微小扇头蜱P0基因的克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

为探究微小扇头蜱P0基因序列特征,预测P0蛋白的理化性质和二、三级结构,筛选出P0蛋白的B、T优势抗原表位,本研究克隆了微小扇头蜱P0基因,运用Clustal X软件分析P0基因序列特征,用在线软件EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL预测P0蛋白的理化性质和二、三级结构,用在线软件ABCpred Prediction、Scratch、IEDB和NetCTL筛选P0蛋白的B、T优势抗原表位。试验结果显示:微小扇头蜱P0基因全长957 bp,碱基A含量为24.0%,T含量为20.3%,G含量为27.5%,C含量为28.2%,A+T含量为44.3%,G+C含量为55.7%,共编码318个氨基酸;P0蛋白分子量为34 ku,理论等电点(pI)为5.86,平均亲水系数为-0.153,不稳定指数为38.15;P0蛋白的二级结构含163个α螺旋(占比51.25%),130个无规卷曲(占比40.88%),25个延伸链(占比7.86%),其中以α螺旋为主要结构;P0蛋白的三级结构以α螺旋的含量最高,该蛋白的全局模型质量评估(global model quality estimation, GMQE)、定性模型能量分析(qualitative model energy analysis, QMEAN)值分别为0.49和0.52±0.05,无信号肽和跨膜结构域,但存在40个磷酸化位点和1个糖基化位点;P0蛋白有13个B淋巴细胞优势抗原表位和6个T淋巴细胞优势抗原表位。综上所述,微小扇头蜱P0基因序列呈GC偏好,P0蛋白是以α螺旋为主要结构成分的亲水性酸蛋白,具有B、T淋巴细胞优势抗原表位,是今后研制防控微小扇头蜱疫苗的理想靶标。

马铃薯卷叶病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其与AGO蛋白的相互作用

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)P0是由开放阅读框1(ORF1)所编码,利用农杆菌介导的瞬时表达技术渗透注射转绿色荧光蛋白(GFP)基因的16c烟草叶片发现PLRV-P0能够抑制由GFP mRNA引起的基因沉默,结果表明PLRV-P0是马铃薯卷叶病毒编码的一个基因沉默抑制因子。通过序列分析发现PLRV-P0基因序列中含有两个重复的WG基序,我们将PLRV-P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸(W)点突变为丙氨酸(A)(命名为P0WA),构建植物表达载体pCAMBIA1300-CE-P0,pCAMBIA1300-CE-P0WA,农杆菌渗透注射本氏(Nicotiana benthamiana)烟草叶片,通过荧光显微镜观察发现PLRV-P0和AGO共同注射后有绿色荧光出现而PLRV-P0WA和AGO共同注射后则没有绿色荧光出现。研究结果初步表明,PLRV-P0能够和AGO蛋白发生相互作用,重复的WG基序是其与AGO蛋白相互作用的关键氨基酸。

