3种香型鲜食葡萄细胞色素P450编码基因CYP76F14的克隆与功能分析

从3种不同香型‘奥利文’(玫瑰香型)、‘京秀’(中性香型)和‘金星无核’(草莓香型)葡萄中克隆CYP76F 14基因,分析其在果实发育不同时期的表达模式,并揭示决定其酶活性的关键氨基酸残基。结果表明,‘奥利文’果实中的芳樟醇含量在整个果实发育时期均显著高于‘京秀’和‘金星无核’,且随着葡萄果实的不断发育而持续上升,在转色期达到峰值并持续到成熟期;CYP76F 14的表达水平与芳樟醇含量呈现正相关性,即‘奥利文’果实中的表达水平显著高于‘京秀’和‘金星无核’;玫瑰香型CYP76F14蛋白中含有12个氨基酸突变位点,利用定点突变技术分别获得氨基酸残基定点突变的CYP76F14-SMs,体外酶活测定表明,CYP76F14-E378G和CYP76F14-T380A定点突变蛋白的酶活力显著低于对照蛋白CYP76F14,E378和T380是决定玫瑰香型CYP76F14酶活性的关键氨基酸残基。

细胞色素P450介导的杂草抗药性研究进展

细胞色素P450(cytochrome P450)是一类重要的亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族,属于单加氧酶,广泛分布于生物界中。研究发现P450主要具有“生物合成”和“生物解毒”两大功能,被誉为“万能的生物催化剂”。大多数除草剂在植物体内代谢的初始阶段即涉及植物细胞色素P450的作用。近些年,由P450介导的抗药性杂草呈多发态势,其复杂的抗性谱,给杂草化学防除带来了新的挑战。本文对P450分类命名、P450与除草剂代谢的关系、P450抗性鉴定手段、P450介导抗性杂草发生情况、与除草剂代谢有关的植物细胞色素P450基因克隆等内容进行了综述,旨在为该领域的相关研究提供参考。

细胞色素P450的工具药选择及种属差异的研究进展

药物对代谢酶的影响以及代谢产生的药物相互作用与药物安全性密切相关。细胞色素P450(CYP)是参与内、外源性化合物I相代谢反应的重要超家族酶系。特异性探针、诱导剂、抑制剂以及实验动物模型广泛应用于CYP介导的代谢途径以及药物相互作用研究。已知CYP底物存在明显重叠性,且表达调控机制种属差异显著,故研究中选择适当的实验动物以及特异性的探针、诱导剂和抑制剂,成为影响数据外推的关键问题。本文简要综述了CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP3A4/5的常用体内外探针、诱导剂、抑制剂以及动物种属表达调控的差异。

烟草重要基因篇:8.烟草P450基因

细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenases, CYP450）是一个保守的血红素硫蛋白基因超家族，广泛存在于各种动植物、真菌和细菌中，在信号传递、防御反应以及代谢产物合成等多种代谢途径中起着重要的作用。P450酶系可能是自然界中最具催化作用的生物催化剂，它所催化的反应类型广泛而复杂。根据其功能，大体可以分为两类：一类是参与植物次生物质的代谢，如植物激素、信号分子、萜类、防御物质等；另一类是代谢外源信号分子或环境污染物，如农药、环境毒素、有机染料等[1-3]。

稳定表达细胞色素P4502B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立及鉴定

目的构建稳定表达细胞色素P4502B6(CYP2B6)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法将Flp-In^(TM)CHO细胞分为Flp-In^(TM)CHO组、Flp-In^(TM)CHO空载体组及Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组,通过Lipofectamine2000转染试剂,分别将pcDNA5/FRT空质粒和pcDNA5/FRT-CYP2B6重组质粒转染至Flp-In^(TM)CHO空载体组细胞和Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)及荧光素酶实验检测转染细胞中CYP2B6 mRNA水平、蛋白表达水平及活性,用四氮唑盐(MTS)测定转染CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞对环磷酰胺的毒性敏感性。结果与Flp-In^(TM)CHO组和Flp-In^(TM)CHO空载体组相比,Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中CYP2B6的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)、酶活性显著增加(P<0.001),对环磷酰胺的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建稳定表达CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系,为研究药物代谢和筛选毒性药物提供工具。

