麝香保心丸调节PINK1/Parkin信号通路对糖尿病视网膜病变大鼠的影响

[目的]探讨麝香保心丸(SBP)对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠线粒体自噬及PTEN诱导激酶蛋白1(PINK1)/细胞质E3-泛素连接酶(Parkin)信号通路的影响。[方法]建立DR大鼠模型,将大鼠随机分为正常组(Control组)、模型组(DR组)、麝香保心丸低剂量组(SBP-L组)、麝香保心丸高剂量组(SBP-H组)、麝香保心丸高剂量+雷帕霉素组(SBP-H+RAP组)。检测各组大鼠空腹血糖(FPG)及总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠DR情况;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组大鼠血管内皮生长因子(VEGF)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)水平;透射电镜观察各组大鼠细胞线粒体形态;免疫组化检测线粒体自噬相关蛋白选择性自噬接头蛋白sequestosome-1(SQSTM1/P62)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)的表达;蛋白免疫印迹法检测各组大鼠PINK1、Parkin蛋白表达。[结果]与Control组比较,DR组视网膜结构破坏严重,细胞排列紊乱,水肿明显,细胞间隙变宽,线粒体损伤、肿胀明显,形态异常,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著升高,SQSTM1/P62表达水平显著降低(P<0.05);与DR组比较,SBP-L组、SBP-H组视网膜细胞结构改善,细胞排列逐渐整齐,细胞水肿减轻,细胞、线粒体形态均趋于正常,线粒体肿胀减轻,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著降低,SQSTM1/P62表达水平显著升高(P<0.05);与SBP-H组相比,SBP-H+RAP组视网膜细胞结构破坏加重,细胞排列紊乱,水肿明显,线粒体肿胀加重,形态异常,FPG、TC、TG、LDL-C、VEGF、HMGB1、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达水平显著升高,SQSTM1/P62表达水平显著降低(P<0.05)。[结论]麝香保心丸通过抑制PINK1/Parkin信号通路抑制DR大鼠线粒体自噬。

基于线粒体自噬PINK1/Parkin信号通路的枳实、麸炒枳实和烫枳实对功能性消化不良大鼠治疗作用比较

目的基于线粒体自噬PINK1/Parkin信号通路对比枳实、麸炒枳实和烫枳实对功能性消化不良(FD)大鼠的治疗作用。方法将36只大鼠随机分为正常组、模型组、多潘立酮组、枳实组、麸炒枳实组、烫枳实组。除正常组外其他各组采用碘乙酰胺灌胃结合夹尾刺激法制作FD大鼠模型。造模结束后各给药组给予相应药液灌胃,模型组和正常组给予等体积生理盐水灌胃,持续14 d。造模和给药时,记录大鼠饮食量、饮水量和体质量。给药结束后,测定大鼠小肠推进率,苏木-伊红(HE)染色观察胃组织损伤情况,Western blot检测自噬相关蛋白PINK1、Parkin、Beclin-1、p62的表达。结果与模型组比较,各给药组小肠推进率提高。在造模期间,与正常组比较,各组大鼠的体质量增长减慢,平均日饮食量降低,模型组大鼠平均日饮水量降低。在给药期间,与模型组比较,多潘立酮组、麸炒枳实组和烫枳实组平均日饮食量增加;与模型组比较,麸炒枳实组PINK1、Parkin蛋白表达增加,烫枳实组p62蛋白表达提高、Beclin-1蛋白表达降低,枳实组Beclin-1蛋白表达降低。结论枳实、麸炒枳实和烫枳实治疗FD的作用机制可能与抑制PINK1/Parkin信号通路激活有关,麸炒枳实对FD大鼠的治疗效果优于枳实和烫枳实。

