猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的遗传变异及其原核表达

应用RT-PCR和nested-PCR方法扩增得到含猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的目的片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析。CH/S株N蛋白基因含有一个长1326bp的ORF,编码由441个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失。CH/S与CV777、Chinju99、JS-2004-2和LJB/03N蛋白基因ORF的序列同源性分别为97.1%、96.8%、96.7%和96.5%;推导的氨基酸序列的同源性分别为97.7%、97.1%、97.1%和96.8%。以阳性质粒为模板,用分别含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的上、下游引物扩增得到ORF,其PCR产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到pET-30a载体,构建的重组质粒命名为pET-30a-PN;将pET-30a-PN转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达;SDS-PAGE结果表明表达出与预期大小相符的约54.4Ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;薄层扫描结果表明表达产物占菌体总蛋白的30.5%;Western blot分析表明表达的重组蛋白能与抗PEDV高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫学活性。

犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定

参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列，用Oligo6．0软件设计一对特异性引物，从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA，经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段，将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒，将其转入到大肠杆菌DH5a中，进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒，转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸，与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白，可被犬瘟热抗血清所识别，具有良好的抗原性。

诺瓦克病毒广州株N蛋白基因的克隆、表达及抗原性鉴定

目的克隆、表达和鉴定诺瓦克病毒广州株NVgz01全长N蛋白。方法在成功构建诺瓦克病毒广州株全基因组克隆并测序的基础上,将全长N蛋白基因克隆到表达载体pET28a(+)上,经IPTG诱导表达后,利用Ni2+亲和层析柱对重组N蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组诺瓦克病毒N蛋白基因在大肠杆菌中可以高效表达,其相对分子质量为62×103,可在Ni2+亲和层析柱上高度纯化;经抗原检测试剂盒检测和免疫学方法分析,均表明重组N蛋白具有良好的抗原性。结论本研究克隆和表达了诺瓦克病毒广州株的全长N蛋白,为诺瓦克病毒诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。

犬瘟热病毒A株N蛋白基因编码区的克隆与序列分析

本试验对犬瘟热病毒 ( CDV) A株 N蛋白基因编码区进行了克隆与序列分析。结果表明 :CDV A株 N蛋白基因编码区核苷酸序列与Onderstepoor株。 A75/ 1 7株及 2 544/ han95株的同源性分别为 97.5%、94%及 93 % ,编码氨基酸的同源性分别为 98%、97%和 96%。

犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

【目的】提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量。【方法】研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST-CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定。【结果】大肠杆菌BL21(DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600=1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8 h,GST-CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL。【结论】确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

【目的】构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8 h取其肝脏提取总RNA,进行RT-PCR方法扩增。【结果】在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带。【结论】构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达。

犬瘟热病毒甘肃株的分离和N蛋白基因遗传进化分析

采用Vero细胞从甘肃2008-2009年疑似犬瘟热感染病犬体内分离到8株病毒,通过RT-PCR方法扩增M蛋白基因初步鉴定所获得毒株均为犬瘟热病毒（CDV）。进一步通过RT-PCR方法扩增分离株的N蛋白基因,并进行序列分析。结果表明,8株分离株均为CDV,它们之间N蛋白基因的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为98.4%-99.7%、98.3%-99.6%;8株CDV分离株的N蛋白基因和TN、A75/17相应序列的核苷酸同源性分别为98.5%-99.5%、97.0%-98.0%,推定的氨基酸同源性分别为98.3%-99.2%、98.7%-99.8%;8株CDV分离株N蛋白基因和疫苗株（Onderstepoort和Snyder Hill）的相应序列的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为93.0%-94.0%、96.8%-98.3%。根据N蛋白基因所建立的遗传系统发育树可知这8株CDV分离株与TN的亲缘关系较近,而与疫苗株处于不同的分支上。说明从甘肃分离的CDV野毒株和TN由同一毒株演化而来,与疫苗株亲缘关系较远。

犬瘟热病毒山东株的分离及N蛋白基因的克隆与序列分析

本试验采用Vero细胞从临床疑似患犬瘟热的犬组织病料中分离出一株病毒,通过观察细胞病变,提取细胞培养物RNA并扩增克隆分析N蛋白基因部分序列进行了鉴定。结果表明,该毒株接种于Vero细胞后,出现了典型的细胞病变;对接种病料后的Vero细胞培养物提取总RNA进行RT-PCR扩增,得到了287bp的目的片段;序列分析表明该分离株与犬瘟热病毒弱毒(Onderstepoort和Snyder Hill)的同源性为95.5%～96.9%,与标准强毒株(A75/17和2544/Han95)及野毒株(XJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性较高,为97.2%～99.0%,证明该毒株为犬瘟热病毒野毒株,命名为QD10。

