C株猪瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表达活性检测

以经典毒株C株的基因组为模板,测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析,并对抗原表位进行预测,结果表明NS3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物,分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因,分别用pET-28a表达载体进行重组后,获得pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c,用表达菌株BL21(DE3)进行表达,b段表达较高,可溶性表达较好,纯化后,可获得重组蛋白CSFV-His-NS3b, SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD,Western-Blot证实其具有良好的免疫原性,并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL,表明该蛋白特异性很强,可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。

丙型肝炎病毒NS3蛋白促进人源肝细胞的增殖及其相关机制研究

丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白与肝癌细胞(HCC)的发生密切相关,但其机制尚不清楚.既往体外研究极少采用HCV的自然宿主细胞——人肝细胞作为研究体系,故所获研究结果有待进一步探讨和证实.构建了表达HCVNS3蛋白的真核质粒,通过稳定转染人源永生化肝细胞系QSG7701,建立了稳定表达HCVNS3蛋白的人源永生化肝细胞系QSG7701/NS3,以此为实验平台,检测了细胞增殖的变化,丝裂原蛋白激酶(MAPK)通路激酶磷酸化水平的改变及转录因子AP-1、NF-κB和STAT3的活性变化.结果表明:HCVNS3蛋白可促进人源永生化肝细胞QSG7701的增殖,HCVNS3蛋白激活ERKs/AP-1可能是其促进细胞增殖的重要机制,并通过上调转录因子NF-κB和STAT3的活性,诱导宿主细胞急性炎症损伤.

丙型肝炎病毒C蛋白和NS3蛋白双表位嵌合型重组抗原的表达

应用基因工程技术构建了两种可表达丙型肝炎病毒Ｃ蛋白和ＮＳ３蛋白双表位嵌合抗原Ａ（Ｃ７５－ＮＳ３ａ）和Ｂ（ＮＳ３ａ－Ｃ７５）的质粒，并在大肠杆菌中进行了表达。采用经过盐析和离子交换层析纯化的表达产物进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、抗Ｃ和抗ＮＳ３双抗体夹心ＥＬＩＳＡ试验，并用以检测Ｃ或ＮＳ３表位单特异性血清及系列血清，结果表明Ａ或Ｂ抗原均同时具备Ｃ和ＮＳ３抗原的免疫反应性，而且两种抗原的性能基本相似。在ＨＣＶ抗体检测中这类抗原可望替代配伍的Ｃ＋Ｃ３３ｃ混合抗原。

酵母双杂交技术筛选白细胞中HCVNS3蛋白结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增 NS3基因,连接入酵母表达载体 pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞 Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出 NS3基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有 X-α-半乳糖(x-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落18个,其中4个真核细胞翻译延伸因子2;2个免疫球蛋白λ轻链;1个肌动蛋白β;1个铁蛋白轻多肽;1个(丝裂原)活化蛋白激酶3;2个肌球蛋白因子1;1个白介素2受体β;1个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6;1个组织蛋白酶 S;1个2’-5’寡腺甘酸合成酶类似物;1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个 CNN2;1个新基因.结论:成功克隆出 HCV NS3的结合蛋白,为进一步研究HCV 的作用提供了新线索.

庚型肝炎病毒NS3蛋白在昆虫细胞中的表达

The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein was expressed in Sf9 insect cells and analyzed by SDS-PAGE. A protein band about Mr 43810 was demonstrated on polyacrylamide gel electrophoresis and this protein amounted to more than 30% of the total cell proteins. Recombinant NS3 protein was purified by Ni-NTA column. Western blot showed that this recombinant protein could react with GBV-C/HGV RNA positive mixed sera. The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein could be used to detect GBV-C/HGV infection and will supply material for study of structure and function of this protein.

