人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和生物学活性研究

解螺旋酶参与几乎体内所有的DNA代谢，具有重要的生理功能。为了从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能，我们以HeLa细胞的cDNA文库为模版，PCR扩增得到PIF1基因5’端含有1～534核苷酸的cDNA序列一PIFAC。在PIF△C的5’端引入六组氨酸标签后插入pET15b表达载体，得到重组质粒pET15-PIF△C。以此重组质粒转化Rosetta TM2（DE3）感受态细胞，使PIFAC蛋白质在大肠杆菌中得到表达。在4℃通过快速液相色谱纯化系统，通过一系列色谱层析柱纯化了PIFAC蛋白质。以纯化的PIFAC蛋白质免疫家兔制备了抗血清，并检测了纯化的PIFAC的生物化学活性。结果显示不含解旋酶模序的人类PIF1蛋白质的N-末端，具有使单链DNA复性的特性。PIF1解螺旋酶具有解开DNA双链和使双链DNA复性这一矛盾的特性，暗示了人类PIF1解螺旋酶可能参与损伤DNA的修复，包括断裂的双链DNA的修复。

PIF效应对于具Holling Ⅲ类功能反应的捕食者-食饵系统的影响

研究了PIF(prey influx)效应对于具HollingⅢ类功能反应的捕食者—食饵系统的影响.主要讨论了PIF效应对于系统平衡点的稳定性及两种群平衡密度的影响.结果表明PIF效应不仅可以增加捕食者种群的平衡密度而且能增加系统的稳定性,这里系统稳定性增加是指系统的正平衡点随着PIF效应的增强由不稳定状态转变为渐进稳定状态;而且PIF效应对食饵种群的平衡密度几乎没有影响.

人PIF1及其截短体重组蛋白的真核表达及其细胞内定位

目的构建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT结构域(PIF1N)截短体真核表达重组质粒,进行真核表达,并确定PIF1、PIF1C、PIF1N在细胞内定位。方法以HeLa cDNA为模板PCR获取PIF1、PIF1C、PIF1N编码区cDNA,将其插入pCMV-Tag 2B质粒中构建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒;通过lipofectamine2000将重组质粒转染人293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达,用免疫荧光法检测其细胞内定位。结果成功构建了PIF1及其截短体真核表达重组体,并在真核细胞内成功表达。确定PIF1定位于核内,PIF1C定位于整个细胞,呈弥散分布,PIF1N主要定位于核内。结论在真核细胞中成功表达了PIF1、PIF1C、PIF1N,且发现PIF1N对PIF1的入核起重要作用,为进一步研究其PIF1及其各结构域奠定了实验基础。

新显色剂PIF的合成及用于钛的光度测定

本文报道了新显色剂——2,3,7—三羟基—9—洋茉莉基—6—荧光酮(简称 PIF)的合成及性质.详细研究了此试剂用于钛的光度测定.试验结果表明:在 pH2.7～4.0的介质中,试剂与钛形成可溶性的二元配合物,其最大吸收波长为550nm,表观摩尔系数为9.84×10~4l·mol^(-1)·cm^(-1).钛浓度在0～6μg/25ml 范围内遵守比耳定律.试剂对钛具有高选择性.可不经分离直接进行含钛试样分析,所拟方法简单、快速.

PIFS多分辨率特性研究

本文在更一般的条件下（二维，不同大小range块）证明了分形图像压缩中PIFS（PartinonedIteratedFunctionSystem）不动点的多分辨率特性，即低分辨率不动点可以通过对高分辨率不动点进行收缩变换得到，高分辨率不动点可以通过对低分辨率不动点进行仿射交换得到，所得结论是Baharav等文中结论的推广．

伪恒定物体(PIF)方法在遥感影像辐射匹配中的应用

伪恒定物体 (PIF)方法基于影像上人造物体像元反射率的统计不变量 ,假定影像间同一人造物体像元的亮度值呈线性函数关系 ,通过数理统计方法 ,校正多时相、多波段影像之间的大气、光照和传感器参数差异 ,达成影像之间的辐射匹配。

