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PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检测方法的建立与应用
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作者 王勤 欧云文 +3 位作者 汪洋 潘琴 刘俐君 何博 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第4期60-66,共7页
为了建立一种快速鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪圆环病毒4型(PCV-4)的方法,试验设计合成PCV-2、PCV-3、PCV-4特异性鉴别检测引物,经一步法三重RT-PCR反应条件的优化,建立了PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检... 为了建立一种快速鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪圆环病毒4型(PCV-4)的方法,试验设计合成PCV-2、PCV-3、PCV-4特异性鉴别检测引物,经一步法三重RT-PCR反应条件的优化,建立了PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检测方法。该方法对PCV-2、PCV-3、PCV-4、PCV-2/PCV-3/PCV-4可分别扩增出216、415、678 bp、216 bp/415 bp/678 bp的特异性条带,检测PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV均为阴性,对PCV-2、PCV-3、PCV-4的最低检测量分别为1.0×102、1.0×10^(3)、1.0×10^(3)拷贝/μL,与PCV-2、PCV-3、PCV-4单项PCR方法的符合率均为100%,应用该方法检测85份临床病料样品,PCV-2、PCV-3、PCV-4阳性感染率分别为21.17%、14.12%、4.71%。说明建立的PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、准确性和临床适用性,为PCV-2、PCV-3、PCV-4的临床鉴别诊断提供一种简便、快速的分子生物学检测技术。 展开更多
关键词 pcv-2 pcv-3 pcv-4 三重PCR 鉴别检测
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PCV-2和PCV-3 Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和鉴定
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作者 董宇璠 金宏凯 +4 位作者 孙莉 费东亮 马跃宇 马鸣潇 李明 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第6期55-59,共5页
为了实现猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,本试验利用刚性连接肽连接PCV-2和PCV-3 Cap基因,构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV-2-3-Cap,双酶切验证正确后,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,... 为了实现猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,本试验利用刚性连接肽连接PCV-2和PCV-3 Cap基因,构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV-2-3-Cap,双酶切验证正确后,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆粒。将重组杆粒转染SF9细胞(昆虫卵巢细胞),盲传3代,获得重组病毒。将重组病毒接种SF9细胞96 h后,通过细胞免疫荧光检测、Western blot和电镜观察对其进行验证,并利用噬斑法检测其效价。结果显示:成功构建重组质粒pFastBac-PCV-2-3-Cap,获得了重组杆粒rAcBacmid-PCV-2-3-Cap,并制备出重组杆状病毒rvAc-PCV-2-3-Cap。重组病毒感染SF9细胞后,目的蛋白成功表达,并可以形成病毒样颗粒,病毒效价为3.41×10^(6) PFU/mL。本试验成功在昆虫细胞-杆状病毒系统中共表达了PCV-2-3-Cap,为防治PCV-2和PCV-3混合感染的二联疫苗研究提供了数据支持。 展开更多
关键词 pcv-2 pcv-3 重组质粒 杆状病毒 真核表达
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PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株全基因组克隆与序列分析
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作者 曾智勇 张爱琼 +5 位作者 梁海英 何小莉 咸文 陈娟 吴好叶 黄二素 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第12期60-63,66,共5页
