副猪嗜血杆菌OmpP2基因分子特征及重组乳酸菌的构建与鉴定

猪格拉瑟病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的主要细菌性传染病。构建安全、有效的新型疫苗是防控该病的研究热点。本研究对OmpP2基因编码的蛋白质进行生物信息学预测分析后,应用无缝克隆技术把PCR扩增获得的OmpP2基因连接到pNZ8148载体,构建出pNZ8148-OmpP2重组载体,转入乳酸乳球菌感受态细胞,获得pNZ8148-OmpP2重组乳酸乳球菌;再进行蛋白表达与鉴定。结果表明:生物信息学预测到OmpP2蛋白具备优势B细胞和T细胞表位,是具有潜力的候选抗原;经重组乳酸乳球菌蛋白表达与鉴定,检测到大小约为38.5kD的目的条带,与预期大小相符。说明乳酸乳球菌能作为递送载体成功表达G.parasuis异源蛋白。本实验为后续G.parasuis乳酸菌活载体疫苗的研制奠定了基础。

副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2基因的克隆及表达

为了获得副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2分泌性蛋白分子,克隆了该蛋白编码序列,约1 081bp,成功构建pET28a-OmpP2原核表达质粒,并将其转化到大肠埃希菌BL21(DE3)菌株。经0.4mmol/L终浓度IPTG、32℃诱导5h后,目的蛋白表达量最高。Western blot检测表明,该蛋白与副猪嗜血杆菌阳性血清发生特异性反应,说明该蛋白有良好的反应原性,为今后研究OmpP2的生物学特性及对HPS的血清学诊断、亚单位疫苗的开发奠定了基础。

副猪嗜血杆菌ompP2基因在猪肺泡巨噬细胞中的表达

为了进一步研究副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的功能,根据已发表的副猪嗜血杆菌核苷酸序列,设计并合成1对引物,PCR扩增HPS LZ株外膜蛋白ompP2基因,获得大小为1 158bp的核苷酸片段,该片段纯化后克隆至pEASY-Blunt载体,转化后鉴定,再与真核表达质粒pCI-neo经过酶切和连接反应,转化感受态大肠杆菌Trans-T1,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。通过脂质体法将pCI-neoompP2转染猪肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测重组质粒是否表达。结果显示,成功构建了含ompP2基因的副猪嗜血杆菌真核表达载体pCI-neo-ompP2,提取转染该质粒的猪肺泡巨噬细胞的mRNA,进行RT-PCR扩增,在1 000bp^2 000bp之间可见1条明显的条带。Western blot发现在42ku处出现目的条带。试验结果为后期研究副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的机理奠定了基础。

副猪嗜血杆菌OmpP2基因的克隆及生物学信息分析

为了研究副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2基因的结构特征及编码蛋白的功能,根据GenBank中HPS OmpP2基因的DNA序列设计引物,以HPS血清13型江西分离株的基因组为DNA模板,利用PCR扩增OmpP2基因,并将其克隆到pMD18-T载体,进行测序及生物信息学分析。结果表明,此序列编码364个氨基酸,与GenBank上登录的OmpP2序列核苷酸同源性为98.7%~100%,其中与湖北F641株的同源性最高,达到100%;蛋白质的分子理论值为39.14ku,理论等电点为9.14;第1位~第20位氨基酸残基组成信号肽,属于分泌型蛋白;所编码的蛋白属于亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主。研究获得了HPS OmpP2基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆鉴定及序列分析

本文用PCR技术对华南地区分离的15株不同血清型副猪嗜血杆菌菌株和2株国际参考菌株的外膜蛋白编码基因ompP2基因进行克隆鉴定，并以CLUSTALS1和PHYLIP-3.68软件将ompP2基因序列进行比对和遗传进化分析。17株副猪嗜血杆菌菌株均能扩出ompP2基因，克隆测序结果发现ompP2基因长度为1077~1092bp，其中菌株H37、H38和H49中P2存在两段34~39个氨基酸的保守插入序列。β折叠预测结果显示H37、H38和H49比其他菌株多一个环结构。遗传进化分析显示H37、H38和H493株含有插入片段的菌株聚为一群，与其他菌株遗传距离相对较远。上述结果为进一步验证ompP2蛋白的功能及相关研究奠定了基础。

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌的外膜蛋白ompP2基因,序列测定结果表明扩增片段全长1 188bp。将扩增片段插入表达载体pET-32a,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证实重组融合蛋白约为60 000,West-ern-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白ompP2作为抗原,建立副猪嗜血杆菌的抗体间接ELISA检测方法。通过试验确定最佳反应条件为抗原包被质量浓度4.75mg/L,4℃包被过夜,待检血清的稀释浓度为1∶40,阳性判断标准为D630大于0.383。特异性和重复性试验表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于副猪嗜血杆菌的检测。

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆鉴定及序列分析

用PCR技术对华南地区分离的17株不同血清型副猪嗜血杆菌菌株ompP2基因进行克隆鉴定,并以CLUSTALS1和PHYLIP-3.68软件将ompP2基因序列进行比对和遗传进化分析。17株副猪嗜血杆菌菌株中均能扩出ompP2基因,克隆测序结果发现ompP2基因大小有所不同,与参考序列ABKM01000007的同源性在92%～99%之间。序列比较结果显示,ompP2基因与GenBank公布的副猪嗜血杆菌全基因组测序中的ompP2基因序列具有较高的同源性,不同菌株ompP2基因序列大小存在差异,为进一步验证ompP2蛋白的功能及相关研究奠定了基础。

山东省副猪嗜血杆菌分子流行病学调查及其外膜蛋白P2基因的表达纯化

根据副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白(outer membrane proteins,Omp)P2基因序列(GenBank登录号:FJ685754.1)设计引物,对2015～2016年在山东省不同地区采集的225份病料进行PCR扩增和遗传演化分析,结果发现2015年和2016年Hps检出阳性率分别为7.63%、7.48%,细菌分离确定225份样品中17份为阳性;Hps菌株之间的氨基酸同源性在86.7%～99.7%,同源性较高的蛋白具有交叉反应性。构建Hps omp P2基因原核表达载体,确定OmpP2蛋白的最佳诱导温度,通过亲和层析Ni-IDA树脂纯化,获得高纯度的OmpP2蛋白,Western blot确定纯化的OmpP2蛋白与不同血清型的Hps阳性血清均存在良好的反应原性。本研究为进一步探索Hps OmpP2的生物学特性及对副猪嗜血杆菌病的血清学诊断、亚单位疫苗的开发奠定了基础。