CSTF3基因过表达对Nthy-ori 3-1细胞功能的影响

[目的]研究CSTF3在甲状腺癌发生中的功能及其机制。[方法]慢病毒感染筛选构建CSTF3过表达Nthy-ori 3-1细胞株,CCK8和细胞成克隆实验检测细胞增殖能力,划痕实验评估细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,紫外照射处理细胞后全外显子组测序,qPCR检测未照射及照射细胞周期、抗凋亡等基因表达。[结果]空载对照组(NC)、CSTF3过表达细胞株(OE)细胞72 h增殖率分别为:126.92%±19.57%、271.51%±27.21%(P<0.05);NC、OE细胞48 h迁移率分别为:16.83%±4.61%、60.88%±9.26%(P<0.05);NC、OE细胞7 d克隆形成个数分别为:55.67±4.11、109.00±6.68(P<0.05);NC、OE细胞24 h凋亡率分别为9.24%±0.47%、6.61%±0.08%(P<0.05)。CSTF3过表达细胞株染色体结构变异和单核苷酸突变数明显多于NC组。CSTF3过表达细胞株周期、抗凋亡等基因的表达水平显著高于NC组(P<0.05)。[结论]成功构建了CSTF3过表达的Nthy-ori 3-1细胞株,过表达促进Nthy-ori 3-1细胞增殖、迁移及成克隆能力,但抗细胞凋亡。提示CSTF3可能与染色体及单核苷酸突变相关,并且影响了周期和抗凋亡等基因的表达。

海藻-甘草含药血清对M22诱导的Nthy-ori-3-1细胞增殖的作用研究

目的 探讨海藻-甘草含药血清对人甲状腺正常细胞Nthy-ori-3-1增殖的作用,为进一步研究海藻与甘草配伍抗甲状腺肿大的作用机制奠定基础。方法 体外培养Nthy-ori-3-1细胞,使用不同浓度的促甲状腺激素受体人单克隆抗体M22作用于Nthy-ori-3-1细胞不同时间,观察M22作用的最佳浓度及时间。制备海藻-甘草含药血清,M22刺激细胞24 h后,分别给予5%、10%、15%、20%海藻-甘草含药血清干预24 h,采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡情况;透射电镜观察细胞形态;免疫荧光检测微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain3,LC3)表达情况;Western blotting检测Beclin1蛋白表达。结果 M22明显刺激Nthy-ori-3-1细胞增殖,0.125μg/mL的M22作用24 h时促增殖作用最佳(P<0.01)。经海藻-甘草含药血清干预后,细胞增殖明显抑制(P<0.05、0.01),细胞呈现明显的凋亡形态学变化,G0/G1期细胞比例明显升高(P<0.01),G2/M期细胞比例无显著性差异,细胞凋亡率明显上升(P<0.01),LC3平均荧光强度增加,Beclin1蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论 M22可刺激Nthy-ori-3-1细胞增殖,海藻-甘草含药血清抑制M22诱导的Nthy-ori-3-1细胞增殖,促进其凋亡,可能通过调节自噬来发挥抑制Nthy-ori-3-1细胞增殖的作用,以达到抗甲状腺肿大的疗效。

INTU-siRNA质粒的构建及在人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞中的筛选

目的:构建人源靶向特异INTU-si RNA质粒,转染人源性甲状腺Nthy-ori-3-1细胞以构建INTU基因沉默的Nthy-ori-3-1细胞模型,为探索Graves病的发病机制提供合适的细胞模型。方法:构建四对人源INTU序列(编号分别为INTU-29、INTU-31、INTU-33、INTU-35)si RNA质粒和空载体质粒,将空载体和四对INTU-si RNA质粒分别转染Nthy-ori-3-1细胞培养24 h,通过倒置荧光显微镜观察质粒转染细胞后的荧光表达,使用多功能酶标仪检测荧光强度,通过荧光定量PCR法验证INTU基因的沉默效率,通过蛋白质免疫印迹法验证各组细胞内INTU蛋白的表达水平,筛选沉默INTU基因效率最佳的质粒。结果:空载体和INTU-si RNA质粒转染入Nthy-ori-3-1细胞24 h后,倒置荧光显微镜和荧光酶标仪检测结果显示空载体和四组INTU-si RNA组呈现绿色的荧光表达,与正常组相比,空载体与四组INTU-si RNA组的荧光强度均显著高于正常组(P<0.01),提示质粒均转染成功。荧光定量PCR结果显示,与正常组和空载体组相比,四组INTU-si RNA组的INTU基因m RNA相对表达量均显著降低(P<0.01),其中INTU-35组表达降低最显著,INTU的m RNA表达降低了61.02%。蛋白质免疫印迹法结果显示,与正常组和空载体相比,INTU-29组和INTU-31组并无显著降低,INTU-33和INTU-35组较正常组和空载体组明显下降(P<0.05,P<0.01),其中INTU-35组最佳,INTU的蛋白表达降低了44.54%。以上结果提示INTU-35组沉默INTU基因效果最佳。结论:本研究成功构建INTU-si RNA质粒,并将该质粒成功转染人源甲状腺Nthy-ori-3-1的细胞模型。INTU-si RNA甲状腺细胞模型的构建,为进一步探索Graves病的发病机制奠定了实验基础。

