突变型Notch 3(R90C)蛋白调控自噬诱导VSMC细胞凋亡的分子机制

目的探讨Notch 3(R90C)突变蛋白诱导VSMC细胞凋亡机制。方法采用真核细胞转染技术将Flag-Notch 3(WT)及Flag-Notch 3(R90C)质粒转入大鼠主动脉血管平滑肌细胞A10,通过Western blot检测Beclin 1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)染色检测细胞自噬空泡的变化;PI/Annexin-V-FITC检测细胞凋亡率。结果与转染Flag-Notch 3(WT)组相比,过表达Flag-Notch 3(R90C)下调细胞内源性Beclin 1蛋白的表达,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低。与转染Flag-Notch 3(WT)组相比,过表达Flag-Notch 3(R90C)诱导A10细胞自噬空泡聚集减少。与转染Flag-Notch 3(WT)组相比,过表达Flag-Notch 3(R90C)使A10细胞凋亡率增加。结论 Notch 3(R90C)突变蛋白可通过抑制细胞巨自噬水平诱导血管平滑肌细胞凋亡。

突变型NOTCH3（R90C）对少突胶质系细胞HS683增殖的影响及相关分子机制

目的探讨伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）的一种突变型基因NOTCH3（R90C）对少突胶质系细胞HS683增殖能力的影响及相关的分子机制。方法（1）以pCMV—Spot6．0为表达载体，采用定点突变法构建突变型基因NOTCH3（R90C）表达载体，真核细胞转染技术分别转染pCMV-Spot6．0空白对照载体、野生型NOTCH3（p．NOTCH3）质粒与突变型NOTCH3（p．R90C）质粒到HS683细胞，分别为转染空白对照载体组、转染野生型NOTCH3基因组、转染突变型NOTCH3基因组。转染后24h、48h、72h、96h用CCK8法检测3组细胞的增殖水平；转染后72hWestemblotting检测细胞NOTCH3蛋白和细胞周期相关蛋白p53，磷酸化（p）．p53与p21的表达。（2）实验分转染野生型NOTCH3基因组、转染突变型NOTCH3基因组、转染突变型NOTCH3基因＋Pifithrin-α组，分别转染野生型、突变型、突变型NOTCH3基因，后2组再分别加入0μmol／L、1μmol／L的Pifithrin-α。转染后24h、48h、72h、96h采用CCK．8法检测细胞的增殖水平。结果（1）转染48h、72h、96h后，与转染野生型NOTCH3基因组比较，转染突变型NOTCH3基因组的细胞吸光度值降低，差异有统计学意义（P〈0．05）；转染72h后，转染野生型NOTCH3基因组与转染突变型NOTCH3基因组细胞的NOTCH3蛋白表达量显著高于转染空白对照载体组：Western blotting检测显示转染突变型NOTCH3基因组细胞增殖周期相关蛋白p53、P-p53以及p21的表达量均明显高于转染野生型NOTCH3基因组和转染空白对照载体组，差异有统计学意义（P〈0．05）；（2）转染后48h、72h、96h，与转染突变型NOTCH3基因组比较，转染突变型NOTCH3基因＋Pifithrin—α组的细胞吸光度值增加，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论突变型NOTCH3（R90C）蛋白通过p53依赖的方式抑制少突胶质细胞的增殖．这可能是NOTCH3（R90C）突变导致CADASIL患者脱髓鞘的另一个新的致病因素。

4个具有相同突变的CADASIL家系临床特征分析

目的分析总结4个来自河南地区不同家系但具有相同突变的伴有皮质下梗死和白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebral autosomal dominantarteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)家系的影像学表现及临床特征,调查家系成员的发病情况。方法回顾性分析4个CADASIL家系先证者的影像学特征和临床特征,调查4个家系中其他成员的发病情况,对患者行Notch3基因3、4、11、18号外显子突变检测,并进行分析。结果4例先证者均以单侧肢体无力为始发症状,其中2例有高血压病史,1例合并糖尿病,1例身体健康;1例有高血压病患者影像学提示丘脑出血,患者无相关主诉;基因检测发现4例先证者及部分家系成员存在p.R607C突变位点。结论存在p.R607C突变位点的4例CADASIL患者临床上首发症状相似,但不同家系成员间存在个体化差异;高血压、糖尿病等脑血管病危险因素可存在于CADASIL患者。