消癌平注射液对多西紫杉醇在大鼠体内的药代动力学及体外CYP450酶活性的影响研究

目的探讨消癌平注射液(XAP)对大鼠体内多西紫杉醇(DOC)药代动力学与体外细胞色素P450(CYP450)酶活性的影响。方法对24只SD雄性大鼠实施体内研究,随机分为A组(DOC对照组)、B组(XAP+DOC组)、C组[(咪达唑仑(MDZ)对照组)]、D组(XAP+MDZ组)共4组。借助超高效液相色谱串联质谱法检测给药后5、10、20、30 min和1、2、3、4、6、8、12、24 h大鼠血清中DOC/MDZ浓度,计算药代动力学参数。通过重组CYP450酶3A4(CYP3A4)的体外反应体系展开研究,制备人肝微粒体,以MDZ为底物探究XAP对CYP450酶活性的抑制作用,考察XAP对DOC代谢的影响。结果体内药代动力学结果显示,XAP可使DOC的C max和AUC 0→t分别增加150%(P<0.01)和60%(P<0.05);t 1/2和MRT分别为(4.24±1.78)h、(3.92±1.14)h,较DOC对照组显著延长;XAP可使MDZ的消除延长,半衰期t 1/2延长至(0.962±0.19)h,MRT延长至(1.008±0.13)h,药时曲线下面积(AUC 0→∞)为(1510.078±242.11)ng·h/ml,均显著高于MDZ对照组(P<0.05)。以MDZ为底物进行的体外抑制实验表明,XAP(10~100 mg/ml)和C 21总甾体提取物(10~50μg/ml)能明显抑制人肝微粒体CYP3A4活性。结论XAP与DOC联合使用后,DOC的血药浓度升高,DOC的多个药代动力学参数明显改变,XAP对DOC的消除有抑制效能,同时其作用机制可能与CYP3A4受抑制有关。

CYP450氧化还原酶遗传多态性对CYP酶影响的研究进展

细胞色素P450氧化还原酶(CytochromeP450oxidoreductase,POR)是将电子从NADPH转运至所有肝微粒体的细胞色素P450氧化酶(Cytochrome P450monooxygenases,CYP)中的唯一供体。药物、类固醇激素等物质的代谢和转化需要CYP参与。POR基因具有遗传多态性,遗传变异可以改变CYP活性,引起P450氧化还原酶缺陷(P450 oxidoreductase deficiency,PORD)、临床药物代谢和反应差异。本文将从POR的结构功能、基因突变引起的疾病及其对酶活性影响三个方面进行论述,总结近年来POR遗传多态性对CYP酶影响的最新研究进展。

P4501A、2C和3A在大鼠肾上腺中的诱导表达

近年来与类固醇激素合成有关的４种肾上腺细胞色素Ｐ４５０———Ｐ４５０ｓｃｃ、Ｐ４５０１１β、Ｐ４５０２１和Ｐ４５０１７α得到了广泛而深入的研究。然而，有研究表明，肾上腺中亦存在有其它能代谢外源性化合物的Ｐ４５０〔１〕。我们以往的研究曾表明人胎肾上腺中...

长链非编码RNA LINC00987通过细胞色素P450途径促进AML细胞凋亡的机制研究

目的:探讨长链非编码RNA LINC00987在抗肿瘤药物诱导的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞凋亡中的作用及分子机制。方法:通过RT-qPCR检测AML中的LINC00987表达水平。构建稳定敲减LINC00987基因的Molm13细胞(shLINC00987),通过Annexin V/PI检测LINC00987低表达对阿糖胞苷诱导AML细胞凋亡的影响。对LINC00987共表达基因进行信号通路富集,分析LINC00987的表达对细胞色素家族基因的影响。结果:与健康对照组相比,lncRNA LINC00987在AML细胞系和AML病人标本中均显著降低,而在抗AML治疗后缓解组中高表达;此外,低表达LINC00987与AML患者预后不良有关。抗肿瘤药物阿糖胞苷、阿霉素、三氧化二砷和维奈托克可显著诱导AML细胞系Molm13和MV411的LINC00987表达。下调LINC00987的表达可抑制阿糖胞苷诱导的Molm13细胞凋亡。进一步研究发现,LINC00987共表达基因可富集于细胞色素P450(cytochrome,P450,CYP450)介导的氧化应激通路/网络,且LINC00987的表达与CYP450家族基因CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的表达水平呈正相关。下调LINC00987的表达则可抑制阿糖胞苷诱导的CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的mRNA表达。结论:LINC00987可以作为AML的预后标志物,其可能通过CYP450介导的氧化应激途径促进阿糖胞苷诱导的AML细胞凋亡。