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSVN蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果。PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA。分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HPPRRSV河南分离株HN1N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体。将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒。将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞。将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果。结果显示,PCR扩增到的CMV-siRNA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb。经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA。经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siRNAN2抑制效果最好。这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路。

深圳地区麻疹病毒核蛋白N基因序列分析

目的 探讨深圳市麻疹病毒的基因型别和特征。方法 采用B95a细胞分离培养麻疹病毒 ,通过RT -PCR方法扩增麻疹病毒核蛋白N基因C末端 4 5 0bp片段并测序 ,分析和基因库Genebank中麻疹病毒的各基因型代表株序列的同源性。结果 分离到 1株麻疹病毒 ,与H1基因型代表株相比同源性为 98 4 %。

深圳地区麻疹病毒流行株血凝素蛋白H基因及核蛋白N基因序列分析

目的探讨深圳地区目前流行的麻疹病毒的基因型别和特征。方法采用B95a细胞分离培养麻疹病毒,通过RT-PCR方法扩增麻疹病毒核蛋白基因C末端450bp片段和血凝素H基因全序列并测序,其序列与Genebank中国内外流行的麻疹病毒8个基因组的代表毒株的序列进行同源性分析。结果分离到1株麻疹病毒,N基因与H1基因型代表毒株相比同源性为98.4%,H基因与H1基因型代表毒株相比同源性为99.5%。结论深圳市麻疹流行毒株属于H1基因型。

人类8型疱疹病毒K8.1N基因编码包膜糖蛋白的原核表达及其抗原特异性分析

目的:制备人类8型疱疹病毒(HHV-8)K8.1N基因编码包膜糖蛋白的原核表达融合蛋白,并鉴定其抗原特异性。方法:将重组质粒pET41a-K8.1N转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)/K8.1N融合蛋白,经Glutathione Sepharose4B亲和层析柱纯化。采用Western blot法观察GST/K8.1N融合蛋白(作为抗原)与新疆地区、法国卡波西肉瘤(KS)患者血清以及四川健康儿童血清的血清学反应。结果:IPTG诱导后的菌体裂解蛋白,经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,显示有一个46kD的融合蛋白表达,经Westernblot法鉴定此融合蛋白能被KS患者血清特异性地识别,新疆地区KS患者血清检出率为78.6%,法国KS为12.0%,四川健康儿童血清无一例与GST/K8.1N融合蛋白发生反应。结论:HHV-8包膜糖蛋白编码基因在大肠杆菌BL21中获得正确表达,并与KS患者血清具有特异识别性。

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒核蛋白合成基因的表达及应用

目的 用合成基因表达产物取代淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（ＬＣＭＶ）或其他方法重组蛋白抗原， 用于ＬＣＭＶ感染的诊断。方法 采用Ｐｒｏｓｉｓ软Ｓ件对ＬＣＭＶ核蛋白（Ｎｐ）全长氨基酸序列进行亲疏水性分析，合成ＬＣ－ ＭＶ ｓＲＮＡ第１８１６－２１７８位核苷酸序列编码的Ｎｐ第３８０～５００位氨基酸基因，克隆在Ｈｉｓ－ｔａｇ ｐＥＴ－２８ａ融合表达，表 达产物经固定化金属配体亲和层析纯化，建立ＥＬＩＳＡ检测试剂。结果 表达产物主要以包涵体形式存在，表达量 达２０％以上。表达产物经Ｎｉ－ＮＴＡ－Ａｇａｒｏｓｅ纯化后纯度达到９０％以上。经检测９３份人血清．有６份病毒抗体阳 性，阳性率为６．５％（６／９３），与全病毒抗原检测结果７．５％（７／９３）相近。结论 用合成基因表达产物取代ＬＣＭＶ抗原 检测病毒抗体，不仅可以消除病毒传播可能，而且特异性强。为ＬＣＭＶ感染诊断及生物材料质量控制提供有效方 法。

云南省2006-2010年狂犬病病毒N和G基因分子结构特征分析

目的了解云南省狂犬病毒的流行情况以及街毒株N、G基因结构特征,为有效控制狂犬病疫情提供初步科学依据。方法对云南省2006-2010年10株狂犬病街毒株N、G基因进行全基因克隆、测序,并与已知国内外代表毒株核苷酸及推导氨基酸进行序列比对及系统发育分析。结果序列分析表明所研究的10个云南毒株与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型代表毒株N、G基因核苷酸序列同源性分别为72.1%～78.5%、58.4%～71.0%,与基因Ⅰ型毒株序列同源性为85.2%～90.1%、82.7～99.6%,云南毒株之间核苷酸序列同源性为89.3%～99.2%、86.0～99.6%。云南10个毒株均为基因Ⅰ型和血清1型毒株,分为2个进化分支,除YNTC06与GXN119和HM88单独属于分支Ⅲ外,其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上,且进一步分为3个小亚分支。遗传进化分析表明,各毒株氨基酸位点均存在不同程度的变异,其中YNTC06在360、369、375等多个NP抗原位点存在变异;云南毒株在GP330、333位毒力决定位点未发生变异,均为强毒株。结论云南狂犬病毒属于基因Ⅰ型,存在2个分支;云南狂犬病毒NP和GP存在特异性氨基酸变异位点,其基因结构及变异、亚组群划分与地理位置无相关性。

