清肾颗粒对大鼠NRK-52E细胞转分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影响

目的 探讨TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型中miR-23b对PINK1/Parkin通路的靶向调节机制,并阐明清肾颗粒含药血清对NRK-52E细胞转分化的干预机理。方法 采用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱法对清肾颗粒进行全指纹图谱分析。构建TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型,转染siRNA后分为模拟物空载对照组、miR-23b-5p模拟物组、抑制剂空载对照组、miR-23b-5p抑制剂组,观察miR-23b-5p对PINK1表达量的影响。再将NRK-52E细胞分组为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组,Western blot法检测NRK-52E细胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表达,RT-qPCR法检测NRK-52E细胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与PINK1的靶向关系。结果 UPLC指纹图谱法鉴定出清肾颗粒中11个活性成分。miR-23b-5p过表达后,PINK1 mRNA表达量也显著增加(P<0.05);而miR-23b-5p表达沉默后,PINK1 mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-PINK1-WT荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-PINK1-mut荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清干预实验发现,TGF-β1组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显低于正常组,P62和α-SMA表达明显高于正常组(P<0.05)。清肾颗粒组和miR-23b-mimic组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显高于TGF-β1组,P62和α-SMA表达明显低于TGF-β1组(P<0.05)。miR-23b-mimic+清肾颗粒组的表现更优于miR-23b-mimic组(P<0.05)。结论 清肾颗粒能够上调NRK-52E细胞内miR-23b-5p表达,并通过增强PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬活性,抑制NRK-52E细胞转分化进程。

灵芝孢子油及添加维生素E灵芝孢子油对NRK-52E细胞氧化损伤的作用比较

灵芝孢子油是从灵芝孢子粉中提取的油状脂质物,其中的不饱和脂肪酸和三萜类灵芝酸是其主要活性成分。是由于其中的不饱和脂肪酸易氧化挥发,研究人员通过添加维生素E以求解决难题,但目前对添加维生素E的灵芝孢子油抗氧化应激活性的系统研究未见报道。因此选用灵芝孢子油(GLSO)及添加5%维生素E的灵芝孢子油(GLSO+VE)2种样品,作用于H2O2处理的大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞,以评价、比较对氧化应激损伤的保护作用。结果表明,GLSO和GLSO+VE均能显著性增加NRK-52E细胞存活率,提高抗氧化酶的活性,降低氧化产物水平。比较可知添加维生素E可显著降低灵芝孢子油的细胞毒作用,并在一定程度上增加其抗氧化活性。此次试验初步证实了灵芝孢子油中添加维生素E对抗细胞氧化损伤的增强作用,为添加维生素E以增加灵芝孢子油稳定性的研究提供更多理论依据和支撑数据。

清肾颗粒含药血清通过miR-23b-5p靶向Nrf2通路减轻NRK-52E细胞转分化

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)诱导NRK-52E(大鼠肾小管上皮细胞)细胞转分化模型中miR-23b-5p是否能对Nrf2通路靶向调节,并阐明清肾颗粒含药血清减轻NRK-52E细胞转分化的机制。方法构建TGF-β1诱导的NRK-52E细胞转分化模型,分别使用miR-23b-5p mimic、inhibitor以及阴性对照(NC)siRNA转染细胞;采用清肾颗粒含药血清进行干预,分为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组。采用CCK8法测定NRK-52E细胞活性;双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与Nrf2间的靶向关系;Westernblot法检测细胞中Nrf2、Keap1、α-SMA蛋白表达;RT-qPCR法检测细胞中miR-23b、Keap1、Nrf2、α-SMAmRNA表达;流式细胞术检测ROS。结果根据CCK8结果筛选得出清肾颗粒含药血清的最佳浓度和时间分别为20%和24h,TGF-β1刺激的最佳浓度和时间分别为10ng/mL和24h。转染miR-23b-5p mimic和inhibitor发现,当miR-23b-5p过表达后,Nrf2 mRNA表达量也增加;而miR-23b-5p表达沉默后,Nrf2 mRNA表达量也减少。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-Nrf2-wt荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-Nrf2-mu荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清的干预实验发现,与正常组比较,TGF-β1组的miR-23b-5p、Nrf2表达降低,Keap1、α-SMA和ROS表达升高(P<0.05)。与TGF-β1组比较,清肾颗粒组的miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS表达降低(P<0.05);miR-23b-mimic组miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。与miR-23b-mimic-NC组比较,miR-23b-mimic组miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。与miR-23b-mimic组比较,miR-23b-mimic+清肾颗粒组的miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。结论清肾颗粒含药血清能通过miR-23b-5p靶向Nrf2通路机制减轻NRK-52E细胞转分化。

