基于蛋白质组学探讨Ppp3cb和Ppm1g在NHE1基因敲除模型鼠海马组织中的表达

目的通过NHE1基因敲除模型鼠的海马组织差异蛋白质组学分析,发现并明确Ppp3cb和Ppm1g的表达特征。方法①选取6只2周龄NHE1基因敲除模型鼠作为模型组,同周龄野生型小鼠6只作为对照组,采用琼脂糖凝胶电泳检测其基因型;应用旷场实验和强迫游泳实验对模型组和对照组小鼠进行行为学评估,并按照Racine评分标准对模型鼠进行癫痫发作分级;②通过串联质谱分析技术对模型组和对照组的海马组织进行差异蛋白筛选,基因本体论(Gene Ontology Analysis,GO)分析差异蛋白并进行注释和富集,蛋白网络数据库(search tool for the retrieval of interesting genes,STRING)分析差异蛋白之间的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI);③应用qPCR和Western blot检测Ppp3cb和Ppm1g的转录和翻译水平,应用免疫组织化学技术分别观察其在组织中的表达量。结果①模型组小鼠NHE1基因未见表达,旷场实验中模型鼠的运动总距离较对照组减少(P=0.0073),跨越的格子数比对照组显著减少(P<0.0001)。强迫游泳实验结果显示,模型鼠不动的时间明显延长(P<0.0001);②以表达倍数(FC)≥1.2倍且P<0.05为筛选标准,检测到海马组织中845个差异表达的蛋白质点,其中有9个蛋白表达上调,7个蛋白表达下调。其中Ppp3cb下调,Ppm1g上调。GO功能注释结果表明,NHE1敲除后,分子功能(MF)富集在蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的差异最显著,细胞成分(CC)富集在质膜部分的差异蛋白数量最多,生物过程(BP)富集在负向调节生物过程、免疫系统过程的差异蛋白数量最多。STRING分析显示差异蛋白Ppp3cb和Slc9a1直接作用,Ppm1g通过Ppp3cb和Slc9a1间接作用,Ppp3cb和Ppm1g之间相互作用。③Ppp3cb的转录和翻译水平减少,在组织中的表达量下降,而Ppm1g转录和翻译水平增加,在组织中的表达量上升(P<0.05)。结论本研究确定了NHE1基因敲除小鼠海马组织中差异蛋白Ppp3cb表达下调,而Ppm1g表达上调,为进一步研究Ppp3cb和Ppm1g参与癫痫发病机制提供了依据。

联合抑制人肺腺癌细胞的MCT1基因及NHE1基因表达对其增殖生长的影响

背景与目的:以往的研究中我们发现,用反义基因分别抑制肿瘤细胞膜上的单羧酸转运蛋白第1亚型(monocarboxylatetransporter-1,MCT1)基因和Na+/H+交换蛋白第1亚型(Na+/H+exchanger-1,NHE1)基因的表达,可使肿瘤细胞内pH(intracellularpH,pHi)降低,细胞酸化死亡。而同时抑制这两种基因的表达,对肿瘤细胞pHi及其增殖生长的影响尚不清楚。方法:用电穿孔法将MCT1基因及NHE1基因相应的反义基因表达载体pLXSN-MCT1和pLXSN-NHE1同时转染于人肺腺癌细胞系A549中,经G418筛选阳性克隆,用PCR及RT-PCR方法鉴定MCT1和NHE1的反义基因与A549基因组的整合。pHi及乳酸含量用分光光度法测定;细胞生长周期用流式细胞仪测定;并将联合转染反义基因的细胞、转染MCT1反义基因的细胞、A549细胞分别接种于裸鼠皮下,观察移植瘤的生长。结果:与A549细胞比较,联合转染反义基因的细胞pHi降低、乳酸显著升高(P<0.001),细胞周期阻滞在G0-G1期。接种联合转染反义基因细胞和转染MCT1反义基因细胞的裸鼠移植瘤明显比接种A549细胞的轻且小(P<0.001)。结论:MCT1基因和NHE1基因可能通过影响pHi对肿瘤细胞的增殖生长起重要的调节作用。

NHE-1反义基因对胃癌细胞的酸化作用及其意义

目的探讨Na+-H+交换泵-1(Na+-H+exchanger1,NHE-1)反义基因转染对人胃癌细胞内pH值(intracellu-larpH,pHi)的调节作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法构建人NHE-1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,采用荧光探针检测转染前后细胞内pH值的变化以及对细胞增殖和凋亡的影响。结果转染反义基因的细胞pHi明显降低,增殖能力降低,细胞凋亡率增加。结论NHE-1基因的表达在肿瘤细胞pHi及增殖和凋亡调节中起重要作用。

NHE1反义基因磁性纳米微粒对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨NHE1反义基因磁性纳米微粒对SGC-7901胃癌细胞株增殖和凋亡的影响,探索胃癌基因治疗的新方法。方法:构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒,将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,比较观察细胞转染前后生长曲线、细胞周期和细胞凋亡率的变化。结果:氧化铁磁性纳米颗粒成功地将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中。NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞生长速度减慢、体外生长增殖能力降低,转染NHE1反义重组质粒的SGC-7901胃癌细胞增殖指数为34.73%,低于SGC-7901细胞的38.95%;NHE1反义基因使SGC-7901胃癌细胞凋亡率增加,转染NHE1反义重组质粒的SGC-7901胃癌细胞凋亡率为11.75%,显著高于SGC-7901胃癌细胞凋亡率(3.85%,P<0.01)。结论:NHE1反义基因磁性纳米微粒能抑制SGC-7901胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有良好的治疗效果,有一定的临床应用前景。