苍术素调节PINK1/Parkin信号通路对膝骨关节炎大鼠线粒体自噬的影响

目的:探讨苍术素对膝骨关节炎(KOA)大鼠线粒体自噬的影响以及PINK1/Parkin信号通路在此过程中的作用。方法:采用关节腔内注射碘乙酸钠法构建KOA模型。将SD大鼠按随机数表法分为对照组、模型组、(低、高)剂量苍术素组(KOA模型建模成功后腹腔分别注射3mg/kg、6mg/kg苍术素)和高剂量苍术素+自噬抑制剂(3-MA)组(KOA模型建模成功后腹腔注射6mg/kg苍术素+15mg/kg 3-MA),每组16只。ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、软骨寡聚基质蛋白(COMP)水平;番红O-固绿染色检测大鼠膝关节软骨组织病理学改变,并进行Mankin’s评分;TUNEL染色检测大鼠膝关节软骨细胞凋亡率;DHE荧光探针检测大鼠膝关节软骨组织中ROS水平;免疫组化检测大鼠膝关节软骨组织中cleaved Caspase-3、LC3阳性表达;Western Blot检测大鼠膝关节软骨组织中自噬以及PINK1/Parkin通路相关蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平、膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3和LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平均升高(P<0.05),且存在明显的膝关节软骨病理损伤;与模型组比较,(低、高)剂量苍术素组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平以及膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3阳性细胞比例降低(P<0.05),而LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平进一步升高(P<0.05),且膝关节软骨病理损伤有所减轻;与高剂量苍术素组比较,高剂量苍术素+3-MA组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平以及膝关节软骨组织中Mankin’s评分、细胞凋亡率、ROS水平、cleaved Caspase-3阳性细胞比例升高(P<0.05),而LC3阳性细胞比例以及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平降低(P<0.05),且膝关节软骨病理损伤加重。结论:苍术素可能通过激活PINK1/Parkin信号通路增强KOA大鼠膝关节软骨线粒体自噬,并减少软骨细胞凋亡,从而改善膝关节软骨退变。

葫芦巴碱通过Pink1/Parkin信号通路介导线粒体自噬对OGD/R诱导的神经元凋亡的影响

目的:探究葫芦巴碱通过PTEN诱导性激酶蛋白1(Pink1)/E3泛素连接酶(Parkin)信号通路介导线粒体自噬对氧-糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经元凋亡的影响。方法:原代培养大鼠海马神经元,经下调Pink1或葫芦巴碱预处理后通过OGD/R诱导神经元损伤,实验分组包括对照组、OGD/R组、葫芦巴碱组、pLKO空载体组(转染pLKO空载体)、pLKO-Pink1组(转染连接Pink1 shRNA干扰质粒的pLKO载体)、葫芦巴碱+pLKO-Pink1组。Annexin V-FITC/PI双染法测定神经元凋亡率;JC-1法测定线粒体膜电位(MMP);Calcein-AM法测定线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放程度;透射电镜观察自噬小体数量;Western Blot检测线粒体自噬相关蛋白(微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Pink1、Parkin)表达。结果:与对照组相比,OGD/R组神经元凋亡率、MPTP开放程度增加,MMP下降,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达增加(P<0.05);与OGD/R组相比,葫芦巴碱组神经元凋亡率、MPTP开放程度减少,MMP升高,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达增加(P<0.05),pLKO-Pink1组与葫芦巴碱组趋势相反;与葫芦巴碱组相比,葫芦巴碱+pLKO-Pink1组神经元凋亡率、MPTP开放程度增加,MMP下降,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达减少(P<0.05)。结论:葫芦巴碱可抑制OGD/R诱导的神经元凋亡,可能通过激活Pink1/Parkin信号通路上调线粒体自噬而实现。