牛磺酸对肾NRK-52E细胞缺氧/复氧损伤的保护及初步机制

目的观察牛磺酸(Tau)对NRK-52E细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及初步机制。方法用NRK-52E细胞缺氧8 h复氧12 h培养建立了H/R模型,流式细胞仪检测凋亡率和胞内游离钙离子浓度,RT-PCR和Western blot检测GRP78、Caspase-12、Caspase-3 mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,H/R组细胞凋亡率上升,GRP78、Caspase-12及Caspase-3 mRNA和蛋白表达均明显增高(P<0.01),胞质游离钙离子浓度也升高(P<0.01);与H/R组比较,各浓度牛磺酸处理组的细胞Caspase-3活性和凋亡率明显下降,胞质游离钙和GRP78、Caspase-12及Caspase-3 mRNA和蛋白表达均有明显降低(P<0.01)。结论牛磺酸对NRK-52E细胞H/R损伤有较好的抑制作用,且呈一定的剂量依赖性,其机制可能是调节胞内钙稳态、抑制GRP78、Caspase-12及Caspase-3表达,减少了细胞凋亡。

水蛭素对大鼠NRK-52E细胞尿酸盐转运体表达的影响

目的探讨金边蚂蟥活性成分水蛭素对大鼠NRK-52E细胞尿酸盐转运体表达的影响。方法采用不同浓度(0、0.01、0.1、1、5和10mg·mL^(-1))水蛭素处理大鼠NRK-52E细胞,细胞计数试剂盒-8(Cell counting kit-8,CCK8)检测水蛭素对细胞的毒性作用。将细胞分为正常组、黄嘌呤组(200μmol·L^(-1))、水蛭素低(0.01 mg·mL^(-1))、中(0.1 mg·mL^(-1))、高浓度组(5 mg·mL^(-1)),培养24 h后,Hoechst33258染色观察细胞形态,实时荧光定量PC R(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPC R)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中葡萄糖转运蛋白9(Glucose transporter 9,GLUT9)、有机阴离子运输蛋白(Organic anion transporter 1,OAT1)和尿酸盐转运体1(Urate transporter 1,URAT1)mRNA及蛋白表达水平。结果水蛭素对大鼠NRK-52E细胞毒性作用较小。与正常组比较,黄嘌呤组细胞碎片增多,细胞中GLUT9和URAT1mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.05),而OAT1 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与黄嘌呤组比较,水蛭素组细胞碎片减少,GLUT9和URAT1表达显著降低(P<0.05),OAT1表达显著升高(P<0.05),且高浓度组比低浓度组更明显(P<0.05)。结论水蛭素可能通过调节肾细胞尿酸盐转运体(GLUT9、URAT1、OAT1)的表达对尿酸排泄的发挥作用。

尾加压素Ⅱ对大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨尾加压素Ⅱ（UⅡ）对大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞增殖和细胞周期的影响及其机制。方法在NRK-52E细胞培养液中加入10^-10、10^-9、10^-8和10^-7mol/L UⅡ,同时设UⅡ活性阻断组：UⅡ＋尼卡地平和UⅡ＋EDTA,以单纯DMEM为对照组。培养48 h后,采用5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入法检测各组细胞的增殖活性,流式细胞术分析细胞周期。结果UⅡ（10^-10-10^-8mol/L）以浓度依赖方式促进NRK-52E细胞BrdU掺入（A值分别为0.491±0.038、0.291±0.024和0.281±0.037）,其中以10-8mol/L UⅡ的作用最明显,10^-7mol/L UⅡ对NRK-52E细胞增殖的影响与对照组比较差异无显著意义。UⅡ影响NRK-52E细胞周期,在10^-10-10^-8mol/L浓度范围内增加S期细胞百分比（分别为26.96%±3.35%、44.26%±3.28%、48.12%±2.22%）。尼卡地平和EDTA均可以降低UⅡ诱导NRK-52E细胞的BrdU掺入增加,降低S期细胞百分比。结论UⅡ具有较强促进NRK-52E细胞增殖的作用,但大剂量则无此作用,其诱导NRK-52E细胞增殖作用部分是通过Ca^2＋内流来介导的。