为了获得猪圆环病毒3型(PCV-3)全基因组克隆及序列,试验采用PCR技术,应用PCV-3全基因组特异性引物,对PCV-3阳性的腹泻仔猪肠内容物进行了PCV-3基因组的扩增和克隆测序,并运用DNAStar、MEGA5等软件对该PCV-3基因组序列进行了比对分析。... 为了获得猪圆环病毒3型(PCV-3)全基因组克隆及序列,试验采用PCR技术,应用PCV-3全基因组特异性引物,对PCV-3阳性的腹泻仔猪肠内容物进行了PCV-3基因组的扩增和克隆测序,并运用DNAStar、MEGA5等软件对该PCV-3基因组序列进行了比对分析。结果表明:扩增克隆得到1株PCV-3分离株,命名为PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株,全基因组大小为2 000 bp,其ORF2大小为645 bp,且存在多处碱基突变。与国外PCV-3毒株相比,全基因组核苷酸序列相似性为98. 7%~99. 0%;与国内毒株相比,全基因组核苷酸序列相似性为97. 3%~99. 7%;与PCV-2毒株相比,全基因组核苷酸序列相似性仅为47. 3%~48. 3%,差异性较大。基于PCV-3基因组核苷酸序列的遗传进化分析结果表明,PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株与国内PCV-3 Chongqing-147/2016株(KY075990)、Jiangxi-62/2016 (KY075989)株、Jiangxi-3/2016 (MF589106)株,与国外US/SD/2016(KX966193)株处于同一独立的进化分支,亲缘关系较近;与其他国内外PCV-3毒株则处于不同的进化分支,亲缘关系较远。根据PCV-3 Cap蛋白第24位和第27位氨基酸序列特征可知,PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株属于PCV-3c基因型。说明贵州省猪群中存在PCV-3,且分离得到的PCV-3/CN/Guizhou/ASXX/2017321株属于PCV-3c基因型。 展开更多
关键词 pcv-3 基因组克隆 序列分析 CAP蛋白 PCR技术
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母猪免疫PCV-2疫苗对仔猪感染PCV-3的影响 被引量:1
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作者 张黎 郑龙龙 +3 位作者 吕晓玲 白瑞 霍乃蕊 郑明学 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1109-1114,共6页
为了解猪圆环病毒3型病毒(porcine circovirus 3 virus, PCV-3)ORF2基因的分子生物学信息,探寻防控PCV-3损害仔猪的可行方案。本研究通过对山西省某未免疫过PCV-2商品疫苗的规模化母猪场的妊娠母猪在产前45 d持续6批次免疫PCV-2疫苗,以... 为了解猪圆环病毒3型病毒(porcine circovirus 3 virus, PCV-3)ORF2基因的分子生物学信息,探寻防控PCV-3损害仔猪的可行方案。本研究通过对山西省某未免疫过PCV-2商品疫苗的规模化母猪场的妊娠母猪在产前45 d持续6批次免疫PCV-2疫苗,以所生仔猪生产成绩和PCV-3 ORF2基因阳性检出率为指标,评价母猪免疫PCV-2疫苗对仔猪PCV-3的感染和发病情况的缓解作用。临床数据显示母猪免疫PCV-2疫苗后生产的6批仔猪PCV-3 ORF2基因阳性率由45.0%逐渐降至20.0%,伤亡率由25.5%降至8.0%。试验结果显示,从死亡仔猪淋巴结分离出的6株PCV-3 ORF2基因序列同源性为98.4%~99.2%,均有17个磷酸化位点,预测Cap蛋白氨基酸N端不存在典型的信号肽结构,说明该蛋白位于胞外区的可能性更大,且未预测到跨膜结构存在;PCV-3 ORF2与PCV-2a同源性为32.5%~32.9%,与PCV-2b同源性为30.8%~31.7%,与PCV-2d同源性为32.6%~33.5%,与PCV-4同源性为33.9%~34.3%,说明同源性低,进化不同步。因此,推测母猪通过持续的免疫PCV-2疫苗可解除PCV-2感染造成的机体免疫抑制,增强自身健康情况,降低PCV-3传播给仔猪的风险,用于控制仔猪群PCV-3流行是可行的应急方式。 展开更多
关键词 pcv-2疫苗 pcv-3感染 ORF2基因 CAP蛋白
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猪圆环病毒3型Cap蛋白多肽合成及免疫原性分析 被引量:2
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作者 贺会利 冯世文 +7 位作者 李军 胡帅 禤雄标 谢永平 柳锋 钟舒红 庞彬辉 潘艳 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第23期78-82,87,154,共7页
为了筛选出具有较强免疫原性的猪圆环病毒3型(Porcine circovirus virus type 3,PCV-3)核衣壳(Cap)蛋白多肽,试验应用生物信息学技术,通过Garnier-Robson和Chou-Fasman两种方法分析PCV-3-Cap蛋白的二级结构,Kyte-Doolittle方法分析亲水... 为了筛选出具有较强免疫原性的猪圆环病毒3型(Porcine circovirus virus type 3,PCV-3)核衣壳(Cap)蛋白多肽,试验应用生物信息学技术,通过Garnier-Robson和Chou-Fasman两种方法分析PCV-3-Cap蛋白的二级结构,Kyte-Doolittle方法分析亲水性,Karplus-Schulz方法分析柔性,Emini方法分析表面可能性,Jameson-Wolf方法分析抗原性,经对该蛋白生物学特性进行综合分析设计合成PCV-3-Cap蛋白多肽,与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联后作为抗原免疫小鼠,测定免疫后小鼠抗体效价以及血清中免疫球蛋白IgG、IgA和细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-4(IL-4)的含量。结果表明:PCV-3-Cap蛋白的α-螺旋位于1~29,59~72,77~83,133~142,181~189 aa等区域;β-折叠位于1~15,20~33,37~52,62~111,114~123,131~155,161~167,175~193,203~215 aa等区域;转角位于12~15,32~43,137~144,167~170,174~177 aa等区域;无规则卷曲位于10~12,53~75,113~130,156~159,169~178,202~204 aa等区域;0~46,115~145 aa区域的亲水指数较高;柔性结构主要位于9~21,122~133,152~162 aa等区域;7~30,32~45,54~62,119~148 aa这些区域暴露于蛋白质表面的可能性较大;6~46,121~151 aa区域的抗原指数较高,经综合分析筛选出2段抗原性较好的肽段,分别为30~45 aa(16K)和130~145 aa(17K);2条PCV-3-Cap蛋白多肽均在第4次免疫小鼠后抗体效价达到1∶6 400;四免后小鼠的免疫球蛋白IgG、IgA及细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-4含量与对照组相比均显著提高(P<0.05)。说明筛选出的2个PCV-3-Cap蛋白多肽具有较好的抗原性。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3 CAP蛋白 多肽 抗体 免疫原性