杀草强诱导人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞肿瘤相关基因表达谱变化

目的以人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞为受试对象,通过差异性表达谱芯片分析,探索杀草强致人甲状腺肿瘤的相关机制。方法以1-100μg/m L杀草强处理Nthy-ori-3-1细胞24 h后,用MTT法检测其对细胞增殖的影响。以100μg/m L杀草强处理细胞24 h后,做基因表达谱分析,并用GO（Gene Ontology）分析和pathway分析芯片结果,用实时定量PCR验证芯片结果。结果 MTT结果显示,所有检测浓度杀草强对Nthy-ori-3-1细胞增殖均无显著影响。芯片结果显示,有90个基因表达显著变化,55个上调,35个下调;GO分析显示,43个基因与生物过程相关（37个上调,6个下调）,42个与分子功能相关（37个上调,5个下调）,44个与细胞组分相关（38个上调,6个下调）。Pathway结果显示差异基因共影响45条信号通路,其中10条与肿瘤发生发展密切相关。实时定量PCR验证差异基因表达与芯片结果一致。wnt5b、arnt2和bmp2基因在多条肿瘤相关通路中均有显著变化。结论杀草强可能通过多信号通路导致甲状腺肿瘤,其中wnt5b、arnt2和bmp2等基因可能是其主要靶基因。

杀草强对人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞全基因表达谱的影响

目的研究杀草强对人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞全基因表达谱的影响。方法以100μg/ml杀草强处理Nthy-ori-3-1细胞24 h后,进行全基因表达谱分析,采用实时定量PCR验证芯片结果,并用GO分析和pathway分析芯片结果。结果实时定量PCR验证差异基因表达与芯片结果一致。GO和pathway分析结果显示共检测了41 001个基因,按P<0.005和FC≤0.5或FC≥2的标准筛选,共有20个差异基因涉及44条通路。Agt、cd70、bmp2、arnt2和wint5b基因出现在多条信号通路中。结论杀草强主要影响Nthy-ori-3细胞肿瘤发生相关基因,即上调cd70和wint5b基因表达及下调bmp2和arnt2基因表达,可能是其导致甲状腺肿瘤的机制之一。

甲状腺干扰物 p, p'-DDE抑制Nthy-ori-3-1细胞LHX4和DIS3L蛋白表达

目的:观察甲状腺干扰物4,4-二氯二苯二氯乙烯(p,p’-DDE)处理甲状腺Nthy-ori-3-1细胞后,其LHX4和DIS3L mRNA水平及蛋白表达量的变化。方法:取对数生长期Nthy-ori-3-1细胞,配制0、0.5、1.0、2.0和5.0μg/ml p,p’-DDE溶液,按浓度梯度给药,处理Nthy-ori-3-1细胞。显微镜观察细胞生长状态、细胞形态。基因芯片检测基因表达谱变化,通过实时荧光定量PCR检测LHX4和DIS3L mRNA水平,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测LHX4和DIS3L蛋白表达量。结果:p,p’-DDE浓度为0、0.5、1.0和2.0μg/ml时,Nthy-ori-3-1细胞均生长正常。2.0μg/ml组细胞差异基因共33个,其中,13个基因表达下调,20个基因表达上调。与对照组比较,1.0、2.0μg/ml组细胞LHX4、DIS3L蛋白表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),1.0μg/ml组细胞LHX4和DIS3L蛋白mRNA相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:p,p’-DDE处理Nthy-ori-3-1细胞会影响LHX4和DIS3L蛋白表达水平。