甘蔗黄叶病毒P0蛋白分子特性及其抑制RNA沉默活性

【目的】甘蔗黄叶病(yellow leaf,YL)是一种主要的甘蔗病毒病害,在全球多数甘蔗种植国家或地区普遍发生,已对甘蔗生产造成严重威胁。其病原为甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV),属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员。研究SCYLV编码的沉默抑制子P0蛋白的分子特征、保守结构域及其在自然寄主甘蔗上抑制RNA沉默的功能,为下一步从RNA沉默水平解析SCYLV致病分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR克隆技术获得SCYLV中国分离物CHN-FJ4编码的RNA沉默抑制子基因P0及其两个缺失突变体P0Δ2-15(N端缺失15个氨基酸)和P0Δ155-256(C端缺失102个氨基酸),然后定向克隆到单子叶植物表达载体p Ubi-nos(空载体)上,获得重组质粒。利用甘蔗嫩叶组织瞬时表达系统鉴定病毒RNA沉默抑制子技术,结合Image J软件定量分析P0及其两个缺失突变体抑制外源基因EYFP瞬时表达活性的变化。番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)编码的P19作为沉默抑制子阳性对照。【结果】P0核苷酸序列的遗传进化分析结果显示,所获得的SCYLV病毒分离物CHN-FJ4为BRA基因型,与其他BRA基因型分离物氨基酸序列一致性为96.1%—98.4%。利用MEME在线软件预测P0蛋白的保守结构域,结果表明P0蛋白含有3个显著的保守区。分别位于第1—60、76—125和161—210氨基酸残基。通过Datamonkey在线服务器(http://www.datamonkey.org)提供的5种运算方法分析P0蛋白氨基酸位点的选择压力,结果显示P0蛋白具有8个氨基酸正向选择位点。将含有P0及其缺失突变体的重组质粒连同含EYFP报告基因的p TEM12质粒采用基因枪轰击法分别导入甘蔗嫩叶组织细胞,轰击后48—120 h,P0和P19逐渐地提高EYFP荧光表达点数和荧光表达水平;在120 h,与p Ubi-nos空载体(不含沉默抑制子)对照组相比,P0和P19均显著地提高甘蔗嫩叶组织EYFP荧光表达点数和荧光表达水平,分别达1.6倍和4.0倍以上。P0与P19抑制RNA沉默活性水平没有显著差异(P>0.05)。P0蛋白N端缺失15个氨基酸(P0Δ2-15)和C端缺失102个氨基酸(P0Δ155-256)均丧失了沉默抑制子的功能,荧光表达与不含沉默抑制子对照组相当。【结论】在甘蔗嫩叶组织EYFP瞬时表达体系上,P0能够显著地提高外源基因EYFP表达水平。P0蛋白N端15个氨基酸和C端102个氨基酸含有显著的保守区域,是P0发挥沉默抑制子功能所必需的。

重组RPLP0蛋白的表达、鉴定及评价

目的:构建重组RPLP0蛋白的原核表达载体并诱导表达,对表达产物进行纯化鉴定及评价。方法:设计重组RPLP0蛋白基因,经PCR扩增获得目的基因;在其5′和3′端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,构建pET41a-GST-RPLP0-6*His融合基因表达载体;对该质粒载体进行酶切鉴定和测序验证,将鉴定正确的重组质粒载体转化至大肠杆菌并以IPTG诱导表达;经过尿素溶液纯化及复性以后得到复性的重组RPLP0蛋白;采用Western blot分析重组RPLP0蛋白的免疫原性;采用ELISA法对其抗体结合性、特异性进行分析。结果:酶切及测序结果显示,本实验成功克隆出重组RPLP0蛋白基因,将获得的目的基因构建至原核表达载体pET41a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示重组RPLP0蛋白为包涵体表达蛋白,分子量约为61 kD。Western blot检测显示重组RPLP0蛋白具有完全的免疫原性;ELISA检测显示重组RPLP0蛋白具有良好的抗体结合性和特异性。结论:表达、鉴定并分析了重组RPLP0蛋白,为深入研究RPLP0蛋白的功能及应用奠定基础。

LMP1调节鼻咽上皮与鼻咽癌组织中p27与RPLP0蛋白的表达

目的:观察p27和核糖体磷酸化蛋白大亚基P0(RPLP0)蛋白在潜伏膜蛋白1(LMP1)阳性鼻咽癌细胞中的表达,揭示蛋白质之间的相互作用规律及临床病理学意义。方法:采用Western blotting分析p27和RPLP0蛋白表达与LMP1表达之间的关系,S-P免疫组织化学染色检测LMP1、p27和RPLP0蛋白在30例鼻咽上皮组织和60例鼻咽低分化鳞状细胞癌中表达,并分析其临床病理学意义。结果:(1)LMP1在鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为73.3%和90.0%;(2)与LMP1(-)组织比较,p27蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌中表达降低,而RPLP0蛋白表达与之相反;(3)p27蛋白和RPLP0蛋白表达与鼻咽癌患者年龄、LMP1蛋白的表达、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05),患者年龄小、LMP1(-)、无淋巴结转移、TNM I期和II期时,p27蛋白表达阳性率较高,而RPLP0蛋白表达则反之(P<0.05)。结论:LMP1在鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌中下调p27和上调RPLP0蛋白的表达;鼻咽癌患者年龄小、LMP1(-)、无淋巴结转移、TNM I期和II期时,p27蛋白表达阳性率较高,而RPLP0蛋白表达则与之相反。