恶臭假单胞菌F1表达P450酶催化柠檬烯生物合成紫苏醇

紫苏醇是一种天然存在的单萜类化合物,在医药、日化、食品等行业具有广阔应用前景,但利用柠檬烯生物合成中的过程中存在选择性不强、底物对宿主菌株有毒性等问题。为此该文选择恶臭假单胞菌F1这种对环境具有高耐受度的菌株,构建在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中皆可扩增并表达目的基因的广宿主载体,过表达选择性羟化酶CymAa、CymAb,异源表达特异性氧化柠檬烯生成紫苏醇的P450酶CYP153A6,并在表达P450酶的基础上对柠檬烯底物添加浓度进行了调整,与大肠杆菌BL21(DE3)一同进行柠檬烯生物合成紫苏醇实验,并使用紫外可见分光光度计和GC-MS分别测量菌株生长状况和紫苏醇产量。最终证明了恶臭假单胞菌F1在柠檬烯浓度为10 mmol/L内的环境中具有高耐受度,且添加1 mmol/L柠檬烯底物发酵48 h后获得最高产量75.6 mg/L,最高转化率达到49.66%,缩小了生物合成紫苏醇的底物添加范围,并获得对柠檬烯具有高耐受度的发酵宿主。

烟粉虱细胞色素P450基因CYP6JM1的克隆及其在噻虫嗪抗性中的作用

烟粉虱Bemisia tabaci是全球性农业害虫之一,目前采用的防治手段多为化学防治。噻虫嗪作为一种新烟碱类杀虫剂,现被广泛应用于田间烟粉虱的防治,但烟粉虱已对其产生了抗性。本文通过RT-qPCR对烟粉虱噻虫嗪抗性与敏感种群的细胞色素P450基因CYP6JM1表达水平进行了比较,结果显示,烟粉虱噻虫嗪抗性种群CYP6JM1基因表达水平明显升高。基因克隆和序列分析表明,CYP6JM1基因具备昆虫P450基因的典型特征。RT-qPCR检测结果表明,该基因在烟粉虱1~2龄时期及腹部高水平表达。RNAi结果表明,降低烟粉虱体内CYP6JM1基因的表达量能够显著提高其对噻虫嗪的敏感性,表明CYP6JM1基因可能与烟粉虱对噻虫嗪的抗性有关。

细胞色素P450基因CYP 4 S47和CYP 332 A29

【目的】揭示美国白蛾Hyphantria cunea细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)基因HcCYP 4 S47和HcCYP 332 A29在响应氯虫苯甲酰胺胁迫中的功能。【方法】采用饲料混药法制成含LC 30浓度(0.06 mg/L)的氯虫苯甲酰胺饲料分别饲喂室内种群、北方种群(辽宁铁岭种群)和南方种群(湖北孝感大悟种群)美国白蛾3龄幼虫,并分别于饲喂处理后6,12,24和48 h时收集存活的幼虫,测定美国白蛾3龄幼虫体内CYP450酶活性;通过RT-qPCR技术检测在0.06 mg/L氯虫苯甲酰胺胁迫下这3个地理种群中HcCYP 4 S47和HcCYP 332 A29的表达量;利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默3个地理种群美国白蛾3龄幼虫HcCYP 4 S47和HcCYP 332 A29,并使用RT-qPCR技术检测注射dsRNA后的靶基因表达量,饲喂含0.06 mg/L氯虫苯甲酰胺饲料,并于饲喂后12,24,36,48,60和72 h统计幼虫存活率。【结果】0.06 mg/L氯虫苯甲酰胺处理后,南方种群和北方种群3龄幼虫在6,12,24和48 h 4个时间点的CYP450酶活性均高于室内种群;24和48 h时北方种群处理组CYP450酶活性最高,而12和24 h时南方种群处理组3龄幼虫中CYP450活性最高。系统发育分析发现,HcCYP4S47和HcCYP332A29分别属于CYP4和CYP3亚家族。HcCYP 4 S47和HcCYP 332 A29在美国白蛾北方种群和南方种群3龄幼虫体内的表达量均显著高于室内种群3龄幼虫中的。0.06 mg/L氯虫苯甲酰胺处理后,室内种群3龄幼虫体内HcCYP 4 S47和HcCYP 332 A29与对照组相比均显著上调表达,其中以处理后12 h时表达量最高;南方种群和北方种群3龄幼虫体内HcCYP 4 S47在处理后6,12和48 h时表达量与对照组相比显著下调,北方种群3龄幼虫体内HcCYP 4 S47在处理后24 h时表达量与对照组相比显著上调,南方种群3龄幼虫体内HcCYP 4 S47在处理后24 h表达量与对照组相比无显著变化。与对照组相比,北方种群3龄幼虫体内HcCYP 332 A29在氯虫苯甲酰胺处理后6和12 h时表达量均显著降低,48 h时表达量显著上调;南方种群3龄幼虫体内HcCYP 332 A29在氯虫苯甲酰胺处理后6 h时表达量显著下调,12和24 h时表达量显著上调。沉默HcCYP 332 A29和HcCYP 4 S47显著增加了美国白蛾3龄幼虫对氯虫苯甲酰胺的敏感性。【结论】HcCYP 332 A29和HcCYP 4 S47在美国白蛾对氯虫苯甲酰胺的胁迫响应中发挥重要作用。