罗格列酮对高糖及间歇性高糖诱导NRK-52E细胞NF-κB及肿瘤坏死因子-α上调的影响

目的:探讨罗格列酮对高糖及间歇性高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E中NF-κB及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的抑制作用。方法:作用72h后,Westernblot检测空白组(0mmol/L葡萄糖)、正常葡萄糖组(5mmol/L葡萄糖)、高糖干预组(25μmol/L葡萄糖)、间歇性高糖干预组(5mmol/L葡萄糖/25mmol/L葡萄糖交替)、罗格列酮干预组(20μmol/L罗格列酮)、罗格列酮高糖干预组(20μmol/L罗格列酮预处理后在高糖培养)、罗格列酮间歇性高糖干预组(20μmol/L罗格列酮预处理后在间歇性高糖培养)中NF-κB及TNF-α及在NRK-52E细胞的表达。细胞ROS含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果:高浓度葡萄糖及间歇性高糖均上调NF-κB及TNF-α表达,ROS含量显著上升,其中在间歇性高糖作用更显著。应用罗格列酮干预后可以下调高糖或间歇性高糖中NF-κB及TNF-α表达,细胞ROS含量下降。结论:罗格列酮可下调高糖及间歇性高糖诱导NRK-52E细胞NF-κB及TNF-α表达。

氯沙坦抑制高糖及间歇性高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的探讨氯沙坦对高糖及间歇性高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E转分化的抑制作用。方法实验分为空白组(0mmol/L葡萄糖)、正常葡萄糖组(5mmol/L葡萄糖)、高糖干预组(25mmol/L葡萄糖)、间歇性高糖干预组(5mmol/L葡萄糖/25mmol/L葡萄糖交替)、氯沙坦干预组(10μmol/L氯沙坦)、氯沙坦高糖干预组(10μmol/L氯沙坦预处理后再高糖培养)、氯沙坦间歇性高糖干预组(10μmol/L氯沙坦预处理后再间歇性高糖培养),根据分组对NRK-52E细胞施加相应因素作用72h后,蛋白免疫印迹法检测转分化标志物转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)在细胞中的表达,CM2H2DCFDA试剂盒检测细胞ROS含量。结果高糖干预及间歇性高糖干预组TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA和PTHrP表达上调,ROS含量明显上升,间歇性高糖作用更显著。应用氯沙坦干预后可以部分下调高糖或间歇性高糖诱导的TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA以及PTHrP表达,降低细胞ROS含量。结论氯沙坦可抑制高糖及间歇性高糖诱导的NRK-52E细胞转分化作用。

白蛋白联合低氧对NRK-52E细胞凋亡的影响

目的:探讨白蛋白联合低氧对肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡的影响。方法:应用流式细胞技术检测NRK-52E细胞在不同质量浓度白蛋白(0、10、20、30和40g/L)和常氧(含体积分数为5%CO2的空气)条件下培养24h的凋亡率,得到最适的白蛋白质量浓度;再应用流式细胞技术检测NRK-52E细胞在30g/L白蛋白和低氧(体积分数为1%O2、5%CO2和94%N2)联合培养24h的凋亡率,同时设常氧对照组、低氧对照组和常氧+30g/L白蛋白培养组。采用RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA表达。结果:在常氧环境下NRK-52E细胞凋亡率随白蛋白质量浓度的增加而增高(F=55.748,P<0.001)。常氧对照组、低氧对照组和常氧+30g/L白蛋白培养组及低氧+30g/L白蛋白培养组NRK-52E细胞凋亡率(F=112.174,P<0.001)、bax mRNA(F=114.522,P<0.001)和bcl-2 mRNA(F=63.097,P<0.001)的表达差异均有统计学意义。低氧+30g/L白蛋白培养组的凋亡率[(37.36±4.95)%vs(25.59±3.32)%,P<0.05)和bax mRNA的表达(2.54±0.19vs1.87±0.19,P<0.05)高于常氧+30g/L白蛋白培养组,而bcl-2 mRNA的表达则低于常氧+30g/L白蛋白培养组[(0.42±0.08)vs(0.66±0.05)](P<0.05)。结论:低氧可加剧白蛋白诱导的NRK-52E细胞凋亡,其机制可能与促进bax mRNA高表达和bcl-2 mRNA低表达有关。