转染人TGF-β1基因对大鼠系膜细胞酸性核糖体蛋白P0表达的影响

目的筛选转染人转化生长因子β1(TGFβ1)基因的大鼠系膜细胞相关反应性基因,并观察TGFβ1对其中之一的酸性核糖体蛋白P0的影响。方法筛选经SSHPCR和反向杂交法构建的大鼠系膜细胞TGFβ1相关反应性基因cDNA消减杂交库,并进行测序及与GenBank资料作同源性比较;分别用NorthernBlot、半定量RTPCR观察TGFβ1、酸性核糖体蛋白P0基因在培养的大鼠系膜细胞和动物模型体内表达的变化。结果经筛选获得的28个反应性基因cDNA片段,长度为59～535bp,其中7个片段均和已知酸性核糖体蛋白P0基因同源性一致。在转染TGFβ1的大鼠系膜细胞中P0基因mRNA表达增强;在大鼠抗Thy1系膜增生性肾小球肾炎模型的病变肾组织中,P0基因mRNA和TGFβ1基因mRNA的上调表达趋势一致。结论酸性核糖体蛋白P0是一个与TGFβ1基因表达密切相关的基因,可能参与TGFβ1介导的肾小球肾炎和肾小球硬化的发生机制。

大鼠耳蜗神经和坐骨神经P0蛋白的DNA序列和mRNA水平比较

目的 P0蛋白与内耳和周围神经自身免疫性疾病的发生有关,本研究拟通过比较耳蜗神经和坐骨神经中该蛋白的一致性和mRNA水平,为自身免疫性内耳病的诊治提供线索。方法分别提取36只SD大鼠的耳蜗神经和坐骨神经总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及半定量RT-PCR测试P0蛋白的mRNA表达水平,将RT-PCR产物进行cDNA序列测定,比较大鼠耳蜗神经和周围神经P0蛋白的cDNA序列和mRNA转录水平。结果大鼠耳蜗神经和坐骨神经P0蛋白的cDNA序列相同,但二者之间的mRNA转录水平有显著性差异。结论大鼠耳蜗神经和坐骨神经的P0蛋白具有一致性,其mRNA转录水平有显著性差异。

抗核糖体P0蛋白抗体、抗dsDNA抗体等自身抗体在自身免疫性疾病诊断中的意义

目的:研究抗核糖体P0蛋白抗体、抗dsDNA抗体等自身抗体在SLE及其它自身免疫性疾病诊断中的意义。方法:采用线性免疫分析法检测137例SLE患者及156例其它自身免疫性病患者(75例类风湿关节炎、39例强直性脊柱炎、27例干燥综合征、15例皮肌炎)血清中抗P0抗体、dsDNA抗体、抗SmD1抗体、抗核小体抗体、抗SSA60抗体、抗SSB抗体等抗体,比较以上抗体在SLE及其它自身免疫性疾病诊断中的意义。结果:抗P0抗体、dsDNA抗体、抗SmD1抗体、抗核小体抗体、抗SSA60抗体、抗SSB抗体等抗体诊断SLE的敏感性,分别为37.23%、52.55%、29.2%、26.28%、57.66%、49.64%、32.85%。抗P0抗体、dsDNA抗体、抗SmD1抗体、抗核小体抗体在SLE诊断有较高的特异性,分别为98.08%、98.72%、94.87%、96.15%。抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB抗体特异性较差,分别为48.08%、53.85%、66.03%。结论:在诊断SLE的特异性抗体中,尽可能选择多种抗体组合,使各种抗体相互补充,定能提高SLE诊断率。

JNK信号通路介导ghrelin对乳腺癌MDA-MB-231细胞耐药蛋白表达的影响

目的探讨ghrelin调控c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号转导通路对乳腺癌细胞P-糖蛋白表达的影响。方法培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞,分别加入生长激素释放肽(ghrelin,100 nmol/L,干预72小时)、多柔比星(0.8 mg/L,干预72小时)、ghrelin联合多柔比星(ghrelin 100 nmol/L,多柔比星0.8 mg/L,干预72小时)。采用MTT方法检测细胞增殖,Western blot法检测细胞JNK、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达及p-JNK水平。结果 MTT检测显示,人乳腺癌MDA-MB-231细胞在ghrelin的干预下增殖(P<0.01),存活率在多柔比星的干预下降低(P<0.01),ghrelin联合多柔比星能够抑制多柔比星对MDA-MB-231细胞的杀伤作用(P<0.01)。ghrelin组JNK表达及p-JNK水平上升(均P<0.01),且P-gp蛋白表达上升(P<0.05);多柔比星组JNK表达及p-JNK水平下降(均P<0.01);ghrelin联合多柔比星较多柔比星组JNK表达及p-JNK水平增加,且P-gp表达明显上升(均P<0.05)。结论 ghrelin激活JNK信号通路干预乳腺癌细胞P-gp表达增加从而抑制多柔比星诱导乳腺癌细胞凋亡。

