NtJAZ9基因参与调控烟草腺毛发生的功能研究

【目的】探究茉莉酮酸调控烟草腺毛发生的分子机制。【方法】对茉莉酮酸信号关键抑制子NtJAZ9进行同源克隆、生物信息学分析和基因功能研究。【结果】(1)NtJAZ9有两条同源序列NtJAZ9-1和NtJAZ9-2,编码区长度分别为1008 bp和996 bp。(2)亚细胞定位结果表明NtJAZ9蛋白定位在细胞核中。在各组织中NtJAZ9-1相对表达量均高于NtJAZ9-2,NtJAZ9-1在茎表皮中表达量最高,NtJAZ9-2在叶中表达量最高。(3)NtJAZ9过表达植株叶面腺毛密度降低,NtJAZ9基因敲除植株腺毛密度显著增加,保护毛密度差异不显著。茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)可显著促进长柄腺毛的发生,喷施后过表达株系长柄腺毛密度增加1.76倍,敲除株系长柄腺毛增加0.36倍。【结论】NtJAZ9基因参与调控烟草腺毛的发生,并在一定程度上影响了MeJA信号对烟草腺毛发生的调控作用。

烟草NtJAZ15基因对腺毛发生的影响

为验证NtJAZ15对烟草腺毛发生的影响,探究NtJAZ15调控腺毛发生的分子机制,本研究从K326中克隆了NtJAZ15基因,并对其进行了生物信息学和组织表达模式分析,通过创制NtJAZ15敲除和过表达突变体,分析其对腺毛发生的调控作用。结果表明,NtJAZ15-1和NtJAZ15-2在不同烟草品种中高度保守,具有典型的TIFY和Jas结构域,属于JAZ家族。NtJAZ15在各组织中均表达,且各组织中NtJAZ15-2表达量均高于NtJAZ15-1。NtJAZ15基因敲除突变体烟叶长柄和短柄腺毛密度增加,过表达突变体则相反。qRT-PCR结果表明NtJAZ15可显著影响NtWo、NtCycB2、NtHD9、NtHD12的表达,但对NtMIXTA的表达影响不显著。因此,NtJAZ15负调控烟草长柄和短柄腺毛发生,NtWo、NtCycB2、NtHD9、NtHD12可能参与NtJAZ15调控烟草腺毛发生。

烟草腺毛中NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因表达分析

【目的】为探究NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因在腺毛发生发育中的作用。【方法】通过实时定量PCR技术分析NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因在高分泌型烤烟种质T.I.1068和非分泌型烤烟种质C110上的转录水平以及茉莉酮酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)处理C110后NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因的转录水平。【结果】(1)C110的腺毛类型以短柄分泌型腺毛和非分泌型腺毛为主,T.I.1068的腺毛类型以长柄分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛为主,MeJA处理后,C110的长柄分泌型腺毛密度增加。(2)Nt HD-ZIP IV-6、-7、-9和-14在C110和T.I.1068表皮毛中的表达水平均较高,NtHD-ZIP IV-1、-2、-3和-13在C110表皮毛中表达水平较高,NtHD-ZIP IV-12则在T.I.1068表皮毛中表达水平稍高。MeJA处理后,NtHD-ZIP IV-1、-2和-7的转录水平受到抑制,而NtHD-ZIP IV-5的转录水平上调。(3)与C110相比,Nt JAZ-1、-7、-9、-12、-13、-14和-15在T.I.1068表皮毛中的表达水平显著上调;与T.I.1068相比,Nt JAZ-11则在C110表皮毛中表达水平显著上调。MeJA处理后,NtJAZ-1、-3、-5、-7、-8、-9、-10、-12和-15的转录水平上调。【结论】MeJA对长柄分泌型腺毛有诱导作用,NtHD-ZIP IV-12和NtJAZ-1、-7、-9、-12、-13、-14、-15在T.I.1068表皮毛中的表达水平较高,而在C110表皮毛中表达水平较低。