新型溴化阻燃剂DBDPE对人甲状腺细胞Nthy-ori3-1的毒性研究

目的为了初步探索十溴二苯乙烷[1,2-Bis(2,3,4,5,6-pentabromophenyl)ethane,DBDPE]对人体的不良效应,以人源甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori3-1为研究对象,观察其甲状腺毒性及机制,为其风险评估提供科学依据。方法用不同浓度的DBDPE染毒Nthy-ori3-1细胞24 h,通过MTT和CFSE法分别检测细胞活力和细胞增殖能力,通过Western blot检测甲状腺激素合成关键蛋白甲状腺球蛋白(thyroglobulin,TG)、甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)、钠碘共转运体(sodium-iodine cotransporter,NIS)和调控蛋白同源盒蛋白8(paired box gene 8,PAX8)、甲状腺转录因子1(thyroid transcription factor1,TTF1)和甲状腺转录因子2(thyroid transcription factor2,TTF2)表达变化。结果2和20 mg/L DBDPE使细胞活力降低(F=2.59,F=11.43,P<0.05),细胞增殖能力无明显变化。20 mg/L DBDPE使TPO蛋白表达降低(F=2.52,P<0.05),2和20 mg/L DBDPE使NIS蛋白表达降低(F=3.78,F=11.34,P<0.05)。进一步检测了控制关键蛋白合成的调控蛋白PAX8、TTF1和TTF2表达情况,结果显示2 mg/L DBDPE使PAX8蛋白表达降低(F=3.78,P<0.05),2和20 mg/L DBDPE使TTF1蛋白表达降低(F=7.12,F=3.13,P<0.05),20 mg/L DBDPE使TTF2蛋白表达降低(F=4.05,P<0.05)。结论DBDPE能够抑制甲状腺激素合成过程,对人体可能具有甲状腺毒性风险。

基于PI3K-AKT信号通路探讨蒺藜皂苷对Graves眼病细胞凋亡的影响

目的探究蒺藜皂苷对Graves病体外细胞模型人甲状腺正常细胞Nthy-ori-3-1凋亡的影响及其分子机制。方法M22诱导人甲状腺滤泡上皮细胞株(Nthy-ori-3-1)建立Graves体外细胞模型,设对照组、模型组、蒺藜皂苷处理组(5、10、20 ng·mL^(-1))。CCK-8评估各组Nthy-ori-3-1细胞增殖能力;ELISA评估各组细胞培养液中cAMP变化;TUNEL评估各组细胞凋亡情况;免疫荧光评估各组细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3变化;Western Blot评估PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白变化。结果高浓度蒺藜皂苷促进Nthy-ori-3-1细胞凋亡,抑制Nthy-ori-3-1细胞增殖;高浓度蒺藜皂苷抑制M22诱导Nthy-ori-3-1细胞cAMP表达;高浓度蒺藜皂苷促进Bax和Caspase-3表达,抑制Bcl-2表达;高浓度蒺藜皂苷抑制p-PI3K和p-AKT表达。结论高浓度蒺藜皂苷抑制PI3K-AKT信号通路促进Graves细胞凋亡。

长链非编码RNA CCAT1对人乳头状甲状腺癌侵袭和迁移能力的影响

目的检测长链非编码RNA CCAT1在人乳头状甲状腺癌中的表达,并观察下调表达CCAT1对人乳头状甲状腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法检测人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1及人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1中CCAT1的水平,在TPC-1细胞中转染CCAT1 siRNA质粒,利用Transwell小室及划痕实验观察下调表达CCAT1对细胞侵袭和迁移能力的影响,通过Western blot检测BRAF、MUC15、RKIP蛋白的变化。结果人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1中CCAT1的水平明显高于人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1;在TPC-1细胞中下调表达CCAT1后能够明显抑制细胞的侵袭和迁移能力;Transwell侵袭实验和迁移实验显示下调表达CCAT1组TPC-1细胞的穿膜数与对照组比较明显减少。划痕实验中下调表达CCAT1后细胞间距较对照组明显增大,提示细胞运动能力减弱。同时下调表达CCAT1可明显降低细胞中BRAF、MUC15的表达,增高RKIP蛋白的表达。结论人乳头状甲状腺癌中长链非编码RNA CCAT1较正常甲状腺细胞明显升高;在乳头状甲状腺癌中下调表达CCAT1可抑制细胞的侵袭、迁移运动能力,并且可能通过影响BRAF、MUC15、RKIP蛋白的表达发挥上述功能。