血管紧张素Ⅱ对高糖诱导NRK-52E细胞转分化作用研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E转分化的干预作用。方法细胞培养72 h后,Western blot检测对照组(0 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、血管紧张素Ⅱ干预组(10 nmol/L AngⅡ)、高糖血管紧张素Ⅱ干预组(10 nmol/L AngⅡ+25 mmol/L葡萄糖)中转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2(MMP2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)在NRK-52E细胞中的表达。活性氧(ROS)含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果高浓度葡萄糖上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达。AngⅡ明显上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA和PTHrP的表达,并提高ROS含量。结论AngⅡ可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。

晚期糖基化终产物对高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的:探讨晚期糖基化终产物(AGEs)对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E的转分化干预作用。方法:大鼠肾小管导管上皮细胞株设空白组(不给葡萄糖)、高糖组(25mmol/L葡萄糖)、AGEs干预组(100mg/LAGEs)、高糖AGEs干预组(100mg/LAGEs+25mmol/L葡萄糖),培养72h后,用Westernbolt检测转化因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2(MMP2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)在NRK-52E细胞的表达,活性氧(ROS)含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果:高浓度葡萄糖上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达,AGEs显著上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA和PTHrP表达,提高ROS含量。结论:AGEs可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。

间歇性高糖对NRK-52E细胞抗氧化能力作用研究

目的探讨间歇性高糖抑制大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E抗氧化能力。方法实验开始72 h后,Western blot检测空白组、正常葡萄糖组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖干预组(25 nmol/L葡萄糖)、间歇性高糖干预组(5 mmol/L葡萄糖与25 mmol/L葡萄糖交替)中氧化物歧化酶-1(SOD-1)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)在NRK-52E细胞表达。一氧化氮合酶(eNOS)试剂盒应用液闪仪测定3[H]的放射强度,活性氧(ROS)含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果高浓度葡萄糖及间歇性高糖均下调SOD-1及NADPH表达,而提高ROS含量,间歇性高糖作用更显著。间歇性高糖eNOS含量低于持续性高糖组。结论间歇性高糖抑制肾小管导管上皮细胞抗氧化能力显著。

山药中熊果苷通过ERβ抑制LPS诱导NRK-52e细胞凋亡

目的探究山药中熊果苷(arbutin,Ar)对LPS诱导NRK-52e细胞凋亡的干预作用及潜在机制。方法建立LPS诱导的NRK-52e细胞损伤模型,将细胞分为正常组、LPS组(1 mg·L^(-1))、低剂量Ar(LPS,1 mg·L^(-1)+Ar,5μmol·L^(-1))和高剂量Ar(LPS,1 mg·L^(-1)+Ar,10μmol·L^(-1))及其对应的抑制剂THC组(1μmol·L^(-1)),检测细胞活力;流式细胞术检测ROS、细胞凋亡水平、Ca2+浓度及线粒体膜电位;In cell western技术检测细胞凋亡关键蛋白表达水平;结果Ar可有效调节LPS诱导的NRK-52e细胞ROS水平、Ca^(2+)浓度、凋亡关键蛋白和ERβ水平,抑制线粒体膜电位下降,但是该作用被雌激素受体β抑制剂THC所阻断,且Ar与ERβ具有较好的结合活性。结论Ar可能通过ERβ抑制LPS诱导NRK-52e细胞凋亡。

氯沙坦对高糖诱导NRK-52E细胞结缔组织生长因子及E钙黏蛋白表达作用研究

目的:探讨氯沙坦对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E结缔组织生长因子(CTGF)抑制作用。方法:作用72小时后,Westernblot检测空白组(0mmol/L葡萄糖)、正常葡萄糖组(5mmol/L葡萄糖)、高糖干预组(25nmol/L葡萄糖)、氯沙坦干预组(10nmol/L氯沙坦)、氯沙坦高糖干预组(10nmol/L氯沙坦预处理后在高糖培养)中CTGF及E钙黏蛋白在NRK-52E细胞表达。细胞ROS含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果:高浓度葡萄糖上调CTGF表达,下调E钙黏蛋白表达,ROS含量显著上升。应用氯沙坦干预后可以下调高糖CTGF表达,上调E钙黏蛋白表达、细胞ROS含量下降。结论:氯沙坦可抑制高糖诱导NRK-52E细胞CTGF表达。

