水禽4种常见致病菌多重PCR方法的建立及应用

为建立一种能同时检测大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,试验根据大肠杆菌phoA基因、鸭疫里默氏杆菌ompA基因、多杀性巴氏杆菌kmt 1基因、金黄色葡萄球菌FemB基因的保守区域设计4对特异性引物,通过优化退火温度和引物浓度建立多重PCR方法,检验该方法的特异性、敏感性性、重复性,应用该方法检测145份病死水禽临床样品,并与传统细菌分离鉴定方法进行比较。结果表明:优化后的最佳退火温度为52℃,引物浓度为10μmol/L。建立的多重PCR方法能特异性地扩增出靶基因,沙门氏菌、链球菌、产气荚膜梭菌等临床常见菌均未扩增出条带,对大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌4种细菌的检出下限是0.4 pg/mL,单一PCR扩增ompA、kmt 1、phoA和FemB基因的检出下限分别为4×10^(-3),0.4,4×10^(-3),4×10^(-6)pg/mL。多重PCR方法对临床样品的检测结果与传统细菌分离鉴定方法的符合率均在90%以上。说明试验建立的多重PCR方法具有结果稳定、重复性高的特点,适合水禽病原微生物流行病学调查。

快速PCR方法在食品检验中的应用研究

食品安全关系公众的健康和生命安全,而快速准确的食品检测技术是保障食品安全的重要手段。本文通过阐述快速聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法的基本原理,分析其在食源性致病菌、转基因成分、过敏原和真菌毒素检测方面的具体应用。通过利用快速PCR方法,可使检测时间明显缩短,提高了检测灵敏度和特异性,为食品安全检测的发展提供了强有力的技术支撑。

PCR方法检测2型猪链球菌2种毒力因子

根据 2型猪链球菌毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp与 epf)序列 ,分别设计、合成一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)方法。该方法扩增出 2型菌株的 mrp大小为 885 bp,epf为 62 6bp,而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等 PCR均未扩增出任何条带。用 Xba 和 H ae 分别酶切 PCR扩增产物 ,均获得与预计一致的酶切图谱 ,PCR扩增产物测序结果显示 :其基因序列分别与 Gen Bank上公布的mrp全基因第 5 0 0～ 1 3 1 5位碱基及 epf全基因第 2 441～ 3 0 2 8碱基对一致。PCR检测的敏感度可达 1 0 0个细菌。用建立的 PCR对从病猪体内分离的菌株进行检测 ,检测的 1 5株 2型分离株中有 1 3株 mrp与 epf均为阳性 ,为典型的高毒力表现型菌株 (mrp+ epf+ ) ,1株为 mrp+ epf- ,1株为 mrp- epf- 。

PCR方法检测食品中的转基因成分35S和NOS的研究

根据转基因农作物中最常用的花椰菜叶病毒启动子(CaMV35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针(FDCP),分别建立了常规PCR、应用FDCP的新型实时荧光PCR检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法。利用该套方法对冷冻马铃薯条、大豆、冷冻玉米棒、甜椒、番茄等实物样品进行了检测,发现11份样品中有5份检出35S启动子、NOS终止子,6份样品结果为阴性。结果表明我们建立的两种PCR方法均能有效检测出35S和NOS片段,其中常规PCR方法具有灵敏度高、特异性好的特点;应用FDCP的新型实时荧光PCR方法则更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值。

鉴别牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的复合PCR方法及其应用

以牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)特异引物 P1/ P3扩增 BVDV标准毒株及以猪瘟病毒 (HCV)特异引物 P2 / P3扩增HCV阳性病料 ,分别扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的特异片段 ;以 P1、P2、P3扩增 BVDV和 HCV人工混合感染样品 ,扩增出大小为 32 6 bp和 2 5 2 bp的 2条片段 ,建立了特异的一步检测 BVDV和 HCV的复合 PCR方法。以建立的复合 PCR方法检测 BVDV分离株 ,都扩增出 1条 32 6 bp的特异片段 ;从吉林等地送检的病料和猪瘟兔化弱毒疫苗中扩增出一2 5 2 bp的特异片段 ,从长岭地区的疑似猪瘟病猪的血清病料中 ,同时扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的核酸片段 ,表明长岭某猪场流行的“猪瘟”为 BVDV和 HCV混合感染。本研究为进行 HCV和 BVDV的鉴别诊断与流行病学调查提供了有效的方法。

多重PCR方法检测食品中转基因成分

根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 3 5S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列 ,设计合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针 (FDCP) ,分别建立了多重PCR、应用FDCP的实时荧光PCR同时检测转基因成分 3 5S启动子和NOS终止子的方法 .并利用该套方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测 ,发现 1 3份样品中有 6份检出3 5S启动子、NOS终止子 ,其余 7份样品的检测结果为阴性 .表明作者建立的多重PCR方法能有效检测出 3 5S和NOS成分 ,其中多重PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点 ,多重荧光PCR法则更为简便、快速。

犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用

根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。

建立增菌PCR方法对痰涂片阴性肺结核的早期诊断

目的 建立增菌PCR方法 ,以达到对涂片阴性痰标本中结核菌早期检定和确认活菌的目的。方法 采用 7H12半流休培养和PCR扩增相结合的增菌PCR方法 ,对 4 6份初治肺结核患者痰标本进行检测 ,并对杂交结果进行凝胶呈像灰度分析。结果 应用增菌PCR检测涂片阴性痰标本 ,其中 86 .2 %的标本在增菌 7d内得到阳性结果 ,于 4周时得到最大阳性率 ,较培养法的阳性检出时间明显缩短 (P <0 .0 1) ,较普通标本PCR阳性率明显提高 (P <0 .0 5 ) ;有 6 3.0 %的标本增菌 7d时的杂交结果凝胶灰度值与 0d时相比 >1;并有 6 2 .1%的增菌PCR 7d内得到阳性的标本得到同一样本7H12半流培养阳性结果的支持和活菌判定。结论 增菌PCR不是单纯的PCR ,增菌 7d后PCR阳性率明显增加 ,且有杂交结果凝胶灰度比值的增加和随后的培养结果对其进行支持和活菌判断 ,有助于临床诊断的确切性。

PCR方法快速检测炭疽芽孢杆菌

目的 :快速检测炭疽芽孢杆菌。方法 :质粒提取及PCR扩增。结果 :用两对引物扩增 ,阳性样本可分别扩出两条 877bp和 10 89bp左右的条带 ,阴性样本未扩增出。结论 :所采用的方法可快速检测出环境中的炭疽芽孢杆菌 ,并可对其致病性进行评价。

检测猪圆环病毒DNA的竞争定量PCR方法的建立及初步应用

建立了定量检测猪圆环病毒DNA的竞争PCR方法.应用PCR扩增PCV-2 ORF2上490 bp片段P3P4,克隆到pMD 18-T载体获得目标模板.构建含692 bp的c-P3P4 DNA片段的竞争模板,其携带与目标DNA和靶DNA相同的引物结合区.以定量的竞争模板同一系列稀释的竞争模板进行竞争PCR扩增,以产物的荧光强度(IOD)绘制标准曲线,结果当反应体系中起始模板的量为1.0×107 cop/μL,循环次数小于或等于30时,原始模板数以指数增长.由此确定目标模板和竞争模板的最适工作浓度并用该方法检测感染细胞内的PCV-2基因组的拷贝数和临床样品中的PCV-2 DNA含量,结果发现临床样品中的PCV-2 DNA含量达到一定程度(肺中1.0145×108 copies/mL,血中0.8×107 copies/mL,淋巴中9.698×108 copies/mL),猪表现临床症状,而病毒在感染细胞内的复制在80 h基因的拷贝数达到最高,这为今后的研究奠定了基础.

牛病毒性腹泻病毒链特异性SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及应用

为了对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制过程中正、负链RNA进行定量检测,通过生物学软件DNAStar和Primer express 3.0设计BVDV正、负链RNA特异性反转录引物并在其5′端添加非病毒核苷酸标签序列以区分BVDV正、负链RNA。同时设计荧光定量PCR引物与非病毒核苷酸标签序列组成引物对,建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR(ssRT-qPCR)方法,对其敏感性、重复性、特异性进行评估并利用所建立BVDV ssRT-qPCR对不同接毒剂量下BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA进行定量检测。结果表明,以构建的pMD18T-BV+和pMD18T-BV-质粒为标准品建立的BVDV正链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(+)RT-qPCR]和负链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(-)RT-qPCR]在10 2~10 7拷贝范围内具有良好的线性关系,线性相关系数分别为0.998 1和0.995 3;敏感性试验结果显示,ssRT-qPCR敏感性较好,ss(+)RT-qPCR最低检测下限为10拷贝,ss(-)RT-qPCR最低检测下限为100拷贝。重复性试验结果显示,所建立的ssRT-qPCR批内和批间的变异系数为均小于1%,方法重复性良好。特异性试验显示,所建立的ssRT-qPCR方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等不存在交叉反应,特异性较好。利用建立的ssRT-qPCR对不同感染剂量下细胞内BVDV正、负链RNA进行定量分析,结果显示以10、0.1 MOI剂量接种BVDV于MDBK细胞后,BVDV正、负链RNA变化呈现先升后降再逐渐上升的趋势。以1 MOI剂量感染MDBK细胞,BVDV正、负链RNA的动态变化趋势略有差异,整体呈上升趋势。10、1 MOI接毒剂量接种细胞后,BVDV正、负链RNA在感染后36 h基本维持稳定水平,以0.1 MOI接种细胞后BVDV正、负链RNA在感染后24 h即达到稳定水平。BVDV链特异性检测进一步验证了所建立方法的适用性。该研究建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR方法并利用该方法对BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA的动态变化过程进行描述,为研究宿主蛋白抗病毒机制、BVDV基因组RNA复制及调控机制等研究提供了研究手段。

