猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因在毕赤酵母中的表达

根据酵母表达系统的密码子偏爱性、poly(A)信号以及外源基因mRNA5’端的二级结构等特性 ,对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)ORF6基因进行简并改造和人工合成 ,然后以正确的读码框架插入到分泌型酵母高效表达载体pPICZαA的α因子信号肽编码序列 3’端 ,构建成酵母转移载体 ,用化学方法转化受体酵母菌GS115 ,经PCR和酶切鉴定证实 ,目的基因已整合到重组酵母菌染色体中。对重组酵母进行诱导表达 ,并通过SDS_PAGE和Westernblot分析进行筛选 ,获得了一株高效表达目的蛋白的重组酵母菌 ,该重组蛋白具有免疫学活性 ,其表达水平可达 2 .0g/L 。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,构建原核表达载体pET-ORF6。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSVORF6基因获得表达。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体。经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应。兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。

斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析

利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行10%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明,大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-GP6融合蛋白相符,表达产物以可溶的形式存在。Western blot分析表明,融合蛋白能够与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4ORF6基因的克隆与序列分析

将猪繁殖与呼吸综合征 ( PRRS)病毒 BJ- 4株在 HS.2 H细胞上增殖 ,经超速离心浓缩病毒。用 TRIZOL LS试剂提取病毒基因组 RNA后 ,用 RT- PCR方法特异性扩增 PRRS病毒 BJ- 4的 ORF6基因片段 ;经Sma 酶切鉴定正确后 ,将 PCR产物克隆到p GEM- Teasy载体上 ,经 Amp/IPTG/X- Gal平板筛选、酶切鉴定和质粒 PCR鉴定 ,初步获得含 ORF6基因的阳性重组质粒 p GEM-T- ORF6。对重组质粒进行序列测定 ,并同美洲代表株 VR2 332和欧洲代表株 L V进行比较 ,结果表明 ,BJ- 4 ORF6与 VR2 332的ORF6差异较小 ,核苷酸和氨基酸同源性均为 99.43% ;而与 L V株的差异性较大 ,核苷酸同源性为 70 .6 % ,氨基酸同源性为 77.4%

PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建

以PRRSV细胞培养物为模板,经RT-PCR扩增得到ORF5/ORF6基因,该产物和pIRES真核表达载体分别经双酶切,连接构建pIRES-ORF5/ORF6。经PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了真核表达载体pIRES-ORF5/ORF6。测得的ORF5/ORF6序列与VR-2332株的氨基酸同源性分别为99%和100%,属北美洲型。

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因核酸疫苗的构建

为了进一步研究PRRSV新型疫苗,为有效控制PRRSV,试验采用RT-PCR的方法扩增出PRRSV M蛋白基因片段ORF6,将该基因克隆到pMD18-T载体,并通过序列分析软件对其核苷酸和氨基酸同源性进行分析。在此基础上以pIRES-neo为载体,构建含有ORF6基因的重组核酸疫苗质粒pIRES-ORF6。结果表明:该PRRSV辽宁分离株属于北美型毒株,重组核酸疫苗质粒pIRES-ORF6构建成功。

高致病性PRRSV河南分离株ORF6基因的克隆与遗传进化分析

猪繁殖与呼吸障碍综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）引发的猪的一种病毒性传染病，主要临床症状为怀孕母猪早产、流产、产木乃伊胎，以及仔猪呼吸道症状和高死亡率。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因的克隆与序列分析

以期从结构上阐明猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的生物学特性,为研究病毒的基因功能和遗传变异提供资料。本文采用RT-PCR技术,对NV/Nx/2008猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF6基因进行了克隆,并对其序列进行比对,结果显示M蛋白在蓝耳病各血清型间高度保守;分子中含有2个糖基化位点及多个酪蛋白激酶II、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点和氨基化位点;空间结构和烟酰胺核苷酸转氢酶结构域III的空间结构相似。

猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF6基因的克隆

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病，该病毒0RF6基因编码的膜基质蛋白又称M蛋白。根据Gen—bank上公布的PRRSVVR2332M基因核苷酸序列设计了一对特异性引物．并应用RT—PCR方法扩增出M蛋白的目标基因。将PCR产物克隆到pMDl8－T载体，筛选获得重组质粒PMD—M，并将其转入受体菌DH5a感受态细胞中，通过电泳检测分析获得PRRSVM基因。该研究对于PRRS的流行病学调查、病原学研究及诊断均具有重要意义。

稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/ORF6基因重组鸡痘病毒的构建与小鼠免疫试验

本试验构建了1株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)RF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒,并进行了小鼠免疫实验,对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表明,重组鸡痘病毒能够刺激免疫鼠产生特异性PRRSV ELISA抗体,促进特异性T淋巴细胞增殖。对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明,IFN-γ的分泌显著提高。结果表明,所构建重组鸡痘病毒可以对小鼠起到良好的免疫效果,具有成为抗PRRSV感染新型疫苗的潜力。

空肠弯曲菌脂多糖基因ORF6在脂多糖生物合成中作用的研究

〔目的〕研究空肠弯曲菌脂多糖基因ORF6在脂多糖生物合成中的作用。〔方法〕通过同源搜索 ,推测基因ORF6的可能功能 ;通过PCR扩增基因ORF6,将基因ORF6插入质粒载体pBluescript中 ,再通过抗卡那霉素弹夹的插入 ,使基因ORF6失活 ;通过自然转移 ,失活的ORF6基因与野生株空肠弯曲菌的常染色体融合而产生突变株 ;通过银染色、蛋白质印迹对突变株脂多糖进行分析 ;结合同源搜索的结果 ,推测基因ORF6的可能功能。〔结果〕ORF6DNA序列与鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和脆弱类杆菌 (Bacteroidesfragilis)的转氨酶基因相似 ;通过自然转移得到基因ORF6失活突变株 ;基因ORF6突变株的脂多糖比野生株的脂多糖短 ,基因ORF6的改变影响空肠弯曲菌血清反应。〔结论〕基因ORF6在脂多糖的生物合成中起着重要作用 ;基因ORF6很可能是一种氨基转移酶。