补肾活血中药复方含药血清通过调节NCC和CLC-5对高盐诱导的体外NRK-52E细胞发挥保护作用

目的:探讨补肾活血中药复方含药血清(NKABRS)通过钠氯同向转运体(NCC)和电压门控性氯离子通道5(CLC-5)对高盐诱导的体外大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E损伤、凋亡和骨代谢相关因子表达的影响及作用机制。方法:取SPF级2月龄雌性SD大鼠30只,随机分为对照组与补肾活血中药复方组,分别灌胃给药后制备对照血清和补肾活血中药复方含药血清并作用于体外培养的NRK-52E细胞,CCK-8法检测NKABRS对细胞活力的影响。体外培养的NRK-52E细胞,分为对照组、NKABRS(3%)组、NaCl(0.25 mol/L)组和NaCl+NKABRS组,CCK-8法检测各组细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot和RT-qPCR法检测细胞内骨桥蛋白(OPN)、NCC、CLC-5、骨形态发生蛋白7(BMP-7)和1α-羟化酶(CYP27B1)的表达,免疫荧光法检测细胞内CLC-5和NCC的蛋白含量及分布。通过RNA干扰技术敲减NRK-52E细胞NCC和CLC-5的表达,RT-qPCR检测敲减后各组细胞内BMP-7、1α-羟化酶和OPN的表达。结果:NaCl(0.25 mol/L)可抑制体外NRK-52E细胞的活力并增加其细胞凋亡率(P<0.01),同时增加细胞NCC和OPN表达,并减少CLC-5、BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.01);NKABRS可增加NaCl诱导的细胞活力并降低细胞凋亡率(P<0.01),降低NCC和OPN表达,并提高CLC-5、BMP-7和1α-羟化酶的表达(P<0.01)。沉默体外培养的NRK-52E细胞内NCC基因可下调OPN表达并增加BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.01),NKABRS可进一步提高BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.05);沉默细胞内CLC-5基因可增加OPN表达并减少BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.01),NKABRS可抑制OPN表达并上调BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.01)。结论:NKABRS可减轻高浓度NaCl引起的体外NRK-52E细胞的损伤和凋亡,其机制可能与减少NCC表达并增加CLC-5及细胞内骨代谢正向调节因子1α-羟化酶和BMP-7的表达有关。

丹参注射液对AngⅡ诱导NRK-52E细胞损伤的保护作用

目的考察丹参注射液对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)损伤的保护作用。方法将NRK-52E细胞分为对照组、模型组(AngⅡ)、丹参注射液组(AngⅡ+丹参注射液),MTT法检测其增殖,免疫荧光法与Western blot法分别检测PI3K、p-PI3K蛋白表达。结果与对照组比较,AngⅡ作用24 h后可显著抑制细胞增殖及PI3K、p-PI3K蛋白表达,而丹参注射液均能加以恢复。结论丹参注射液能减轻AngⅡ对NRK-52E细胞的损伤作用,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。

高糖状态下晚期糖基化终产物诱导NRK-52E细胞氧化应激及普罗布考干预研究

目的探讨高糖状态下晚期糖基化终产物(AGEs)诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E氧化应激及普罗布考干预作用。方法作用72 h后,用Western Blot检测空白对照组(0 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、AGEs组(100mg/L AGEs)、高糖AGEs组(100 mg/L AGEs加25 mmol/L葡萄糖)、普罗布考预处理高糖AGEs组(100μmol/L普罗布考加100 mg/L AGEs加25 mmol/L葡萄糖)中核因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在NRK-52E细胞的表达。用CM2H2DCFDA试剂检测活性氧(ROS)含量。结果高浓度葡萄糖及AGEs均上调NF-κB及TNF-α表达。普罗布考显著抑制调高浓度葡萄糖状态下AGEs诱导NF-κB及TNF-α表达,以及抑制ROS生成。结论普罗布考能抑制高浓度葡萄糖状态下AGEs诱导细胞氧化应激。