桥本氏甲状腺炎实验模型构建研究进展

桥本氏甲状腺炎是一种自身免疫性疾病,临床检查以血清中TPOAb和TgAb的滴度显着增加为主,病理表现为淋巴细胞浸润、正常的甲状腺滤泡变小萎缩、间质纤维化。桥本氏甲状腺炎的实验模型构建是研究疾病的发病原因、病理机制和治疗方法的基础,本文主要从构建实验性桥本氏甲状腺炎的动物选择、动物模型构建方法、动物模型评价指标和细胞实验选择及相关机制验证方面进行综述,通过比较相关造模方式的优缺点,为相关工作者的基础研究提供参考和借鉴。

miR-155在亚急性甲状腺炎炎症进展中的调控作用研究

目的研究miR⁃155对亚急性甲状腺炎(SAT)炎症进展的调控作用。方法收集SAT患者39例、同期健康体检者36例,分别设为SAT组、正常组,检测研究对象血清miR⁃155表达水平及细胞因子[白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]含量,并对miR⁃155表达水平与炎症(白细胞计数、红细胞沉降率、超敏C反应蛋白)、甲状腺功能[甲状腺球蛋白(TG)、游离三碘甲腺原氨酸(FT_(3))、游离甲状腺素(FT_(4))、促甲状腺激素(TSH)]指标进行相关性分析。TNF-α(0、1、5、25μg·L^(-1))诱导人甲状腺正常细胞(Nthy-ori 3-1),构建甲状腺细胞炎症模型,利用脂质体转染oligoRNA调控细胞内miR⁃155表达水平,荧光显微镜鉴定转染效率,PCR法检测miR⁃155及IL-6、IL-8、IL-1βmRNA表达水平,ELISA法检测IL-6、IL-8、IL-1β释放水平。结果①SAT患者血清中miR⁃155水平及IL-6、TNF-α含量高于正常人群(P<0.05)。②SAT患者血清中miR⁃155的表达水平与IL-6(P<0.01,r=0.859)、TNF-α(P<0.01,r=0.958)、FT_(3)(P<0.05,r=0.641)、FT_(4)(P<0.01,r=0.775)呈正相关。③TNF-α可以上调Nthy-ori 3-1的miR⁃155表达水平,诱导IL-6、IL-8、IL-1βmRNA表达及释放,并存在浓度依赖趋势。④转染oligoRNA 6 h后,转染效率达到约90%;与阴性对照组相比,miR⁃155模拟物(mimics)(30 nmol·L^(-1))可以显著上调miR⁃155(P<0.05),miR⁃155抑制物(inhibitor)(100 nmol·L^(-1))可以显著下调miR⁃155(P<0.05)。⑤过表达miR⁃155后,IL-1β、IL-6及IL-8的mRNA表达及释放升高(P<0.05);下调miR⁃155表达后,TNF-α诱导的IL-1β、IL-6及IL-8的mRNA表达及释放被抑制(P<0.05)。结论miR⁃155在SAT中有促进炎症进展的作用,为中医药治疗SAT作用靶点研究提供了新的方向。

IRE1通路在高碘诱导甲状腺细胞凋亡中的作用

目的观察IRE1通路在高碘诱导甲状腺细胞凋亡中的特征,进一步分析高碘诱导甲状腺细胞凋亡的作用机制。方法用0(对照)、1、10、50 mmol/L的碘化钾(KI)染毒体外培养的Nthy-ori 3-1细胞,24 h后采用流式细胞术检测Nthy-ori 3-1细胞凋亡率,用荧光定量PCR及Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、肌醇需求酶-1(IRE1)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)基因蛋白的表达水平。结果与0(对照)、1、10 mmol/L KI染毒组相比,50 mmol/L KI染毒组细胞凋亡率升高(P<0.05);与对照组相比,各染毒组GRP78、IRE1 mRNA表达水平均无统计学差异(P>0.05),CHOP mRNA表达水平升高(P<0.05),GRP78、IRE1和CHOP蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论内质网应激中IRE1通路可能没有参与高碘诱导的Nthy-ori 3-1细胞凋亡过程。