葛根素调节PINK1/parkin信号通路对横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤的影响

目的 探讨葛根素是否可通过调节PTEN诱导激酶1/帕金森病相关基因(PINK1/parkin)信号通路影响横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠线粒体自噬。方法 将60只SPF级成年雄性SD大鼠分为正常组(等量生理盐水)、模型组(50%甘油10 mL/kg)、葛根素低剂量组(葛根素50 mg/kg)、葛根素中剂量组(葛根素100 mg/kg)、葛根素高剂量组(葛根素200 mg/kg)、3-MA组(腹腔注射3-MA 15 mg/kg),每组10只。3-MA组灌胃葛根素200 mg/kg同时腹腔注射15 mg/kg自噬抑制剂3-MA,各给药组连续灌胃给药7 d后,除正常组外其余各组大鼠在双侧后肢肌肉一次性注射50%甘油10 mL/kg,建立横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠模型。血清生化分析血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)和肌酐磷酸激酶(CK)水平;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)水平;HE染色法观察大鼠肾组织病理变化;试剂盒法测量大鼠肾脏组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平;透射电子显微镜观察大鼠线粒体和自噬小体变化;免疫荧光法检测肾脏组织LC3和线粒体的共定位信号变化;Western Blot检测大鼠肾组织LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达。结果 与正常组相比,模型组大鼠血清SCr、BUN、CK、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高,肾脏组织可见明显肾小球、肾小管扩张,出现空泡化、间质水肿以及炎性细胞浸润,肾脏组织病理学损伤评分、MDA、ROS水平,LC3标记的自噬小体与COX4标记的线粒体共定位信号以及LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达升高,SOD、GSH水平降低(均P<0.05),并可观察到大鼠肾脏明显的线粒体肿胀,线粒体脊紊乱、断裂或消失,伴有明显的空泡变性,并有少量自噬小体形成;与模型组相比,葛根素低、中、高剂量组血清SCr、BUN、CK、TNF-α、IL-1β、IL-6水平,肾脏组织病理学损伤评分、MDA、ROS水平明显降低,SOD、GSH水平升高,LC3标记的自噬小体与COX4标记的线粒体共定位信号以及LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表达进一步升高(均P<0.05),并且大鼠肾损伤和线粒体损伤明显减轻,自噬小体数量显著增加;与葛根素高剂量组相比,自噬抑制剂3-MA明显增加横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠炎症反应和氧化应激反应,加重大鼠肾损伤和线粒体损伤,减少自噬。结论 葛根素可通过PINK1/Parkin通路增强横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠线粒体自噬,进而减轻大鼠肾损伤。

祛痰活血方调控PINK1/Parkin信号通路诱导NASH大鼠肝细胞自噬的实验研究

目的:探讨祛痰活血方通过调控PINK1/Parkin信号通路诱导肝细胞自噬改善非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝损伤的作用机制。方法:雄性SD大鼠30只,随机分为对照组、模型组和祛痰活血方低、中、高剂量组,每组6只。对照组大鼠给予普通饲料,其余各组大鼠予高脂饮食,造模8周。祛痰活血方低、中、高剂量组大鼠连续给药4周后,处死各组大鼠,称量并记录大鼠体质量及肝质量,测定肝功能及血脂水平,观察各组大鼠肝组织病理变化和肝内脂质沉积情况,透射电镜下记录各组大鼠肝组织脂滴和自噬小体数量,检测各组大鼠肝组织自噬蛋白PINK1、Parkin、SQSTM1表达以及PINK1/Parkin信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠体重增加,行动迟缓;祛痰活血方治疗后大鼠一般情况好转,体重、肝重减轻。模型组大鼠肝功能指标和血脂水平高于对照组,祛痰活血方治疗后大鼠ALT、AST、TG、TC下降。透射电镜观察,对照组和模型组大鼠肝组织均未见明显自噬体,模型组大鼠肝组织可见大量脂滴,祛痰活血方治疗后大鼠肝组织自噬小体数量增加、脂滴数量减少且体积变小。免疫组织化学法检测,对照组大鼠肝组织SQSTM1无阳性表达,PINK1、Parkin阳性表达较低;与对照组相比,模型组大鼠肝组织PINK1、Parkin无阳性表达,SQSTM1表达较高;与模型组相比,祛痰活血方治疗后,大鼠肝组织PINK1、Parkin阳性表达增加,SQSTM1表达降低。蛋白免疫印迹分析,模型组大鼠肝组织自噬蛋白PINK1、Parkin、SQSTM1表达减低,祛痰活血方治疗后大鼠肝组织PINK1、Parkin、SQSTM1表达增加。结论:祛痰活血方可能通过调控PINK1/Parkin信号通路诱导肝细胞自噬,减轻肝细胞炎症及肝组织脂质沉积,从而发挥治疗NASH的作用。