用一种新型的PCR方法快速制备人TNF-α缺失突变体

人肿瘤坏死因子 α(hTNF α)的 2个Loop区 2 9～ 36、141～ 146是受体的主要结合部位 .应用一种新型的PCR方法 ,快速制备了这 2个Loop区的缺失突变体 ,并对其活性进行了研究 .结果表明 :这种新型的PCR方法在制备缺失突变体中具有快速、简便、经济等优点 ,值得推广 ;缺失蛋白对L92 9细胞的毒性作用明显降低 ,表明这 2个区域为hTNF

运用PCR方法鉴别四种犬科动物的研究

建立了狐狸、貉子、水貂和家犬四种犬科动物的PCR鉴别方法。分别用狐狸、貉子、水貂和家犬的特异性引物对,以提取的狐狸、貉子、水貂、家犬的总DNA为模板进行PCR扩增,分别获得701、840、382、473bp的DNA片段,通过限制性内切酶,验证了该PCR扩增的特异性。结果表明,该方法可以有效鉴别出狐狸、貉子、水貂和家犬四种犬科动物。

利用半定量PCR方法分析中国地方猪种内源病毒序列拷贝数的多态性

研究采用PCR方法检测了我国地方猪种内源病毒的拷贝数 ,希望能够找到拷贝数低或无内源病毒的个体或品种 ,培育一个适用于异种器官移植的品种或品系。共检测了 1 1个品种、2 60个个体 ,贵州猪、五指山猪、巴马猪的内源病毒拷贝数相对较低 ,分别为 34 61± 1 9 0 9、2 9 1 9± 1 3 47和 2 7 1 1± 1 4 46 ,膜蛋白A拷贝数分别为 9 33±6 40、1 0 0 4± 6 51和 1 0 56± 5 39,膜蛋白B拷贝数分别为 2 2 1 7± 9 2 0、2 1 0 0± 1 2 53和 2 1 86± 7 2 0。其他如二花脸猪、梅山猪、沂蒙黑猪、蓝塘猪等基因拷贝数相对较高 ;近交有造成内源病毒基因的拷贝数下降的倾向 ;另外民猪和香猪中分别有一头个体含有内源病毒 2个拷贝、膜蛋白A两个拷贝、膜蛋白B一个拷贝。中国地方猪种中内源病毒的拷贝数间差异较大 ,如进行大规模检测 。

应用PCR方法检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性

通过保守的寡核苷酸引物B1/B3扩增出油菜菌核病菌MBCHR和MBCS菌株的部分β-微管蛋白基因,结果发现编码的198位氨基酸由Glu(GAG)突变为Ala(GCG),表现高水平抗药性。根据MBCHR菌株的突变设计2个快速检测方法:第一种方法是根据MBCHR菌株197和198位密码子(GACGAG→GACGCG)形成ThaI酶切位点(3’CGCG 5’),将B1/B3的扩增产物874bp片段酶切成193bp和681bp片段,而MBCS菌株的PCR产物不被酶切;第二种方法用198位突变密码子作为3’末端碱基设计2个等位基因特异性寡核苷酸引物(ASO)用于“nested”PCR或直接从基因组DNA扩增。通过PCR扩增和ThaI酶切能直接检测油菜菌核病菌的MBCHR和MBCS菌株,所得结果与传统菌落直径法相吻合。

金黄色葡萄球菌致病因子检测的PCR方法

介绍了金黄色葡萄球菌致病因子检测的聚合酶链式反应 (PCR)方法 ,已取得的成果和存在的问题 ,这些方法也同样适用于其它致病菌的检测。

应用PCR方法检测鸡传染性贫血病毒

根据鸡传染性贫血病毒(CIAV)基因组序列,设计一对引物扩增基因组上nt358-nt1042之间684 bp DNA片段。在CIAV感染MDCC-MSB1细胞系中提取核酸为模板可扩增出相应DNA片段,且以感染细胞核酸为模板反应敏感性可达1 fg,而以其他病原核酸为模板扩增结果均为阴性。应用该PCR方法对实验感染鸡肝脏、脾脏、胸腺、肾脏、法氏囊、骨髓、白细胞、泄殖腔棉拭子等不同样品进行检测,均可扩增出相应DNA片段。证明我们建立的PCR方法敏感性特异性强,可用于临床感染不同组织CIAV的检测。

鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性扩增,其标准曲线方程为:y=-3.480x+37.955,扩增相关系数为0.999;敏感性强,最低检测限为10拷贝·μL^(-1);特异性好,仅对DEV强毒株和弱毒活疫苗株检测到阳性扩增信号,对鸭源其他传染病病原(番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%～1.14%和0.69%～2.40%.对临床送检疑似DEV感染的14份样品进行检测,并与常规PCR方法、病毒分离鉴定进行比较,阳性率分别为85.71%(12/14)、71.43%(10/14)和57.14%(8/14);且与常规PCR方法、病毒分离鉴定的阳性符合率均为100%.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,可用于开发DEV快速诊断试剂盒,用于开展DEV流行病学调查.