猪繁殖和呼吸综合症病毒河南地方株ORF5/6基因的克隆及真核表达

应用RT-PCR方法分别扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)河南地方株的ORF5和0RF6基因。将扩增基因克隆入真核表达载体pcDNA3.0中,设计不同引物自行构建重组质粒PcDNA-ORF5、ORF6和pcDNA-ORF5/6。运用磷酸钙法将重组质粒分别瞬时转染293T细胞,经流式细胞和westbloting试验分析表明共表达重组质粒PcD-NA-ORF5/6表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,而pcDNA-ORF5-ORF6在293T细胞很难检测到蛋白表达。该结果表明蛋白质生物活性和其蛋白质空间构象有一定关系,也为下一步进行构建PRRSV假型病毒来研究ORF5/6蛋白的结构与功能的关系奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒2型TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

为了准确、特异、高效地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒2型(PRRSV2),本研究根据GenBank上登录的PRRSV2不同谱系流行毒株的ORF6基因序列,选取保守区域设计合成了1对特异性检测引物和1条MGB探针,经优化退火温度、引物和探针比例等反应条件及敏感性、特异性、重复性试验,建立了检测PRRSV2的TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果:以猪繁殖与呼吸综合征病毒1型(PRRSV1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪细小病毒(PPV)等阳性核酸为模板,均无扩增;对标准质粒的最低检测下限为1×10^(1)copies/μL,建立的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数R2为0.994;稳定性和重复性好,批内和批间变异系数均小于1.78%。应用该方法对保留的30份临床阳性样品进行检测,结果阳性100%,Ct值在22~36间。综上,本研究建立的TaqMan MGB荧光定量PCR方法可用于临床和实验室中PRRSV2的快速检测,为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供了技术支持。

广东省猪生殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因的变异分析

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(ATCC VR-2332)基因序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF5和ORF6基因的引物,利用RT-PCR从广东省送检的5份病料中均分别扩增得到了大小约787、630和550 bp的片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD 18-T载体并测序.应用DNAStar软件分析,并与国内外已发表毒株和疫苗株(RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV)、LV4.2.1株的序列进行比较.结果显示,这5个毒株与CH-1a、HB-1(sh)、BJ-4、ATCC VR-2332、疫苗株等毒株ORF3、ORF5、ORF6的核苷酸同源性分别为87.2%～98.7%、85.4%～96.8%、91.8%～98.9%,推导的氨基酸同源性分别为84.6%～97.6%、84.5%～95.5%、94.8%～98.9%;而与LV4.2.1株的核苷酸同源性分别为56.1%～58.3%、54.4%～57.0%、62.2%～64.4%,推导的氨基酸同源性分别为53.9%～56.7%、54.0%～57.0%、78.0%～80.3%.基因系统发育树表明,广东省流行的PRRSV与HB-1(sh)株的亲缘关系比较近.

PRRSV ORF6及IL-18基因重组真核质粒试验免疫研究

将本实验室构建的重组质粒接种PRRSV的自然宿主断奶仔猪,分析其诱发细胞免疫和体液免疫应答的能力。结果表明:重组质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6免疫组在首免后14d开始产生特异性抗体,且其产生抗体水平随时间呈上升趋势,但pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6两组之间产生抗体差异不显著(P>0.05)。中和抗体检测结果显示只有pEGFP-ORF6在首免后42d有低水平的中和抗体产生。细胞免疫检测结果表明,pEGFP-IL18-ORF6诱导T淋巴细胞增殖和促进IFN-γ和IL-2的分泌的能力显著高于pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18(P<0.05),表明IL-18有效地发挥了分子其佐剂的效用,能增强细胞免疫应答并介导较好的Th1类免疫反应。

共表达与牛疱疹病毒1型VP22融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒E及M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性观察

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因工程疫苗,以伪狂犬病毒(PRV)gE基因缺失标志疫苗株TK-/gE-/LacZ+为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22(BHV-1 VP22)融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒(rPRV)TK-/gE-/VP22E+/VP22M+。经PCR、Southern blot、Westernblot证实rPRV构建正确,并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应,并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK-/gE-/E+与TK-/gE-/E+/M+进行比较。结果显示TK-/gE-/VP22E+/VP22M+可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应,BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。

山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征

为揭示2009~2010年山东地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的分子特征,通过RT-PCR扩增采自山东地区不同猪场病猪组织样本中PRRSV的Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7序列,用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株、欧洲型LV株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较。结果表明,Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型VR-2332的同源性分别为77%~79.9%、88.3%~89.6%、94.9%~95.8%、93.3%~94.1%,与欧洲型LV株的同源性分别为29.6%~31.6%2、64.1%~64.8%、68.3%~68.6%、66.2%~67.3%,证明山东地区的PRRSV毒株仍属北美洲型。系统进化分析表明它们与国内2006~2010年间的分离株（变异株）亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远,未发现传统毒株。在Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7基因上均有不同程度的点突变。本研究揭示了山东地区流行的PRRSV各基因的变异特征,为PRRSV的综合防控提供理论依据。