基于PINK1/Parkin信号通路探讨丹黄散在糖尿病小鼠溃疡创面愈合中的作用

目的:基于同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)/帕金森蛋白(Parkin)信号通路探讨丹黄散在糖尿病小鼠溃疡创面愈合中的作用。方法:选取18只SPF级雄性db/db小鼠,随机分为模型组、生长因子组、丹黄散组,每组6只,另选取6只SPF级雄性db/m小鼠作为空白组,各组小鼠均构建糖尿病溃疡模型。空白组与模型组小鼠以0.9%氯化钠溶液清创并用无菌纱布覆盖创面,生长因子组与丹黄散组小鼠在其基础上分别外敷表皮生长因子凝胶和丹黄散。观察比较各组小鼠溃疡创面愈合情况及PINK1/Parkin信号通路关键蛋白表达水平。结果:模型组第7、14、21天的创面愈合率明显低于丹黄散组、生长因子组(均P<0.05);HE染色和电镜观察创面组织,相较于模型组,生长因子组、丹黄散组创面肉芽组织病理改变明显减轻,大量成纤维细胞增生,致密分布,出现少量新生毛细血管,PINK1、Pakin和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平均明显增加(均P<0.05)。结论:丹黄散可促进糖尿病小鼠溃疡创面愈合,可能通过调节PINK1/Pakrin信号通路进而调控线粒体自噬,保护线粒体功能,促进血管新生和肉芽组织生长,加快创面愈合。

活血荣络方对脑缺血再灌注损伤大鼠PINK1/Parkin信号通路的影响

目的观察活血荣络方对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠PINK1/Parkin信号通路的影响,从线粒体自噬角度探讨其干预CIRI的作用机制。方法40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、活血荣络方(HXRLF)组和自噬激活剂(RAP)组,采用线栓法建立CIRI大鼠模型。HXRLF组于造模前36 h开始灌胃活血通络方药液11.7 g/kg,每24 h灌胃1次,共3次;RAP组于再灌注同时腹腔注射雷帕霉素1.5 mg/kg。再灌注24 h后,对大鼠神经功能进行评分,尼氏染色检测大鼠皮质区完整神经元数目,JC-1荧光探针检测皮质区线粒体膜电位(MMP),透射电镜观察大鼠皮质区超微结构,免疫组化和Western blot检测皮质区p62、LC3B、TOMM20蛋白表达,Western blot和RT-PCR分别检测皮质区PTEN诱导激酶1(PINK1)、帕金蛋白(Parkin)蛋白和mRNA水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分明显升高,神经功能缺损严重;皮质区完整神经元数量明显减少,自噬小体数目增多,MMP降低;皮质区p62、LC3B蛋白表达升高,TOMM20蛋白表达降低,PINK1、Parkin蛋白和mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,HXRLF组和RAP组大鼠神经功能评分明显降低,神经功能缺损改善;皮质区完整神经元数量明显增多,自噬小体数目增多,MMP升高;皮质区p62、TOMM20蛋白表达降低,LC3B蛋白表达升高,PINK1、Parkin蛋白和mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论活血荣络方可能通过激活PINK1/Parkin信号通路上调线粒体自噬,减轻大鼠神经功能损害,从而发挥神经保护作用。

滋肾活血方通过PINK1/Parkin信号通路增加自噬对血管性痴呆大鼠的影响

目的观察滋肾活血方对血管性痴呆(vascular dementia, VD)大鼠海马组织自噬标记蛋白LC3Ⅱ、Beclin1以及自噬调控PINK1/Parkin信号通路的影响。方法改良2-VO法建立VD大鼠模型,采用滋肾活血方进行干预,免疫组化法检测VD大鼠海马组织LC3Ⅱ、Beclin1、PINK1以及Parkin蛋白的表达。结果滋肾活血方能显著提高VD大鼠海马组织自噬标记蛋白LC3Ⅱ、Beclin1以及自噬调控PINK1/Parkin信号分子的表达(P<0.01)。结论滋肾活血方可能通过激活PINK1/Parkin信号通路,促进细胞自噬,保护VD大鼠海马神经元,改善其学习记忆能力。