云南4株狂犬病毒N和G基因的克隆及测序

目的：认识云南狂犬病毒株N基因和G基因的结构特征及其与已知毒株的遗传相关性。方法：对2006-2007年云南曲靖（YNQJ07）、昭通（YNZT07）、楚雄（YNMD06）、保山（YNTC06）狂犬病毒株N基因和G基因进行RT-PCR扩增，克隆至pPICZαA载体进行测序，并与已知代表性毒株进行比对及系统发育分析。结果：云南狂犬病毒株均属于基因Ⅰ型毒株，YNQJ07、YNZT07、YNMD06以及近年部分广西、浙江、江苏、湖北、安徽、江西省毒株N基因和G基因核酸序列同源性分别介于97.0%-99.3%、97.4%-99.3%，与其它基因I型毒株同源性分别介于86.3%-90.2%、82.9%-93.0%。YNTC06与泰国和部分广西毒株同源性介于95.0%-95.8%，与其它基因Ⅰ型毒株同源性介于82.9%-92.9%。结论：YNQJ07、YNZT07、YNMD06属于亚组群Ⅱ毒株，YNTC06毒株属于亚组群Ⅲ毒株，云南狂犬病毒核蛋白和糖蛋白存在特异性氨基酸变异位点。

猪源狂犬病病毒N和G基因的序列分析

通过对新分离的猪源狂犬病病毒GD-SH01株N基因和G基因进行序列分析,解析它们与其他狂犬病病毒N和G基因的差异.提取猪源狂犬病病毒GD-SH01株的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增N基因和G基因,并与T载体连接,克隆至大肠埃希菌DH5α.测序后与国内外部分毒株的N基因和G基因进行核苷酸序列和氨基酸序列比对.与其他毒株相比,N基因核苷酸相似性为84.3%～98.0%;氨基酸相似性为92.5%～99.3%.G基因核苷酸相似性为80.4%～98.2%;氨基酸相似性为87.8%～99.6%.

2006年吉林省野生型麻疹病毒分离鉴定及核蛋白基因序列分析

目的:研究吉林省麻疹病毒的基因型别及核蛋白(N)基因序列特征,探讨控制麻疹发生的措施。方法:采用B95 a和Vero/SLAM细胞分离培养麻疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法从分离的麻疹病毒中扩增核蛋白(N)基因羧基端450个核苷酸(bp)片段,进行核苷酸测序分析并与基因库GenBank中麻疹病毒的各代表株基因序列的同源性比较。结果:分离到8株麻疹病毒,N基因与H1基因型代表株[1]相比同源性为98.8%。结论:吉林省麻疹流行株属于H1基因型。

小反刍兽疫病毒核蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了获得小反刍兽疫病毒特异性抗原N蛋白,用于血清中抗小反刍兽疫病毒抗体检测方法的建立,根据Gen Bank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白核苷酸序列,设计引物,扩增N基因。扩增片段通过NdeⅠ和HindⅢ酶切位点插入表达载体p ColdⅠ。重组蛋白通过p ColdⅠ载体转化,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了原核表达,经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,表达产物为58 k D的融合蛋白,可被PPRV感染动物血清识别,重组蛋白具有良好的反应原性。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立了检测PPRV血清的间接ELISA方法,与国外标准ELISA试剂盒的符合率达98.3%,为建立快速检测小反刍兽疫病毒抗体的检测方法奠定了基础。

Construction and Identification of siRNA Expression Vector Targeting Nucleocapsid Protein N gene of PRRSV

[ Objective] The aim of this study was to investigate the construction and identification of siRNA expression vector targeting nucleocapsid protein N gone of PRRSV. [Method] Three siRNA oligonucleotides targeting nucleocapsid protein N gone sequence of PRRSV were designed or synthesized, and then inserted into CMV promoter downstream to clone into pSilencer 4,1 -CMV eukaryotic expression vector. The recombinant expression vector was identified by enzyme digestion and DNA sequencing. [ Result] The results showed that the siRNA interference recombinant plasmid vector pSilencer-N targeting nucleocapsid protein gone expression had been successfully constructed. [ Conclusion] This study lays a foundation for studies on the controlling PRRSV by RNA interference technique .