NHE1反义基因磁性纳米微粒对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响

目的:探讨NHE1反义基因磁性纳米微粒对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响,探索胃癌基因治疗新方法。方法:构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒,将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,通过免疫组织细胞化学SP法检测NHE1蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期,观察双层软琼脂集落形成能力及转染前后生长曲线的变化。电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学变化,并观察裸鼠成瘤能力的改变。结果:氧化铁磁性纳米颗粒成功地将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,转染NHE1反义基因的SGC-7901胃癌细胞NHE1蛋白表达降低,细胞生长速度减慢、体外生长增殖能力降低,透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强,裸鼠成瘤能力下降。结论:NHE1反义基因磁性纳米微粒能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调,裸鼠成瘤能力降低,NHE1蛋白在胃癌细胞生长中起重要作用,NHE1基因可能成为基因治疗胃癌的一个理想靶点。

NHE1反义基因对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响

目的:探讨人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响。方法:构建人NHE1反义基因真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,通过免疫组织细胞化学SP法检测NHE1蛋白表达情况,流式细胞仪检测对细胞增殖和凋亡的影响,从电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学的变化,并观察裸鼠成瘤能力的改变。结果:转染NHE1反义基因的SGC-7901胃癌细胞NHE1蛋白表达降低;细胞增殖能力下降,细胞凋亡率增加;透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强;裸鼠成瘤能力下降。结论:NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调,裸鼠成瘤能力降低,NHE1蛋白在胃癌细胞生长中起重要作用。

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响

目的探讨反义NHE1基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法构建人NHE1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,从光镜、电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学的变化。结果与亲本细胞相比,光镜下反义NHE1基因转染的SGC-7901细胞胞体增大,胞浆丰富,核大小相对一致,核浆比减少,核分裂相减少,异型性减小。透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,并可见髓鞘样变,粗面内质网、Golgi较发达,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强。结论反义NHE1基因转染能使SGC-7901细胞发生形态学及超微结构的变化,有促进SGC-7901细胞分化的作用。

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞株增殖和凋亡的影响,探索胃癌治疗的新方法。方法采用脂质体法将构建好的人NHE1基因反义真核表达载体转染至SGC-7901胃癌细胞中,比较观察细胞转染前后生长曲线、双层软琼脂克隆形成能力、裸鼠成瘤能力以及细胞周期和细胞凋亡率的变化。结果NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞生长速度减慢,双层软琼脂集落形成能力、体外生长增殖能力降低,细胞凋亡率增加,裸鼠体内成瘤能力显著降低。结论反义NHE1基因能抑制SGC-7901胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有良好的胃癌治疗效果,提示NHE1基因可成为胃癌治疗的新靶点,具有一定的临床应用前景。

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的:探讨NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法:将构建好的人NHE1反义基因真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,观察NHE1反义基因转染后SGC-7901胃癌细胞的细胞形态学、NHE1蛋白表达、体外生长增殖特性、双层软琼脂集落形成能力的变化。结果:NHE1反义基因转染的SGC-7901胃癌细胞形态恶性程度降低,NHE1蛋白表达明显减少,双层软琼脂集落形成能力、体外生长增殖能力降低,接触抑制恢复,细胞凋亡率增加。结论:NHE1反义基因转染能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调并逆转其恶性表型,提示NHE1基因可成为肿瘤治疗的新靶点,具有一定的临床应用前景。

J亚群禽白血病病毒受体基因NHE1的遗传多态性分析

为发掘J亚群禽白血病病毒（ALV-J）受体基因NHE1潜在的遗传抗性位点,采用PCR技术分段扩增NHE1受体基因序列,并分析其遗传多态性。结果显示,在黄羽肉鸡NHE1基因外显子区域发现了16个SNP突变,分别为c.309G〉C,c.11653C〉T,c.11689G〉A,c.11917C〉T,c.11946C〉T,c.13405C〉A,c.13429T〉C,c.13438T〉C,c.14108A〉C,c.14516A〉G,c.14522G〉A,c.14654C〉T,c.15834G〉A,c.15873G〉A,c.17560C〉Gandc.17770G〉A。进一步分析表明这些SNP突变均为同义c SNP,未引起氨基酸发生改变;在黄羽肉鸡NHE1基因内含子区域发现了SNP和插入/缺失突变,NHE1基因内含子2c.12239~12240和c.13114~13115分别存在AGGGCTGC和TGAAGCC插入突变,内含子11c.17073~17091存在TGTCCTGTGTCCTCCCTGC缺失突变;在ALV-J攻毒后阴性鸡和阳性鸡的NHE1基因外显子区域均发现c.309G〉C、c.11653C〉T、c.13405C〉A、c.13438T〉C、c.14108A〉C和c.14516A〉G6个SNP突变,内含子区域也均发现与黄羽肉鸡相同的插入/缺失突变。研究结果表明,发现的NHE1受体基因遗传变异位点不能作为ALV-J潜在的遗传抗性位点。