甲状旁腺激素相关肽在高糖诱导NRK-52E细胞转分化中的作用

目的探讨甲状旁腺素相关肽在高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E转分化作用。方法应用RT-PCR及Western blot检测无糖组(无糖培养基培养),正常葡萄糖组(含5mmol/L葡萄糖DMEM培养基培养)组及高浓度葡萄糖组(含16.7mmol/L葡萄糖DMEM培养基培养)中甲状旁腺素相关肽(parathyroid hormone-related peptide,PTHrP)及其受体1在大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E表达。10pmol/L PTHrP及16.7mmol/L葡萄糖分别干预72h,应用Western blot检测转化因子β、金属蛋白酶2、Ⅰ型胶原及α平滑肌肌动蛋白表达情况。ROS含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果与空白组和正常葡萄糖组相比,高浓度葡萄糖能显著上调PTHrP(P<0.05,P<0.01)和甲状旁腺激素受体1(Type1receptor parathyroid hormone-related protein,PTH1R)(P<0.01,P<0.05)蛋白及PTHrP mRNA(P<0.01)表达,PTH1R mRNA在高浓度及正常葡萄糖浓度组的表达高于空白组(P<0.01)。对比空白组,PTHrP能显著上调NRK-52E细胞转化因子β1(P<0.01)、Ⅰ型胶原(P<0.01)及α平滑肌肌动蛋白(P<0.01)表达,而在高浓度葡萄糖状态下,其表达上调更显著(P<0.05,P<0.01)。金属蛋白酶2在PTHrP及高浓度葡萄糖共同干预下表达上调(P<0.01)。PTHrP及高血糖均可以升高NRK-53E细胞ROS含量(P<0.01,P<0.01)。结论高浓度葡萄糖可能通过调控PTHrP/PTH1R的水平从而影响肾小管导管上皮转分化。

宽缨酮减轻顺铂诱导的NRK-52E细胞损伤的作用研究

目的探讨宽缨酮(EN)对顺铂诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E细胞损伤的作用,为宽缨酮防治顺铂所致急性肾损伤提供实验依据。方法体外培养NRK-52E细胞,随机分为对照组(Control)、顺铂组(Cisplatin)、宽缨酮干预组(EN+Cisplatin)。Annexin V-APC/7-ADD双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率;采用ATP检测试剂盒检测细胞ATP含量;采用MitoSOX荧光探针结合流式细胞术检测线粒体活性氧(ROS)改变;实时定量PCR检测细胞促炎因子(TNF-α、IL-6),PGC-1αmRNA的表达水平以及线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的变化情况;Western blot检测细胞中促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和线粒体膜蛋白Tom20的表达水平。结果与对照组相比,顺铂组Cleaved Caspase-3的蛋白表达及细胞凋亡率均升高(P<0.05);TNF-α、IL-6的mRNA表达升高(P<0.05);ATP含量及mtDNA拷贝数降低,线粒体ROS含量增高,PGC-1α的mRNA表达及Tom20的蛋白表达均降低(P<0.05);与顺铂组相比,宽缨酮干预组细胞Cleaved Caspase-3的蛋白表达及细胞凋亡率均降低(P<0.05);TNF-α、IL-6的mRNA表达降低(P<0.05);ATP含量及mtDNA拷贝数增多,线粒体ROS含量降低,PGC-1α的mRNA表达及Tom20的蛋白表达均升高(P<0.05)。结论宽缨酮减轻顺铂诱导的NRK-52E细胞损伤,其机制可能与改善线粒体损伤、抑制细胞凋亡及炎症反应有关。

中介素预处理对NRK-52E细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制

目的 探讨中介素(intermedin,IMD)在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)条件下对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)损伤的保护作用及其机制。方法 体外培养NRK-52E细胞,随机分为空白对照(NC)组、氯化钴(CoCl2)组和IMD+CoCl2组;采用1.5×10^(-4) mol/L CoCl2处理24 h建立NRK-52E细胞H/R模型,IMD+CoCl2组采用IMD 20 ng/mL预处理4 h,保持IMD浓度(20 ng/mL)用1.5×10^(-4) mol/L CoCl2处理24 h。流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(ROS)含量,JC-1探针法检测线粒体膜电位(MMP),real time-PCR法检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Caspase-3,以及氧化应激蛋白血红素加氧酶-1(HO-1)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达水平,Western blot法检测Bcl-2、Caspase-3、HO-1和eNOS蛋白表达。结果 与NC组相比,CoCl2组细胞凋亡率增加(P<0.01);ROS生成增加,MMP下降,同时Caspase-3表达增加(P<0.01),Bcl-2表达降低(P<0.01);与CoCl2组相比,IMD+CoCl2组细胞凋亡率显著下降(P<0.01),ROS生成显著减少而MMP显著增加,此外Caspase-3 mRNA及蛋白表达均下调(P<0.01),Bcl-2及eNOS、HO-1表达显著增加(P<0.05)。结论IMD能够改善NRK-52E细胞H/R诱导的损伤,其可能的机制是通过抑制H/R诱导的细胞凋亡和氧化应激,上调Bcl-2及eNOS、HO-1表达。