越鞠丸干预CUMS小鼠对抑郁样行为、功能性消化不良及PACAP/PAC1-R表达的影响

目的探讨越鞠丸对抑郁共病功能性消化不良小鼠抑郁样行为和胃肠功能的影响。方法将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、越鞠丸低剂量组、越鞠丸高剂量组和阳性药组,采用慢性不可预知温和应激(CUMS)构建共病模型,通过行为学检测、尼氏染色评估小鼠抑郁样行为和神经元损伤;胃肠组织病理、胃排空率、小肠推进率评估胃肠功能;ELISA法检测PACAP、VIP、IL-6、TNF-α、BDNF表达;Western blot检测PAC1-R、Vipr1、Vipr2蛋白表达。结果模型组小鼠表现出抑郁样行为,海马尼氏体数量减少,胃肠运动减慢,血清炎症因子IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05,P<0.01),PACAP、VIP、BDNF表达降低(P<0.05,P<0.01),海马、胃窦、十二指肠组织PAC1-R、Vipr1、Vipr2表达降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,越鞠丸低、高剂量组可改善除Vipr1、Vipr2之外的其他上述指标(P<0.05,P<0.01)。结论越鞠丸可通过PACAP/PAC1-R降低炎症因子,升高BDNF水平,改善CUMS小鼠抑郁样行为和功能性消化不良。

启动子荧光素酶报告系统检测低浓度过氧化氢激活神经肽PACAP特异受体PAC1-R启动子的作用

垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)特异受体PAC1-R(PACAP receptor 1)是神经系统疾病药物开发的重要靶点。为了研究其表达的生物学机制,本研究克隆了PAC1-R基因转录起始位点上游从-2 500到+26的2 526 bp启动子片段,构建PAC1-R启动子驱动的荧光素酶基因报告载体p GL3-PAC1-Rp,并确证PAC1-R启动子荧光素酶报告系统在小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中工作正常。运用此PAC1-R启动子荧光素酶报告系统,首次发现低浓度过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)有效激活PAC1-R启动子,此作用可被转录因子特化蛋白1(specificity protein 1,SP1)抑制剂光神霉素A(mithramycin A)所抑制,提示SP1参与介导H_2O_2对PAC1-R启动子的激活作用。生物信息学分析显示,PAC1-R启动子含有多个SP1结合位点。PAC1-R启动子的荧光素酶报告系统的构建为深入探索PAC1-R高表达的作用与机制奠定了基础,低浓度H_2O_2对PAC1-R启动子激活作用的发现有助于深入诠释低浓度活性氧的生理学作用。

一种高通量筛选PAC_1受体激动剂的细胞模型的建立

目的建立垂体腺苷酸环化酶激活肽Ⅰ型受体(pituitaryadenylatecyclaseactivatingpeptideⅠreceptor,PAC1-R)激动剂的高通量筛选模型,筛选PAC1-R受体的激动剂,开发用于治疗神经系统疾病和能量代谢疾病的药物。方法将人的PAC1-RcDNA克隆到哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1构成质粒hPAC1R/pCDNA3.1,将这种质粒与报告基因质粒(SRE/3×MRE/CRE/VIP/Luci)共转染到CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定细胞株,利用PAC1-R内源激动剂PACAP-27探索和优化了筛选条件。结果建立了稳定表达hPAC1-R的筛选细胞株和可靠的筛选方法,Z’因子大于0.7。结论该系统成功适合于PAC1-R激动剂的高通量筛选。