不含氨基末端的PIF1解螺旋酶的纯化和初步功能研究

目的从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,纯化只含有解螺旋酶模序,不含N-末端的PIF1蛋白——PIF1△N,并对其生物化学活性进行检测。方法以Hela细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1的540～1 923的cDNA序列,在cDNA的5′端引入六聚组氨酸标签后插入pET20b表达载体,得到重组质粒pET20-PIF1△N。通过共转化此重组质粒和一个编码稀有rRNA的质粒,PIF1△N蛋白在大肠杆菌中得到表达。在4℃通过一系列亲和层析柱,用高效液相纯化系统纯化了PIF1△N蛋白,并检测其生物化学活性。结果从Hela细胞的cDNA文库中克隆了PIF1蛋白的540～1 923的基因片段,使其在大肠杆菌中成功表达。建立了纯化PIF1△N蛋白的亲和层析方法,并检测了其ATP酶活性。结论不含N-末端的PIF1蛋白-PIF1△N,具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性。

雷蒙德氏棉PIF-like转座元件鉴定与特征分析

PIF-like转座元件在植物基因组中含量丰富,是植物DNA转座子的重要组成部分。利用基因组学和生物信息学的研究手段,系统研究了雷蒙德氏棉全基因组水平PIF-like转座元件的数量、染色体分布、结构特征、表达模式及相邻基因的种类和功能等,共鉴定了440条包含转座酶且插入位置明确的PIF-like转座元件。这些元件几乎均匀地分布在13条染色体上,上下游2 kb内共有171个相邻编码蛋白的基因,其中132个基因注释到了GO数据库中,且这些基因的功能分布广泛;部分PIF-like转座元件表达,且具有组织特异性。这些遗传信息为深入研究棉花PIF-like转座元件介导的基因和基因组的进化规律以及棉花基因的功能奠定基础。

人CAP1蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体蛋白的相互作用

目的在细胞水平及体外验证腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1)蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体是否存在相互作用。方法采用激光共聚焦免疫荧光实验,通过细胞内蛋白共定位确定蛋白质间的相互作用关系;GST Pulldown实验在体外验证CAP1与PIF1及其剪接体是否存在直接的相互作用。结果激光共聚焦免疫荧光实验显示,CAP1与PIF1全长蛋白及其剪接体BC018978没有共定位,但与剪接体AF108138C存在共定位。GST Pull-down未检测到CAP1与PIF1全长及其剪接体的相互作用。结论 CAP1与PIF1剪接体蛋白可能存在非直接相互作用。

酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术研究筛选与人类PIF1解螺旋酶相互作用的蛋白。方法 应用酵母双杂交技术，以人PIF1蛋白PINT功能域（1～180氨基酸）和解螺旋酶模序（167～926氨基酸）为诱饵，与HeLa细胞cDNA文库杂交，筛选能与人PIF1蛋白不同功能域相互作用的蛋白。结合生物信息学分析，一对一酵母回复性杂交及β-galactosidase实验等确定阳性克隆。结果 PIF1蛋白PINT功能域杂交共获得17个阳性克隆，生物信息学分析有3个阳性基因，它们分别是CCNDBP1、OTUD5、CAP1。而PIF1蛋白解螺旋酶模序未获得阳性克隆。结论 PIF1蛋白的PINT功能域对调控PIF1的生理功能具有非常重要的作用。

Pif1维持基因组稳定性在肿瘤中发挥的作用

解旋酶是核酸代谢所必需的酶,普遍存在于生物体内。Pif1是5’-3’方向ATP依赖的超家族ⅠB类解旋酶,几乎存在于所有真核生物中。Pif1不同程度地影响端粒、线粒体DNA的复制和冈崎片段的成熟。此外,Pif1可通过破坏稳定的核蛋白复合物来影响这些过程。基于Pif1对维持基因组稳定性的重要性,为肿瘤相关疾病提供新的潜在治疗方向。本文论述了Pif1维持基因组稳定性在肿瘤中所发挥的作用。

