微小扇头蜱P0基因的克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

为探究微小扇头蜱P0基因序列特征,预测P0蛋白的理化性质和二、三级结构,筛选出P0蛋白的B、T优势抗原表位,本研究克隆了微小扇头蜱P0基因,运用Clustal X软件分析P0基因序列特征,用在线软件EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL预测P0蛋白的理化性质和二、三级结构,用在线软件ABCpred Prediction、Scratch、IEDB和NetCTL筛选P0蛋白的B、T优势抗原表位。试验结果显示:微小扇头蜱P0基因全长957 bp,碱基A含量为24.0%,T含量为20.3%,G含量为27.5%,C含量为28.2%,A+T含量为44.3%,G+C含量为55.7%,共编码318个氨基酸;P0蛋白分子量为34 ku,理论等电点(pI)为5.86,平均亲水系数为-0.153,不稳定指数为38.15;P0蛋白的二级结构含163个α螺旋(占比51.25%),130个无规卷曲(占比40.88%),25个延伸链(占比7.86%),其中以α螺旋为主要结构;P0蛋白的三级结构以α螺旋的含量最高,该蛋白的全局模型质量评估(global model quality estimation, GMQE)、定性模型能量分析(qualitative model energy analysis, QMEAN)值分别为0.49和0.52±0.05,无信号肽和跨膜结构域,但存在40个磷酸化位点和1个糖基化位点;P0蛋白有13个B淋巴细胞优势抗原表位和6个T淋巴细胞优势抗原表位。综上所述,微小扇头蜱P0基因序列呈GC偏好,P0蛋白是以α螺旋为主要结构成分的亲水性酸蛋白,具有B、T淋巴细胞优势抗原表位,是今后研制防控微小扇头蜱疫苗的理想靶标。

镰形扇头蜱P0基因的克隆表达及初步鉴定

P0分子是一种核糖体蛋白,具有抗蜱免疫作用。本文采用RACE技术从镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)中获得了P0全长基因。通过对P0全长基因序列进行分析发现,P0全长基因为1 118 bp,具有一个编码319个氨基酸的开放阅读框,没有信号肽序列。推测P0的蛋白大小约为35 ku。P0与其他蜱种具有很高的同源性,与微小扇头蜱(Rhipicephalus microplus)和长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)的P0基因同源性分别为94%和87%。编码区克隆到表达载体p GEX-4T-1中,转化表达宿主菌BL21,可表达出分子量约为60 ku的重组融合蛋白。表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。表达产物经GST树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。抗P0重组蛋白鼠血清可以识别蜱体内的P0蛋白,大小在35 ku。研究结果将为镰形扇头蜱新型防治技术研究提供基础。

OsAAP6基因在不同氮肥条件下的表达分析及其对水稻籽粒营养品质的影响

【目的】调查不同氮肥水平处理对水稻OsAAP6基因表达的影响,并进一步探究OsA4P6基因在不同氮肥条件下对其水稻籽粒中蛋白质(包括谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白)含量和氨基酸含量等营养品质的影响作用,为今后利用OsA4P6基因提高稻米营养品质提供参考。【方法】设置5个氮肥浓度梯度,在水稻OsA4P6遗传材料中分别检测OsA4P6基因的表达水平,并利用近红外谷物分析仪和考马斯亮蓝G-25O法检测分析其成熟种子中蛋白质含量和氨基酸含量等稻米营养品质性状。【结果】随着田间氮肥施加量的增加,OsA4P6基因的表达水平明显提高,并能显著促进水稻籽粒中谷蛋白的积累,进而增加水稻籽粒中总蛋白质的含量;在氮肥浓度较高的条件下基因有助于提高水稻籽粒中总必需氨基酸的含量;随着氮肥施加量的增加,OsA4P6基因能够显著提高水稻籽粒中总氨基酸的含量。【结论】OsA4P6基因随着田间氮肥浓度的增加,其表达水平不断升高,并能促进水稻籽粒中蛋白质含量和氨基酸含量等稻米营养品质的提高,这为今后利用OsA4P6基因提高稻米的营养品质提供了重要参考。

新疆维吾尔族和汉族子宫颈癌中POU5F1和NANOG在mRNA水平的表达及临床意义

目的探讨维吾尔族和汉族子宫颈癌(CC)患者中肿瘤干细胞相关基因POU5F1和NANOG在mRNA水平表达的差异及其与临床病理的关系。方法采用实时荧光定量PCR法(RT-PCR),检测69例子宫颈癌组织和16例子宫颈癌组织及其相应的癌旁新鲜组织标本中POU5F1、NANOG在mRNA水平上的表达情况,了解其在维吾尔族和汉族间的表达差异。根据患者临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移进行分组,比较不同亚组患者中维吾尔族和汉族患者间POU5F1、NANOG表达水平的差异性。结果子宫颈癌组织中POU5F1 mRNA、NANOG mRNA的表达水平均较癌旁组织高(P﹤0.05)。维吾尔族CC患者POU5F1 mRNA、NANOG mRNA表达水平均高于汉族CC患者(P﹤0.05)。临床分期为Ⅱa~Ⅲ期、淋巴结转移阴性时,维吾尔族与汉族CC患者子宫颈癌组织中POU5F1 mRNA表达水平比较,差异有统计学意义(P﹤0.05);临床分期为Ⅱa~Ⅲ期、中-高分化、淋巴结转移阴性时,维吾尔族与汉族CC患者子宫颈癌组织中NANOG mRNA表达水平比较,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论 CC中肿瘤干细胞相关基因POU5F1 mRNA和NANOG mRNA的表达在维吾尔族和汉族人群中存在差异性,而此种差异性在Ⅱa~Ⅲ期、中高分化、淋巴结转移阴性的CC中表现更加明显。