大鼠自身免疫性听神经病模型的建立

目的建立大鼠自身免疫性听神经病模型,为听神经病的研究提供动物模型。方法将健康SD大鼠60只随机分成对照组10只,实验组50只;从20只SD大鼠内耳组织中提取纯化P0蛋白(自身免疫性内耳病相关抗原),用P0蛋白免疫实验组,等量完全弗氏佐剂作为抗原免疫对照组,共免疫8周,观察免疫后大鼠血清IgG、听功能及内耳形态学的变化。结果免疫8周后,实验组大鼠血清IgG水平为1.25±0.96 g/L,较免疫前(0.34±0.27 g/L)显著升高(P<0.05);光镜下耳蜗螺旋神经元明显减少,电镜下毛细胞无明显变化,免疫后实验组顶回、中回、底回螺旋神经元数量均明显减少(P<0.05);实验组存活45只大鼠,16只(32耳)大鼠ABR波V反应阈较免疫前及对照组显著升高(P<0.05);畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE)均可正常引出,免疫前后振幅无明显变化(P>0.05),符合听神经病的听力学特征。结论应用P0蛋白免疫大鼠可成功建立大鼠自身免疫性听神经病模型,可为听神经病的研究提供实验基础。

抗核糖体P0蛋白抗体在系统性红斑狼疮诊断中的临床应用

目的研究抗核糖体P0蛋白抗体对系统性红斑狼疮(SLE)的临床诊断意义。方法分别用基因重组的核糖体P0蛋白和纯化的核糖体P蛋白作为抗原检测126例SLE患者和145例非SLE自身免疫病患者血清中抗P0抗体和抗P抗体;同时对126例SLE患者采用线性免疫分析检测抗dsDNA抗体、抗SmD1抗体、抗核小体抗体、抗SSA60抗体、抗SSB抗体等,比较以上抗体在系统性红斑狼疮临床诊断中的意义。结果 SLE患者抗核糖体P0蛋白抗体的阳性率为38.89%,非SLE自身免疫病患者组为2.07%,两组之间差异有统计学意义(χ2=56.59,P<0.01);SLE患者组中,抗P0阳性率高于抗P蛋白抗体阳性率(χ2=19.36,P<0.001);抗核糖体P0蛋白抗体诊断SLE的特异性为97.93%,抗dsDNA抗体和抗核糖体P0蛋白抗体单独阳性率较高,分别为15.08%和9.52%;抗SmD1抗体和抗核小体抗体单独阳性率较低,分别为3.17%和3.97%。结论抗核糖体P0蛋白抗体对SLE患者有高特异性和较高的敏感性,对抗dsDNA抗体、抗SmD1抗体、抗核小体抗体等抗体阴性的SLE患者有尤其重要的临床应用价值。

纯化内耳P0蛋白诱发实验性自身免疫性内耳病动物模型

目的:用从内耳组织中纯化的P0蛋白免疫豚鼠,建立P0蛋白诱发的自身免疫性内耳病动物模型,研究其在自身免疫性内耳病中的作用。方法:采用制备性SDS-PAGE从内耳组织中分离、纯化P0蛋白。以纯化的豚鼠内耳P0蛋白作为抗原免疫豚鼠,观察其听性脑干反应阈,血清中抗体水平和内耳形态学的改变,并用免疫组织化学法确定P0蛋白在耳蜗的分布情况。结果:SDS-PAGE结果显示纯化的蛋白质只在分子量为30 000的位置上出现单一的蛋白染色带,Western blot结果示该蛋白即为P0蛋白。免疫后有22%豚鼠的听性脑干反应阈升高,对照组动物无变化。实验组血清IgG显著升高(F=6.48,P<0.01),反应阈提高豚鼠的螺旋神经节细胞均有不同程度的数目减少,蜗轴小血管周围有炎性细胞浸润。P0蛋白在耳蜗仅分布于螺旋神经节、蜗轴神经纤维的髓鞘上。结论:用制备性SDS-PAGE能够成功地从内耳纯化P0蛋白,用于自身免疫性内耳病的研究。P0蛋白在部分豚鼠能够诱发自身免疫性内耳病,可能是自身免疫性内耳病的自身抗原之一。

