-proBNP、Crea、eGFR均明显高于对照组(P<0.05);三组血浆NT-proBNP水平与eGFR密切相关,相关系数为-0.534(P<0.01);三组病例所得到的ROC曲线下面积分别为0.988、0.948、0.908。结论:eGFR影响NT-proBNP诊断伴肾功能不全心衰的准确性;应根据eGFR分层界定NT-proBNP临界值,以提高NT-proBNP诊断伴肾功能不全心衰的准确性。