贵州辣椒叶脉黄化病毒分离物检测及其P0、CP、MP基因进化分析

为明确辣椒叶脉黄化病毒(Pepper vein yellows virus,PeVYV)在贵州辣椒上的发生分布及其分子变异情况。用RT-PCR法对采自贵州省25个采样地点的548份辣椒疑似病毒病样品进行检测。结果表明:129份为阳性样品,检出率为23.54%。将获得的14个不同采样点PeVYV分离物和已报道的中国和其他国家PeVYV分离物进行序列比对,P0基因核苷酸同源性为90.9%~100.0%,氨基酸相似性为97.7%~100.0%;CP基因核苷酸同源性为93.7%~100.0%,氨基酸相似性为97.9%~100.0%;MP基因核苷酸同源性为94.7%~100.0%,氨基酸相似性均为100.0%。在系统进化树中,有13个采样点PeVYV分离物P0基因聚在一起,与中国分离物(KP326573)的亲缘关系较近,而遵义播州PeVYV分离物与澳大利亚分离物的亲缘关系较近。贵州所有PeVYV分离物CP基因与中国、澳大利亚、美国和西班牙分离物聚为一支,但不同采样点的PeVYV分离物又聚为两个不同的分支。而不同采样点MP基因全部聚在一起,且与其他地区PeVYV分离物的差异不明显。研究结果表明贵州辣椒上不同地区PeVYV分离物具有一定的分子差异,存在遗传分化现象。

甘蔗黄叶病毒P0蛋白基因细菌双杂交诱饵载体的构建和自激活鉴定

由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank No.HQ342888),设计P0蛋白基因的一对特异性引物P0-Bait F/P0-Bait R。以实验室保存的重组质粒p MD18T-P0为DNA模板,PCR扩增P0蛋白基因。然后将P0蛋白基因和细菌双杂交诱饵质粒p BT分别进行双酶切后,连接构建重组诱饵质粒p BT-P0。经PCR扩增、双酶切鉴定和序列分析,表明获得了细菌双杂交重组诱饵载体p BT-P0,且编码框正确。将重组载体p BT-P0转化细菌双杂交系统Bacterio Match RⅡScreening Reporter感受态细胞,进行自激活和毒性验证。结果显示p BT-P0重组载体在细菌双杂交系统中无自激活作用及毒性作用,表明本试验构建的p BT-P0可应用于该系统筛选与之互作的寄主蛋白。

POLK基因遗传变异与小细胞肺癌患者铂类药物化疗后的生存相关

目的探讨参与跨损伤DNA合成的POLK基因的遗传变异与小细胞肺癌(SCLC)患者铂类药物化疗疗效及预后的关系。方法通过Sequenom MassARRAY检测1 030例接受铂类药物化疗的SCLC患者POLK基因的5个标签单核苷酸多态(htSNP)的基因型,比较不同基因型与化疗疗效及预后的关系。基因型与化疗疗效之间的关联分析采用非条件Logistic回归模型,基因型与远期生存之间的关联分析采用Cox比例风险回归模型。结果1 030例SCLC患者中接受顺铂+依托泊苷(EP方案)化疗558例,接受卡铂+依托泊苷(CE方案)化疗472例,其中化疗有效788例,无效242例,有效率为76.5%。中位随访22.0个月,全组死亡673例,生存224例,失访133例,中位生存时间为22.5个月。Karnofsky功能状态(KPS)评分≤80分患者的有效率为72.0%,低于KPS评分>80分的患者(80.1%;OR=0.64,P=0.002)。局限期患者的有效率为81.6%,高于广泛期患者(71.0%;OR=1.81,P<0.001)。POLK基因5个htSNP位点遗传变异与SCLC患者化疗近期疗效均无关(均P>0.05)。年龄>56岁(HR=1.25,P=0.005)、广泛期(HR=1.67,P<0.001)、化疗无效(HR=1.72,P<0.001)患者死亡风险增加,KPS评分>80分(HR=0.84,P=0.021)、有放射治疗(HR=0.70,P<0.001)的患者死亡风险降低。POLK基因rs73120833位点与SCLC患者铂类药物化疗后的总生存有关,与携带T等位基因的患者相比,携带C等位基因患者的死亡风险降低(HR=0.87,P=0.021),而rs10077427、rs3756558、rs4549504和rs5744545位点与总生存无关(均P>0.05)。携带rs73120833 TC基因型和CC基因型的患者合并后,与携带TT基因型的患者比较,死亡风险明显降低(HR=0.84,P=0.024)。结论POLK基因rs73120833位点遗传变异与SCLC患者总生存有关,可能是预测SCLC患者含铂类药化疗预后的潜在遗传标志。