纯化内耳P0蛋白诱发听神经脱髓鞘的实验研究

目的用从豚鼠内耳组织中纯化的P0蛋白免疫大鼠,观察实验动物听神经髓鞘变化,推测P0蛋白在听神经病的发生发展中的作用。方法采用SDS-PAGE从内耳组织中分离、纯化P0蛋白,用Western Blot法鉴定纯化的P0蛋白。用纯化的P0蛋白作为抗原免疫大鼠,观察其听性脑干反应阈、耳声发射的变化、动物血清IgG水平以及听神经的髓鞘在光镜电镜下的形态学变化,免疫组织化学技术观察P0蛋白在听神经上的分布。结果免疫后实验组大鼠听力学显示听神经病的特征:耳声发射正常,而听性脑干反应严重异常;实验组血清IgG水平显著升高。电镜下可见听神经的脱髓鞘病变,免疫组织化学技术显示P0分布在蜗神经纤维的髓鞘上。结论P0蛋白作为抗原能诱发蜗神经的脱髓鞘病变,可能是听神经病的重要发病机制之一。

系统性红斑狼疮患者抗核糖体P0蛋白抗体的临床意义

目的探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者抗核糖体P0蛋白抗体的临床意义。方法采用线性免疫分析法和免疫印迹法检测49例SLE患者及61例其他结缔组织病患者血清抗P0抗体和抗核糖体抗体（rRNP），分析抗P0抗体与rRNP抗体在SLE和其他结缔组织病中阳性率的差异及抗P0抗体与SLE临床表现和其他自身抗体的关系。结果SLE患者中抗P0抗体的阳性率为36．7％，rRNP抗体的阳性率为6.1％，二者之间差异有统计学意义（P〈0．01）；抗Pn抗体在其他结缔组织病中均为阴性。在SLE患者中，抗P0抗体阳性组皮疹的发生率为77．8％，阴性组为35．5％（P〈0．05）；抗SmD1抗体的阳性率在抗P0抗体阳性组中为61．1％，在阴性组中为19．4％（P〈0．01）。抗P0抗体对诊断SLE的敏感性为36．73％，特异性为100％，阳性预测值为100％，阴性预测值为66．30％。结论抗P0抗体对诊断SLE的特异性强，阳性预测值高。抗P0抗体与SLE皮疹和抗SmD1抗体阳性相关。

甘蔗黄叶病毒P0蛋白基因细菌双杂交诱饵载体的构建和自激活鉴定

由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank No.HQ342888),设计P0蛋白基因的一对特异性引物P0-Bait F/P0-Bait R。以实验室保存的重组质粒p MD18T-P0为DNA模板,PCR扩增P0蛋白基因。然后将P0蛋白基因和细菌双杂交诱饵质粒p BT分别进行双酶切后,连接构建重组诱饵质粒p BT-P0。经PCR扩增、双酶切鉴定和序列分析,表明获得了细菌双杂交重组诱饵载体p BT-P0,且编码框正确。将重组载体p BT-P0转化细菌双杂交系统Bacterio Match RⅡScreening Reporter感受态细胞,进行自激活和毒性验证。结果显示p BT-P0重组载体在细菌双杂交系统中无自激活作用及毒性作用,表明本试验构建的p BT-P0可应用于该系统筛选与之互作的寄主蛋白。

P_0蛋白与周围神经相关疾病的关系及其毒理学意义

P0蛋白是周围神经系统髓鞘上的一种主要结构蛋白,对维持髓鞘结构的稳定性发挥了极其重要的作用。近年来,很多研究表明P0的结构、分布和功能等都已经超出了人们最初的认识,本文就P0蛋白的结构、分布和功能等方面的基本特点及其在神经毒理学研究中的进展做一个简单的概述。