下调STGC3基因表达对NP69细胞增殖的影响

目的探讨STGC3基因在鼻咽癌发生发展中的作用机制。方法设计基于miRNA30框架的STGC3特异性shRNA,构建STGC3特异性miR30-shRNA真核表达载体pRNAT-U6/shRNA-STGC3,转染永生化人鼻咽上皮细胞系NP69;采用RT-PCR检测未转染、转pRNAT-U6空质粒和转pRNAT-U6/shRNA-STGC3组NP69细胞中STGC3基因mRNA的表达;使用流式细胞仪检测3组细胞周期分布与细胞凋亡情况。结果与未转染组和转pRNAT-U6空质粒组相比,转染pRNAT-U6/shRNA-STGC3的NP69细胞中STGC3基因mRNA表达下降(P(0.05),G0/G1期细胞比例下降,G2期和S期的细胞比例之和增加(P(0.05)。结论 miR30-based shRNA成功地下调了STGC3在NP69细胞系中的表达;STGC3基因在NP69细胞系的表达下调,使NP69细胞生长增殖速度加快,凋亡减少,提示STGC3对NP69细胞增殖具有抑制作用。

鼻咽上皮细胞中过表达PIN1激活JNK信号通路上调CyclinD1的研究

目的:研究肽脯氨酰异构酶PIN1(prolylisomerase,PIN1)可能影响的肿瘤信号通路和相关基因,探讨鼻咽癌早期发生发展的机制。方法:运用慢病毒表达系统在鼻咽上皮细胞系NP69中建立PIN1过表达细胞克隆株,real-time PCR、Western blot检测PIN1表达情况;肿瘤信号通路阵列荧光素酶实验筛选PIN1可能影响的细胞信号通路,Western blot加以验证。结果:稳定表达PIN1的NP69细胞可激活一系列肿瘤信号通路其中激活丝裂原活化蛋白激酶MAPK/c-Jun氨基末端激酶JNK(MAPK/JNK)信号通路,差异具有统计学意义(P<0.01),核转录因子-κB(P=0.036)、癌基因Myc(P=0.048)信号通路变化具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示与对照组相比,稳定表达PIN1的NP69实验组可明显上调JNK信号通路重要的下游转录因子cJun、c-Jun Ser63、c-Jun Ser73的表达量,最终上调下游基因细胞周期蛋白Cyclin D1(t=-7.295,P=0.002)的表达。结论:稳定表达PIN1的NP69细胞可激活MAPK/JNK信号通路,明显上调JNK信号通路重要的下游转录因子c-Jun、c-Jun Ser63、c-Jun Ser73的表达量,最终上调下游基因细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,PIN1与鼻咽癌早期的发生发展密切相关。

利用慢病毒载体系统构建稳定表达癌基因PIN1的鼻咽上皮细胞株

目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达癌基因肽脯氨酰异构酶PIN1的鼻咽上皮细胞株,用于后续生物学功能方面研究。方法将病毒载体p CDH-PIN1用Lipofectamine转染到293TN细胞,收集含有PIN1病毒颗粒的培养液加入NP69细胞进行培养。荧光显微镜观察慢病毒载体GFP发光率、RT-q PCR、Westernblot验证PIN1的表达情况。结果荧光显微镜观察发现PIN1基因已整合到94%±2.09%的NP69细胞中,转染效果稳定。RT-q PCR、Westernblot检测发现NP69-PIN1组中PIN1的mRNA和蛋白水平明显高于对照组和空白组。结论课题组利用慢病毒载体系统成功在鼻咽上皮细胞构建PIN1过表达株。

EGCG经Wnt1-β-catenin通路抑制NP69-LMP1细胞的增殖

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)体外抑制潜伏性膜蛋白1转化鼻咽上皮细胞NP69(NP69-LMP1)增殖的机制。方法:采用MTT法检测EGCG抑制NP69-LMP1细胞增殖的IC50值;选用细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验和平皿克隆形成实验观察EGCG抑制NP69-LMP1细胞增殖的作用;采用Western-blot检测Wnt1、β-catenin的表达及磷酸化。结果:EGCG抑制NP69-LMP1细胞增殖的IC50值为47.7mg.L-1;EGCG对NP69-LMP1细胞增殖的抑制作用呈浓度和时间依赖性(n=3,P<0.05)。EGCG呈浓度依赖性抑制Wnt1和β-catenin蛋白的表达,促进β-catenin蛋白的磷酸化。结论:EGCG通过降低Wnt1和β-catenin蛋白表达,增加β-catenin蛋白磷酸化水平,发挥对NP69-LMP1细胞增殖的抑制作用。