NtJAZ1基因敲除对烟草MeJA应答反应的影响研究

【目的】探究NtJAZ1敲除对烟草响应外源茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)对生长发育、腺毛发生、烟碱生物合成的应答反应的影响。【方法】以野生型K326为对照,比较不同浓度MeJA处理下,NtJAZ1敲除的K326突变品系NK-9在种子萌发、根系发育、腺毛形态、烟碱生物合成等方面的差异。【结果】(1)MeJA处理显著抑制了种子的萌发,在100μmol/L MeJA处理条件下,K326的种子萌发率比未经MeJA处理的种子萌发率降低了85.72%,NK-9的种子萌发率比未经MeJA处理的降低了48.12%。(2)MeJA处理抑制根系发育,在300μmol/L MeJA处理条件下,K326幼苗主根比未经处理的缩短了83.33%,NK-9幼苗主根缩短了68.18%。(3)MeJA处理诱导腺毛发生,在5 mmol/L MeJA处理条件下,K326叶面长柄腺毛密度比未经处理的提高了42.55%,NK-9提高了21.05%。(4)MeJA处理促进烟碱生物合成,在5 mmol/L MeJA处理条件下,K326烟苗的烟碱含量比未经处理的提高了76.05%,NK-9提高了37.51%。【结论】NtJAZ1敲除影响了烟草对MeJA的应答反应,减缓了MeJA对种子萌发与根系发育的抑制作用,也减缓了MeJA对烟草叶面长柄腺毛发生和烟碱生物合成的促进作用。

NtCycB2和NtJAZ1共敲除对烟草腺毛密度和烟碱含量的影响

为了提高烟草的腺毛密度、腺毛分泌物和烟碱含量,从而改善烟株抗性和烟叶品质,以NtCycB2突变的多腺毛K326突变株系(hairy K326)为材料,采用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1进行基因编辑,筛选出NtCycB2与NtJAZ1基因共敲除的纯合株系J-21,并以K326和hairy K326为对照,对J-21的农艺性状、腺毛发育、烟碱生物合成和烟叶化学成分进行了研究。结果表明,J-21植株生长发育正常,主要农艺性状与K326和hairy K326无显著差异,其叶片腺毛密度比hairy K326有所降低,但比K326显著提高,腺毛分泌物含量(质量分数)提高156.35%。J-21叶片烟碱含量在现蕾期比K326和hairy K326显著提高,在烟株打顶后提高幅度明显降低,成熟期叶片烟碱含量比K326和hairy K326分别提高37.14%和32.28%。J-21烤后烟叶化学成分协调,烟碱含量比K326和hairy K326分别提高39.81%和45.32%,西柏烷类降解产物茄酮含量比K326和hairy K326分别提高217.49%和48.45%。表明NtCycB2和NtJAZ1共敲除在不影响烟株生长发育的前提下,可有效提高烟草叶片腺毛密度、促进腺毛分泌物和烟碱的积累,是进行烟草抗性和品质聚合改良的有效途径之一。

NtJAZ1基因敲除对烤烟Y2001烟碱合成和腺毛发育的影响

烟碱合成和腺毛发育与烟草品质和抗性密切相关,二者受茉莉酸信号的调控。JAZ1是茉莉酸信号途径中关键的负调控基因,为明确NtJAZ1基因敲除对烟碱生物合成、腺毛发育和分泌物积累的影响,采用CRISPR/Cas9技术对烤烟Y2001中的NtJAZ1进行编辑,获得了纯合突变株系HN。与Y2001相比,HN烟苗生长发育无明显差异,叶面腺毛密度降低,但腺头发育完善且比Y2001饱满,腺毛分泌物组分和含量(质量分数)无显著差异。烟苗叶片的烟碱含量提高19.38%,根系烟碱含量提高30.85%,根系中烟碱合成相关基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表达量极显著增加,烟苗对蚜虫抗性显著增强。NtJAZ1基因敲除虽然对烟腺毛发生有一定影响,但对腺头发育和分泌物合成有明显促进作用,可在不影响叶面分泌物组分和含量的基础上提高烟碱含量和对蚜虫的抗性。因此,NtJAZ1基因是改良烟草品质和抗性的重要靶点之一。