庚型肝炎病毒NS3蛋白在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的 :利用 Bac- to- Bac HT杆状病毒系统在 Sf9昆虫细胞中表达庚型肝炎病毒 (HGV) NS3蛋白 ,并对表达产物的免疫原性进行研究。 方法 :将 HGV NS3基因片段定向克隆至转座载体 p Fast Bac HTa,转化 DH10 Bac感受态细胞 ,37℃振荡培养 4h使发生转座 ,用抗生素平皿筛选重组 bacmid。脂质体介导转染 Sf9昆虫细胞 ,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液 ,将上清液再次感染 Sf9细胞以大量表达 HGV NS3重组蛋白。利用 SDS- PAGE和 Western- blotting方法分析重组蛋白。结果 :SDS- PAGE分析发现表达产物在 Mr43810处有一条明显的蛋白带 ,占细胞总蛋白量的 30 %以上 ;应用 Ni- NTA亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白 ;Western- blotting显示该抗原可与 HGV RNA阳性血清发生特异反应。 结论 :获得了昆虫细胞内表达的 HGV NS3重组蛋白 ,并证明该蛋白有可能用于 HGV感染的抗体检测。

HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析

目的制备针对丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体(MAb),并分析获得的单抗识别表位所在区域,为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原,采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠,按常规杂交瘤细胞的制备方法,经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westernblot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶(NS3蛋白的N末端13)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1()ns3p、NS3解旋酶(NS3蛋白的C末端23)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1()ns3h,将其瞬时转染COS7细胞后,以获得的单克隆抗体作为一抗,通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体,这2株MAbs均特异识别NS3蛋白,并确定了它们的结合区域。结论获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体,并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析,为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。

鼠抗丙型肝炎病毒NS3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

鼠抗丙型肝炎病毒ＮＳ３蛋白单克隆抗体的制备及鉴定潘秀珍唐家琪李越希李先富（南京军区军事医学研究所，南京２１０００２）丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是严重危害人民身体健康的病原。感染ＨＣＶ的病人血液中，很难直接检测到病毒抗原，只能通过检测病人血液中特异性抗体来...

应用抑制性消减杂交技术克隆HCV NS3蛋白反式激活基因2的上调基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因. 方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人HCV NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到61个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取30 个插入片段测序分析,得到30个已知功能基因序列. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS3TP2可能存在的调控机制的线索.

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因

目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1 的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索. 方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin- formatics),技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因. 以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR 分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因, 推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.

截短的HCV NS3蛋白的表达、纯化及应用

目的:为了发展新一代HCV检测试剂盒,使包被的NS3蛋白能提高其检测的精确度与准确度。方法:通过生物信息学方法选定目标蛋白为HCV1263a.a^1583a.a,应用PCR方法克隆出编码此部分NS3蛋白的DNA序列,连接到表达载体pQE30构建重组子pQNS3,转化工程菌株JM109后诱导表达,表达产物通过Western-blot实验证实,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化,采用ELISA方法检测纯化的蛋白在免疫检测中的应用。结果:工程菌株在IPTG诱导下表达出N端含6个组氨酸的NS3融合蛋白,分子量约为36kDa,利用纯化的目标蛋白对40份HCV抗体阳性参考品,蛋白检测的符合率为77.5%(31/40);对40份阴性参考品,检测符合率为97.5%(39/40)。结论:表达的NS3融合蛋白,具有很好的应用价值,可以应用于新一代HCV检测试剂盒以及对NS3蛋白功能的研究。

丙型肝炎核心蛋白与NS3蛋白在转基因小鼠中的表达

为研究丙型肝炎病毒核心蛋白及ＮＳ３蛋白在转基因小鼠体内的基因表达及细胞内定位，以及病毒蛋白的直接致细胞病变效应，我们采用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测了靶基因ｍＲＮＡ在转基因小鼠各种组织中的表达，用免疫组化方法分析了核心蛋白与ＮＳ３蛋白在转基因小鼠体内的表达及细胞内定位。结果表明：在转基因小鼠肝、肾、心等组织中可表达靶基因ｍＲＮＡ，核心蛋白的表达主要为核型，而ＮＳ３蛋白的表达主要为浆型。Ｚｎ２＋可诱导ｍＭＴ启动子下的靶基因表达。Ｃ与ＮＳ３蛋白的表达不引起转基因小鼠的表型与组织学发生明显改变。