生物样品中5种CYP450酶底物分析方法的建立

目的 采用HPLC法建立生物样品中测定CYP450酶底物的分析方法。方法 通过钙沉淀法制备肝微粒体,采用探针底物与大鼠肝微粒体体外温孵法进行孵育反应,以氢溴酸右美沙芬、奥美拉唑、非那西丁、硝苯地平、甲苯磺丁脲分别作为CYP2D6、CYP2C19、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9的探针药物,并以大鼠肝微粒体为基质,通过系统考察建立了HPLC法测定5种探针药物的方法。结果 该方法专属性好,空白肝微粒体及内标无干扰,右美沙芬线性回归方程为Y=0.001 6X+0.003 7(r=0.994 8),奥美拉唑回归方程为Y=0.005 3 X+0.016 2(r=0.996 3),非那西丁的线性回归方程为Y=0.008 1X+0.019 9(r=0.995 0),硝苯地平的回归方程为Y=0.009 3X+0.011 8(r=0.991 7),甲苯磺丁脲的回归方程为Y=0.008 1X+0.022 0(r=0.995 1)。日内精密度和日间精密度良好,RSD≤8.75%,样本在4、12、24 h稳定性良好,RSD≤14.31%,提取回收率均>71.36%,且RSD≤6.98%,以上结果均符合样本含量测定要求。结论 本论文建立的探针方法可用于体外快速评价药物对CYP450亚型酶活性的影响,为临床药物-药物相互作用研究提供可靠的检测方法。

从易感性到预后:细胞色素P450家族在肝细胞癌中的多面作用

细胞色素P450(CYP450)家族是一类参与外源性和内源性化合物代谢的重要酶。越来越多的证据表明CYP450家族在肝细胞癌(HCC)的发生、发展和预后中发挥着关键作用。CYP450家族基因多态性可影响个体对致癌物的敏感度和代谢能力,与HCC的发生风险密切相关。此外,CYP450家族基因表达失调参与HCC的进展,其作用机制涉及活性氧水平、DNA损伤、细胞增殖、细胞侵袭和细胞凋亡等多个方面。CYP450家族基因表达水平还与HCC患者的预后密切相关,有望成为判断预后的重要指标。总之,深入理解CYP450家族在HCC发生、发展和预后中的作用,对于阐明HCC的分子机制、制订个体化预防和治疗策略具有重要意义。未来研究应进一步探究CYP450家族基因多态性和表达失调的分子机制,建立相应的风险预测和预后评估模型,并重视药物对CYP450家族的调控作用,以期为HCC的防治提供新的策略和靶点。

细胞色素P450-RhFRED人工融合酶的研究进展与应用

来自于红球菌Rhodococcus sp.NCIMB 9784的P450RhF是一个自给自足型的细胞色素P450酶,它的血红素结构域主要负责控制酶的底物特异性,P450还原酶伴侣蛋白RhFRED与细胞色素P450血红素结构域天然融合在一起,电子主要从蛋白分子内转移到P450血红素结构域。依据融合型P450RhF自给自足的特性,有学者利用P450RhF的还原伴侣蛋白RhFRED,与其它P450构建人工融合酶P450-RhFRED,来实现多种细胞色素P450基因的功能表达。基于此建立的P450-Rh-FRED融合文库对未知功能P450的催化功能探索有很大意义,P450-RhFRED融合酶技术也可用于开发已知细胞色素P450酶的工业应用。