基于PINK1/Parkin信号通路研究细叶远志皂苷对AD模型小鼠脑组织线粒体自噬的影响

目的:探讨细叶远志皂苷(TEN)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠脑组织线粒体自噬的影响。方法:将50只雄性APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、TEN中剂量+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组[TEN 40 mg/(kg·d)+自噬抑制剂3-MA 30 mg/(kg·d)]和TEN低、中、高剂量组[20、40、80 mg/(kg·d)],每组10只;另将10只同系野生型小鼠作为正常对照组。各给药组小鼠灌胃相应药液,正常对照组和模型组小鼠灌胃0.3%羧甲基纤维素钠溶液,每天给药1次,给药体积为0.01 mL/g,连续给药3个月。末次给药后,检测神经元内微管相关蛋白1轻链3(LC3)的阳性表达水平[以积分光密度(IOD)计],脑组织线粒体中LC3、泛素结合蛋白p62、Cathepsin D、Rab7、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导的假定激酶1(PINK1)、E3泛素连接酶(Parkin)mRNA的表达量和LC3、p62、PINK1、Parkin蛋白的表达量。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠神经元内LC3的IOD值和脑组织线粒体中LC3、p62、PINK1、Parkin mRNA及其蛋白的表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01),Cathepsin D、Rab7 mRNA的表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,TEN低、中、高剂量组小鼠神经元内LC3的IOD值(除TEN低、中剂量组外)和脑组织线粒体中LC3、Cathepsin D、Rab7、PINK1(除TEN低剂量组外)、Parkin(除TEN低剂量组外)mRNA的表达量以及LC3(除TEN中剂量组外)、PINK1(除TEN高剂量组显著降低外)、Parkin(除TEN低剂量组显著降低外)蛋白的表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01),p62 mRNA(除TEN低剂量组外)及其蛋白的表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与TEN中剂量组比较,TEN中剂量+3-MA组小鼠上述指标的变化均被显著抑制(P<0.05或P<0.01)。结论:TEN可通过激活PINK1/Parkin信号通路来诱导AD模型小鼠脑组织线粒体自噬,增强溶酶体功能。

PINK1/parkin信号通路介导的线粒体自噬在心力衰竭中的作用

心力衰竭(heart failure,HF)简称心衰,是心脏功能发生障碍导致心室泵血功能受损引起的循环障碍症候群。心衰是各种心血管病程的终末期阶段,具有发病率高、住院率高和死亡率高的特点[1]。随着人口老龄化加快,各种常见心血管病发病率增高,心衰的患病率也在逐渐上升。目前,我国35岁以上的成年人心衰的患病率为1.3%,较2000年增加了44%[2]。

基于PINK1/Parkin信号通路研究MEHP对小鼠睾丸间质细胞线粒体自噬的影响

目的 探讨邻苯二甲酸单乙基己基酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]对小鼠睾丸间质(TM-3)细胞线粒体自噬的影响。方法 将对数生长期的TM-3细胞分别暴露于自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)(0、0.25、0.5、1.0、1.25、1.5 mmol·L^(-1))24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力,确定后续3-MA干预组染毒剂量;培养TM-3细胞,设置对照组、MEHP低、中、高剂量组(200、400、800μmol·L^(-1))和抑制剂组(MEHP中剂量+3-MA 1.0 mmol·L^(-1))。化学发光法检测细胞腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平;荧光探针JC-1法检测细胞线粒体膜电位(MMP)水平;免疫印迹法(Western blot)检测抗增殖蛋白2(PHB2)、同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)、帕金森蛋白(Parkin)、P-Parkin蛋白表达水平。结果 与对照组相比,3-MA浓度为1.0 mmol·L^(-1)时,细胞存活率为(99.56±2.51)%(P>0.05),确定抑制剂组3-MA干预浓度为1.0 mmol·L^(-1)。与对照组相比,MEHP中剂量组细胞存活率降低,各染毒组TM-3细胞ATP水平均下降(P均<0.05),中、高剂量组TM-3细胞MMP水平、Parkin蛋白表达水平均下降(P均<0.05),各染毒组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白表达均增高(P均<0.05);与低剂量组相比,高剂量组TM-3细胞的ATP水平下降(P<0.05),中、高剂量组TM-3细胞线粒体膜电位水平下降,PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相对表达水平均上升(P均<0.05),Parkin蛋白相对表达水平下降(P均<0.05);与中剂量组相比,抑制剂组细胞存活率降低(P<0.05),高剂量组、抑制剂组细胞ATP水平、线粒体膜电位水平均降低(P均<0.05),高剂量组TM-3细胞中PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白相对表达水平均上升(P均<0.05),Parkin蛋白相对表达水平下降(P<0.05);抑制剂组PHB2、PINK1、P-Parkin蛋白的相对表达水平均低于中剂量组(P均<0.05),Parkin蛋白的表达水平高于中剂量组(P<0.05)。结论 MEHP可通过激活PINK1/Parkin信号通路来诱导TM-3细胞线粒体自噬。