烟草NtCycB2基因通过茉莉酮酸途径调控腺毛发生

【目的】为了探究烟草NtCycB2调控腺毛发生的可能分子机制。【方法】采用酶联免疫吸附法(ELISA)对K326、NtCycB2过表达株系NtCycB2-M和NtCycB2敲除株系NtCycB2-OE叶片内源激素进行测定;通过实时定量PCR分析NtCycB2对茉莉酮酸(JA)合成和信号途径相关基因表达量的影响,以及NtCycB2对外源激素茉莉酮酸甲酯(MeJA)的应答模式;NtCycB2-OE株系喷施不同浓度的MeJA,对其进行叶面腺毛形态观察和密度统计。【结果】(1)植物内源性激素检测结果表明敲除NtCycB2基因后烟叶JA含量显著增加,过表达NtCycB2基因后烟叶JA含量显著降低,其他内源激素的含量未发生显著变化。(2)NtCycB2基因影响JA合成、代谢和信号转导相关基因MFP、JMT和NtJAZ-1、-8、-15表达。(3)NtCycB2转录水平受外源激素MeJA的抑制。(4)MeJA促进NtCycB2-OE植株叶面长柄腺毛的发生。【结论】部分JA信号通路相关基因的表达受NtCycB2的影响,同时JA信号可以抑制NtCycB2的表达,进而促进长柄腺毛的发生。

烟草JAZ1基因的克隆和功能分析

JAZ(Jasmonate ZIM-domain)蛋白作为E3泛素连接蛋白降解复合体SCFCOI1受体的靶蛋白,是茉莉酸信号转导途径的关键组分。为了明确JAZ基因在烟草中的功能和调控方式,通过同源克隆技术从烟草中克隆到1个JAZ1基因,并结合生物信息学和基因表达模式分析进一步预测其生物学功能。结果表明:NtJAZ1基因cDNA序列长720 bp,具有完整的开放阅读框,编码239个氨基酸。NtJAZ1蛋白含有TIFY和CCT-2(Jas结构域)两个保守结构域,其二级结构由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成,其三级结构具有TIFY超家族蛋白的结构特征。进化分析表明,NtJAZ1和番茄SlJAZ1同属1个分支,亲缘关系较近。在被黑胫病侵染发病的烟草根部,NtJAZ1的表达量最高,其次是茎和叶,推测NtJAZ1的高表达抑制了JA响应基因的表达,从而引发烟草黑胫病。

高烟碱K326定向改良材料的创制与分析

为了明确NtJAZ1基因对烟碱含量(质量分数)和烟株生长发育及品质的影响,以烤烟品种K326为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1基因进行敲除,获得了纯合突变株系NK-9。测序结果表明,NtJAZ1-1在1587~1641bp之间大片段缺失,NtJAZ1-2在1547~1548bp之间缺失了2个碱基,导致翻译提前终止。RT-PCR检测结果表明,NK-9烟碱生物合成关键基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表达水平显著提高。田间调查发现,NK-9株系生长发育正常,株高、叶数和叶宽显著高于对照K326,但叶长显著低于K326。显微观察表明,NK-9叶面腺毛密度较对照有所降低。对现蕾期、打顶期和成熟期烟碱含量检测发现,NK-9株系中部叶的烟碱含量分别比对照提高33.26%、36.41%和39.28%。烤后烟叶化学成分分析表明,NK-9常规化学成分比例协调,烟碱含量较对照提高44.91%;中性香气成分中新植二烯、类胡萝卜素类降解产物含量明显增加,但棕色化反应产物、苯丙氨酸类降解产物和茄酮含量有所降低。说明敲除NtJAZ1基因能够有效提高烟叶烟碱含量,对腺毛发育和叶面化学成分的积累也有一定影响。