基于P450选择性氧化的天然产物化学-酶法合成进展

随着基因挖掘、生物信息学、酶工程等多学科的交叉融合与协同创新,将绿色高效的酶催化反应与现代有机合成方法相结合的化学-酶法合成策略逐渐发展成为合成活性天然产物、药物分子和其他具有重要价值的有机分子的有力工具。其中细胞色素单加氧酶P450能够选择性地实现惰性C—H氧化这一经典的挑战性化学转化,为活性天然产物的高效合成提供了新的思路,成为合成科学领域的研究热点之一。本文以结构类型进行分类,综述了P450选择性氧化在甾体、萜类以及其他类型天然产物化学-酶法合成中的应用进展,并分析了相应的酶催化反应在提高目标产物合成效率方面起到的关键作用。此外,还讨论了该领域目前所面临的挑战,例如主要集中在对酶天然功能的利用,并缺乏对反应位点的准确预测等;同时从酶资源挖掘、酶的改造等多个角度出发展望了未来能够为这些挑战提供解决方案的研究方向和新兴技术,包括高通量筛选技术、AI辅助酶工程等等。

CYP450抑制剂SKF525A对大鼠脏器和血管CYP2J3 mRNA表达和EET含量的影响

目的:观察腹腔注射细胞色素P450(CYP450)抑制剂SKF525A后,大鼠心、肝、肺、肾、胸主动脉组织CYP2J3mRNA表达及11,12-二十碳三烯酸(11,12-EET)含量的变化。方法:将24只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(Sham组)和抑制剂组(SKF组),对照组腹腔注射生理盐水,SKF组腹腔注射SKF525A,分别在注射后15天及30天取材,采用半定量RT-PCR方法检测大鼠心、肝、肺、肾及胸主动脉组织CYP2J3mRNA的表达变化,采用高效液相色谱方法测定上述组织11,12-EET含量变化。结果:与15天Sham组相比,15天SKF组各种组织CYP2J3的mR-NA表达及11,12-EET含量均降低(P<0.05,P<0.01),而30天SKF组与30天Sham组相比,各组织CYP2J3的mRNA表达及11,12-EET含量均有升高(均P<0.05,P<0.01)。结论:CYP450抑制剂SKF525A可有效抑制CYP2J3在各种组织中的mRNA表达及11,12-EET的生成,但这种抑制作用会随着停药时间的延长而逐渐降低或消失。

补肾还精方促进细胞色素P450基因表达改善卵巢早衰的机制研究

目的探讨补肾还精方改善环磷酰胺所致小鼠卵巢早衰的分子机制。方法将60只10周龄的C57/BL6雌性小鼠,随机分成5组,每组12只,分别为空白组、模型组、补肾还精方低剂量组、中剂量组、高剂量组,并利用环磷酰胺腹腔注射造模,并施加不同浓度的补肾还精方灌胃干预。采用H&E染色法观察小鼠卵巢病理形态,并进行各级卵泡计数;qRT-PCR法检测细胞色素P450家族相关蛋白和细胞衰老凋亡蛋白基因mRNA表达水平。结果与模型组比较,通过中药干预后的小鼠卵巢萎缩情况改善,间质疏松,闭锁卵泡数量明显减少(P<0.01);与模型组比较,细胞色素P450家族基因mRNA表达水平显著提高(P<0.05),凋亡相关蛋白mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。结论补肾还精方通过提高细胞色素P450家族基因的表达,抑制衰老凋亡基因的表达,缓解环磷酰胺诱发的卵巢颗粒细胞损伤及闭锁卵泡的产生,实现对卵巢早衰小鼠的治疗作用。

混合探针底物法测定五味子提取物对大鼠细胞色素P450同工酶的作用

本研究考察了五味子水／醇提取物多次给药对大鼠细胞色素P450酶（CYP450）6种亚型的影响。雄性SD大鼠灌胃给予五味子彬醇提取物，连续给药7天，剂量为1．5g／Kg，末次给药后处死大鼠，制备大鼠肝微粒体，将CYP450酶6种亚型特异性探针底物非那西丁（CYP1A2）、右美沙芬（CYP2D2）、双氯酚酸钠（CYP2C6）、美芬妥英（CYP2C11）、氯唑沙宗（CYP2E1）、