右美托咪啶通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍

目的探究右美托咪啶通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍的分子机制。方法SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、右美托咪啶(40μg/kg)组、自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA,100 mmol/L)组、右美托咪啶+3-MA组,每组8只。旷场和水迷宫实验检测大鼠认知能力;TUNEL染色检测大鼠海马神经元凋亡情况;透射电镜观察大鼠海马神经元自噬情况;Western blot检测各组大鼠脑组织PTEN诱导激酶1(PINK1)/帕金森病蛋白(Parkin)、自噬效应蛋白Beclin 1、微管轻链蛋白3B(LC3Ⅱ/Ⅰ)、线粒体自噬受体p62(p62)蛋白表达。结果右美托咪啶显著改善老年大鼠术后认知功能,抑制神经元凋亡,改善线粒体结构,减少自噬小体数量,升高大鼠脑组织PINK1、Parkin、Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平,降低p62蛋白表达水平。而右美托咪定的上述改善作用均被3-MA减轻或抑制。结论右美托咪啶通过激活PINK1/Parkin信号通路增强线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍。

清肾颗粒对大鼠NRK-52E细胞转分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影响

目的 探讨TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型中miR-23b对PINK1/Parkin通路的靶向调节机制,并阐明清肾颗粒含药血清对NRK-52E细胞转分化的干预机理。方法 采用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱法对清肾颗粒进行全指纹图谱分析。构建TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型,转染siRNA后分为模拟物空载对照组、miR-23b-5p模拟物组、抑制剂空载对照组、miR-23b-5p抑制剂组,观察miR-23b-5p对PINK1表达量的影响。再将NRK-52E细胞分组为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组,Western blot法检测NRK-52E细胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表达,RT-qPCR法检测NRK-52E细胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与PINK1的靶向关系。结果 UPLC指纹图谱法鉴定出清肾颗粒中11个活性成分。miR-23b-5p过表达后,PINK1 mRNA表达量也显著增加(P<0.05);而miR-23b-5p表达沉默后,PINK1 mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-PINK1-WT荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-PINK1-mut荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清干预实验发现,TGF-β1组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显低于正常组,P62和α-SMA表达明显高于正常组(P<0.05)。清肾颗粒组和miR-23b-mimic组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显高于TGF-β1组,P62和α-SMA表达明显低于TGF-β1组(P<0.05)。miR-23b-mimic+清肾颗粒组的表现更优于miR-23b-mimic组(P<0.05)。结论 清肾颗粒能够上调NRK-52E细胞内miR-23b-5p表达,并通过增强PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬活性,抑制NRK-52E细胞转分化进程。

加味桂枝茯苓汤通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬途径减轻PDPN大鼠坐骨神经损伤的作用机制

目的:观察加味桂枝茯苓汤(JGFD)通过PTEN诱导假定激酶1(PINK1)/帕金森病蛋白(Parkin)信号通路调控线粒体自噬途径减轻痛性糖尿病周围神经病变(PDPN)大鼠坐骨神经损伤的作用机制。方法:通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备PDPN模型。成模后随机分为JGFD高、中、低剂量组(JGFD-H、JGFD-M、JGFD-L,39.6、19.8、9.9 g·kg^(-1)·d^(-1))、阳性药组(硫辛酸胶囊,LA,50 mg·kg^(-1)·d^(-1))、模型组(PDPN),并设立空白组(CON)。成模后持续给药干预8周。分别检测干预第0、2、4、8周大鼠体质量和空腹血糖,第0、8周大鼠机械痛阈值和热痛阈值,第8周大鼠运动神经传导速度;苏木素-伊红(HE)染色观察坐骨神经组织形态;透射电镜观察线粒体和自噬小体超微结构;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测坐骨神经组织PINK1、Parkin、p62、酵母Atg6同系物(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测坐骨神经组织PINK1、Parkin、p62、Beclin-1、LC3 mRNA水平。结果:与CON组比较,PDPN组大鼠各时间点体质量显著降低,空腹血糖显著升高,机械痛阈值和热痛阈值显著缩短,运动神经传导速度显著减慢,坐骨神经组织PINK1、Parkin、Beclin-1、LC3蛋白和mRNA表达显著降低、p62蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.01);坐骨神经神经纤维水肿,节段性脱髓鞘;髓鞘板层结构排列松散紊乱,线粒体明显肿胀,电子密度减低,嵴断裂消失,未见典型自噬溶酶体和自噬小体结构。与PDPN组比较,JGFD各剂量组体质量明显升高,空腹血糖明显降低(P<0.05,P<0.01);JGFD各剂量组、LA组机械痛阈值和热痛阈值明显延长,运动神经传导速度明显增快,坐骨神经组织PINK1、Parkin、Beclin-1、LC3蛋白和mRNA表达明显升高、p62蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01);坐骨神经病理损伤均有不同程度改善;髓鞘形态结构较为完整,线粒体外膜完整或者轻微水肿,JGFD-M组、JGFD-H组可见自噬溶酶体结构。与LA组比较,JGFD-H组体质量明显升高,空腹血糖明显降低,运动神经传导速度明显增快,坐骨神经组织PINK1蛋白和PINK1、Parkin、Beclin-1 mRNA表达明显升高,p62 mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:加味桂枝茯苓汤可能通过调控PINK1/Parkin信号通路,激活线粒体自噬,减轻PDPD大鼠坐骨神经损伤。