嗜热菌ToPif1解旋酶与G四链体的互作活性位点预测及鉴定

利用AlphaFold2人工智能程序在原子水平预测并验证嗜热菌Themus oshimai Pif1(ToPif1)解旋酶参与特殊核酸二级结构G四链体(G4)解旋的关键活性位点。采用变温圆二色光谱测试及解旋实验确定ToPif1解旋酶的嗜热特性;利用AlphaFold2程序预测ToPif1与G4 DNA的互作氨基酸位点,并应用分子生物学工具将预测互作位点分别突变为丙氨酸;通过原核表达系统获得ToPif1的单点突变体蛋白,突变体蛋白经ATP水解实验验证后发现其基本活性不受损;通过荧光各向异性实验和荧光共振能量转移偶联快速停留技术对比ToPif1野生型和突变体对不同构型G4 DNA的结合活性及解旋活性差异,确认影响ToPif1结合和解旋G4的关键氨基酸位点。结果表明:ToPif1解旋酶在高温下仍可保持蛋白构象及解旋活力;预测结果显示ToPif1上存在8个与G4互作的潜在位点,且这些位点的单点突变均不会破坏ToPif1的ATP水解活力;在ToPif1结合G4^(CEB)和G4^(Tel)中发挥关键作用的氨基酸位点是R355,而显著影响ToPif1解旋G4活力的位点是R135和R355。研究结果明确了具有嗜热特性的ToPif1发挥结合、解旋G4 DNA活性的关键氨基酸位点,为理解嗜热菌Pif1解旋酶识别与解旋G4 DNA的机理提供了参考。

人类重组PIF1解螺旋酶C-末端多肽的纯化及其抗体制备

目的:表达纯化人类PIF1解螺旋酶C-末端的338-641氨基酸的多肽PIF338-641,同时用纯化蛋白制备特异抗体。方法:从HeLa细胞的cDNA文库中PCR扩增得到PIF1解螺旋酶C-末端1012-1926的cDNA片段(对应氨基酸338-641),插入N-末端融合有六聚组氨酸的表达载体pET15b产生pET15b-PIF338-641重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,使PIF338-641蛋白在大肠杆菌中表达,用自制的镍亲和柱纯化PIF338-641蛋白,并以纯化蛋白免疫家兔制备抗血清。结果:PIF338-641蛋白在大肠杆菌中成功表达,纯化了PIF338-641蛋白并制备了PIF338-641蛋白抗血清。结论:制备的PIF338-641蛋白抗体能与蛋白发生特异的免疫反应。

景宁木兰PIF转录因子的生物信息学分析及极端遮阴条件下的表达模式

【目的】群落所造成的遮阴是导致景宁木兰Magnolia sinostellata濒危的重要因素之一。PIF家族转录因子在光信号传导和植物生长发育中起到重要作用。对PIF家族转录因子进行系统分析和研究,为探究其在景宁木兰光信号转导机制中的作用奠定基础。【方法】从景宁木兰转录组数据中鉴定获得PIF家族转录因子并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对其在极端遮阴条件下的表达模式进行分析。【结果】从景宁木兰转录组中共筛选出9个MsPIFs转录因子基因,其编码的蛋白质长度为188~735个氨基酸,蛋白质大小为20 314.56~78 957.02 Da,理论等电点范围为5.18~8.22。MsPIFs基因编码的蛋白质均为不稳定蛋白质,所有蛋白质均为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示所有蛋白质均定位于细胞核。9个蛋白质均具有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位点。qRT-PCR结果表明:极端遮阴条件下,9个MsPIFs家族基因表达均发生不同程度的变化。其中,MsbHLH23的表达变化较其他基因更为明显,遮阴处理5和10 d时的表达量分别上调为对照的52.77与20.03倍。【结论】景宁木兰PIF转录因子家族均能响应遮阴,为后续对MsPIFs进行生物学功能鉴定奠定了基础。

马铃薯PIF家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析

植物光敏色素作用因子(phytochrome interacting factors,PIFs)属于碱性-螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族,通过将光和温度等外部环境信号与植物体内源信号途径相整合,进而形成复杂的信号转导网络来精密调控植物的生长发育进程。目前,关于马铃薯PIF家族基因的研究较少,鉴定和分析StPIF家族成员有助于进一步提高马铃薯的产量和品质。本研究运用生物信息学方法,以拟南芥PIF家族成员蛋白序列作为源序列,通过在马铃薯基因组数据库中进行BlastP分析鉴定出7个StPIFs家族成员,并对其进行系统进化、染色体分布、复制事件、蛋白理化性质、基因结构、Motif预测、启动子顺式作用元件、基因表达模式以及对高温胁迫的响应分析。结果显示,StPIF家族所有成员均含有Motif 1(bHLH结构域)、Motif 2(APB结构域)基序;在StPIF基因的启动子区域预测到多个参与光响应、激素、干旱、低温、昼夜节律以及防御和应激反应调控元件;基因表达模式和现蕾期高温胁迫响应分析表明,家族成员具有明显的组织表达特异性,基因存在功能分化,且大部分StPIF成员对生物胁迫和高温等非生物胁迫具有明显响应。以上研究结果极大丰富了我们对StPIF家族的认识,为进一步探究StPIF基因在马铃薯生长期应对生物胁迫以及在结薯期应对高温等非生物胁迫中发挥的功能奠定了理论基础。

嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶生物学活性的分子特征分析

已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用,且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性;然而迄今为止,嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道。本文运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶(Defe.Pif1)结合活性与解旋活性的分子特征。通过原核表达纯化系统,本研究获得纯度95%以上、无标签的Defe.Pif1蛋白。利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性,揭示出Defe.Pif1优先结合ss DNA与G4 DNA,并对含3'-尾链的部分双链底物有较强亲和力,其结合反应底物特异性为:ss DNA>G4 DNA>3'-ss DNA-ds DNA≈Y-structure>Other substrates。通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性,明确其最适解旋温度为50℃,最佳反应溶液为10 mmol/L Na Cl、3mmol/L DTT、3 mmol/L Mg Cl2及1 mmol/L ATP;进一步的解旋动力学特征分析结果显示,Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物,其解旋5'-G4-ds DNA底物时的解旋幅度超过90%,解旋速率也与其解旋5'-ss-ds DNA底物的速率相近,提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式。此外,本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性:与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同,Defe.Pif1解旋12nt-bubble底物的速率与幅度均较高,暗示12nt-bubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物。上述结果证明,Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4 DNA等活性特征;而且作为嗜热细菌的解旋酶,它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性。本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略,为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础。

厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl_2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性。【结果】成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95%的全长AnaPif1蛋白,其大小为55ku,等电点为6.89。AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl(pH7.0)20mmol/L、NaCl 20mmol/L、MgCl_22mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸(ATP/GTP/CTP/UTP)作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物(双链DNA、G4-DNA),且对底物选择无明显偏好性。【结论】获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征。

遥感影像相对辐射校正的PIF方法

多时相遥感影像间的相对辐射归一化是进行遥感动态监测的前提。伪不变特征(pseudo-invariant feature,PIF)相对辐射校正法的校正效果在很大程度上取决于PIF点的选取。普通人工选点方法具有主观性强、选点数量及质量有限等缺陷。为解决上述问题,首先对2期TM影像进行精确几何纠正与配准;然后利用波段比值运算与PIF质量控制相结合的方法逐步细化PIF,以提高PIF的选取质量,降低其选取的主观性,并利用与对应样本点各波段的相关系数评价所选点的质量;最后利用所选取的合格PIF点,通过最小二乘回归分析获取增益与偏移量,并对2个时相的TM影像进行相对辐射校正。对校正前、后典型地物波谱曲线、均方根误差、归一化植被指数(normaliged difference vegetation index,NDVI)统计量等进行分析的结果表明,校正效果比较理想。

用PIF编写DOS软件的安装程序

给出了PIF文件部分内容的存放方式,使用了Windows XP操作系统的部分环境变量,给出了利用快捷方式文件和环境变量编写DOS软件安装程序的原理和方法,对相关问题进行了讨论。

热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌（Thermodesulfovibrio yellowstonii H.）Pif1解旋酶（TyPif1）,研究TyPif1解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将Typif1解旋酶编码区和SUMO促溶标签编码区融合连入pET15b获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1,将该重组载体导入大肠杆菌BL21（DE3）菌株诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化获得融合蛋白,SUMO蛋白酶切除标签,再经Ni-NTA柱去除标签蛋白及SUMO蛋白酶,经Heparin柱进一步纯化最终获得TyPif1全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱（CD）和荧光共振能量转移（FRET）分析TyPif1解旋酶的DNA结合活性、解旋活性以及二级结构的热稳定性。【结果】获得了纯度大于95%的TyPif1蛋白,1L培养基可以获得约10mg纯度大于95%的蛋白;TyPif1解旋酶结合单链DNA和G4DNA的活性明显高于双链DNA;TyPif1具有较高的解旋G4DNA的活性,在25~60℃下其二级结构相对稳定,且解旋速率随温度升高而增大,25~50℃TyPif1的解旋速率由0.09s-1增大到0.23s-1。【结论】表达纯化了热脱硫弧菌TyPif1解旋酶,其不仅具有良好的热稳定性,同时具有特异的结合和解旋G4DNA的能力。