苏拉明对黄病毒类NS3蛋白质合成的影响

寻找有效的抗黄病毒类药物 ,为临床应用提供理论依据。在病毒吸附培养细胞 Hep G2后加入不同浓度的苏拉明 ,4 8h后采取培养上清液及感染细胞 ,运用病毒滴度测算 ( plaque法 )、 Western blot法及 RT- PCR法 ,检测其对病毒增殖的影响。结果显示用苏拉明 5 0 μg/m l处理后产生的病毒量是对照组的 5 1.8% ,同时显示病毒 NS3蛋白质合成量减少 ,而对病毒 RNA无任何影响。提示苏拉明抑制病毒复制作用主要是阻碍了病毒 NS3蛋白质的合成。

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

用基因工程表达的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选,获得3株稳定分泌抗BVDVNS3蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1A9、2C3和5D5),其细胞培养上清液ELISA效价分别为1∶256、1∶128和1∶256,腹水ELISA效价分别为1∶128000、1∶64000和1∶128000。亚型鉴定表明,1A9、2C3和5D5分别为IgG1、IgG2a和IgG1。ELISA结果显示,3株单克隆抗体仅与BVDVNS3蛋白和BVDV反应,不与其它相关病毒反应,表明3株单克隆抗体特异性良好。这3株单克隆抗体的获得为建立BVDV免疫学检测方法奠定了基础。

猪瘟病毒NS3蛋白对牛肾细胞生长的影响

猪瘟病毒蛋白NS3被认为与培养细胞发生病变存在紧密联系,为了进一步探讨NS3蛋白单独作用及其表达水平对培养细胞CPE发生的影响,本研究构建了2种携带NS3基因的真核表达载体,分别在牛源细胞MDBK中表达NS3蛋白,利用荧光显微镜观察宿主细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western-blot检测目的蛋白表达情况。研究结果表明,2种载体均在MDBK中成功表达NS3蛋白;其中pCD-NA3.1-NS3质粒所表达的目的蛋白量较大,并使宿主细胞表现出明显的形态学变化;细胞凋亡检测结果表明NS3蛋白大量表达的宿主细胞凋亡率显著高于对照组。猪瘟NS3蛋白可以不需要猪瘟病毒其他蛋白的参与,具有直接造成宿主细胞发生病变的能力,但较低的蛋白存在水平并不能对宿主细胞造成可检测的损伤,推测活体内若能有效干扰瘟病毒NS3蛋白的产生或其功能可能会降低猪瘟或牛病毒性腹泻-黏膜病的发病率或使临床表现减轻。

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。

抗丙型肝炎病毒NS3蛋白不同型单抗制备及应用

目的 制备抗丙型肝炎病毒NS3Ⅰ、Ⅱ型单克隆抗体 ,用于转HCV全长基因细胞免疫组化定位。方法 克隆表达HCV NS3Ⅰ、Ⅱ型抗原 ,免疫Balb/C小鼠 ,通过细胞融合筛选分泌HCV NS3Ⅰ、Ⅱ的细胞株 ,制备腹水 ,纯化IgG。结果 制备出 3株抗HCV NS3Ⅰ、Ⅱ单克隆抗体 ,有 2株为IgG 1型 ,1株为IgG 2b型 ,对转HCV全长基因细胞进行免疫组化染色 ,胞浆为阳性。结论 制备的抗HCV NS3Ⅰ、Ⅱ单抗具有良好的特异性。

丙型肝炎病毒NS3蛋白真核表达载体的构建及其基因免疫研究

基因免疫是指将编码特异抗原的目的基因重组表达载体直接接种到宿主组织内，在体内表达基因产物，进而激发宿主产生特异性免疫反应。自１９９０年首次报道发现基因免疫以来，这一新的免疫技术已经在基础免疫学研究和疫苗研制等许多领域得到广泛应用。对许多疾病（如流感）...