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新发猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达和纯化 被引量:8
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作者 连凯琪 周玲玲 +3 位作者 张明亮 王英杰 张慢 宋玉伟 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第11期120-123,129,共5页
为制备新发猪圆环病毒3型(PCV-3)衣壳蛋白(Cap)的抗原,在大肠杆菌中表达Cap蛋白,并对其进行纯化。通过PCR扩增去除核定位信号区的Cap136—645基因,构建重组表达质粒pET30a(+)-Cap136—645,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,然后通... 为制备新发猪圆环病毒3型(PCV-3)衣壳蛋白(Cap)的抗原,在大肠杆菌中表达Cap蛋白,并对其进行纯化。通过PCR扩增去除核定位信号区的Cap136—645基因,构建重组表达质粒pET30a(+)-Cap136—645,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析进行鉴定,并纯化Cap136—645蛋白。结果表明,成功构建了pET30a(+)-Cap136—645重组表达质粒,且可在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中可大量表达,表达的重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子质量约为27.5 ku,纯化的蛋白质质量浓度高达1.28μg/μL,且条带单一。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3 包涵体 原核表达 蛋白质纯化
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2020年秋冬季四川省内江市无害化处理病死猪5种病毒核酸检测 被引量:5
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作者 雷明霞 徐凯 +3 位作者 彭娟 李梅 蒋凛 余姣 《中国动物检疫》 CAS 2021年第6期26-30,39,共6页
为了解2020年秋冬季内江市病死猪中猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)5种病毒感染情况,在14个病死畜禽无害化处理收集点,采集108份病料样品,采用荧光PC... 为了解2020年秋冬季内江市病死猪中猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)5种病毒感染情况,在14个病死畜禽无害化处理收集点,采集108份病料样品,采用荧光PCR/RT-PCR方法进行5种病毒核酸检测。结果显示:PCV-2、PRRSV、PCV-3、CSFV的核酸检出率分别为44.4%、33.3%、12.9%、7.4%,未检出PRV核酸;双重感染检出率为18.5%,以“PCV-2+PRRSV”“PCV-2+PCV-3”为主,多重感染检出率为1.9%。结果表明,内江市病死猪群中PRRSV、PCV-2感染较为严重,PCV-3零星分布,且呈现一定的混合感染状态,而CSFV和PRV感染得到有效控制。结果提示,内江市应重点加强PRRSV、PCV-2、PCV-3感染的监测与控制。 展开更多
关键词 核酸检测 病死猪 荧光PCR/RT-PCR 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 猪圆环病毒3
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猪圆环病毒3型Rep蛋白的表达与多克隆抗体制备 被引量:4
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作者 连凯琪 周玲玲 +4 位作者 张明亮 张杰 王英杰 宋玉伟 王双山 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期2107-2111,共5页
为研究猪圆环病毒3型(PCV3)Rep基因在大肠杆菌中表达产物的反应原性和免疫原性,本试验对Rep基因进行原核表达和纯化,鉴定表达产物与PCV3阳性血清的反应性;制备重组Rep蛋白的多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体与重组Rep蛋白的特异... 为研究猪圆环病毒3型(PCV3)Rep基因在大肠杆菌中表达产物的反应原性和免疫原性,本试验对Rep基因进行原核表达和纯化,鉴定表达产物与PCV3阳性血清的反应性;制备重组Rep蛋白的多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体与重组Rep蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,Rep在大肠杆菌中获得大量表达,且主要以包涵体形式存在,重组蛋白相对分子质量约为32000,经纯化后得到单一条带。表达的重组Rep蛋白可以与PCV3阳性血清发生反应。制备的大鼠抗Rep血清与表达的重组Rep蛋白发生特异性反应,且效价大于1∶32000。表明本试验表达的Rep具有良好的免疫原性和反应原性,为PCV3的ELISA诊断试剂盒研制提供依据。 展开更多
关键词 pcv-3 REP蛋白 包涵体 原核表达 蛋白纯化
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