血管性帕金森综合征患者线粒体自噬信号通路PINK1/Parkin表达及其与神经功能的关系

目的探讨血管性帕金森综合征(VP)患者血清线粒体自噬信号通路PTEN诱导假定激酶1(PINK1)/Parkin相关蛋白的变化,及其对神经功能的作用。方法选取2020年3月—2022年5月河北北方学院附属第一医院VP患者55例(VP组)、健康志愿者55名(正常对照组)。检测所有研究对象PINK1和Parkin蛋白水平。选取30只SD大鼠,分为对照大鼠组(15只)和VP大鼠组(15只)。采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)构建VP大鼠模型,对照大鼠注射等量0.9%NaCl溶液,模型构建成功24 h后采用流式细胞术检测各组大鼠脑组织细胞的存活率、早期凋亡率和晚期凋亡率,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法检测大鼠脑组织自噬基因PINK1、Parkin mRNA和蛋白表达情况,同时检测PINK1/Parkin信号通路相关蛋白磷酸化修饰水平[磷酸化PTEN诱导假定激酶1(p-PINK1)蛋白和磷酸化Parkin(p-Parkin)蛋白]。采用透射电镜原位验证大鼠脑组织超微结构的变化情况,并采用免疫印迹法检测自噬蛋白[自噬相关蛋白(ATG)4、ATG7]和凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)的相对表达量。结果VP组血清PINK1和Parkin水平显著高于正常对照组(P<0.05)。与对照大鼠组比较,VP大鼠组脑组织细胞存活率显著降低(P<0.01),细胞早期凋亡率和晚期凋亡率显著升高(P<0.01);PINK1 mRNA和Parkin mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),PINK1蛋白、Parkin蛋白、p-PINK1蛋白和p-Parkin蛋白相对表达量均显著升高(P<0.01)。透射电镜分析结果显示,VP大鼠组出现明显的细胞自噬和线粒体自噬损伤。与对照大鼠组比较,VP大鼠组脑组织Bcl-2蛋白相对表达量降低(P<0.001),Bax蛋白、ATG4蛋白和ATG7蛋白相对表达量均升高(P<0.01)。结论VP会引起脑组织细胞自噬增加,并加重线粒体自噬损伤,与脑组织PINK1/Parkin信号通路的过度激活有关。

益糖康对db/db小鼠白色脂肪棕色化及PINK1/Parkin通路的影响

目的观察益糖康对db/db小鼠白色脂肪棕色化及脂肪组织PINK1/Parkin通路的影响。方法将30只6周龄db/db小鼠随机分为模型组、益糖康组(30 g/kg)和利拉鲁肽组(200μg/kg),另将10只同周龄C57BL/6小鼠作为正常组,分别予相应药物或生理盐水灌胃5周。给药期间定时检测小鼠体质量及空腹血糖(FBG),对小鼠肝脏、白色及棕色脂肪进行称重,生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量,HE染色观察腹股沟白色脂肪组织(iWAT)形态,免疫组化染色检测iWAT棕色化标志性蛋白解偶联蛋白-1(UCP1)表达,Western blot检测iWAT棕色化相关蛋白UCP1、PR结构域蛋白16(PRDM16)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)及线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、Beclin-1、p62蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠体质量及肝脏、白色脂肪、棕色脂肪质量明显增加(P<0.01),FBG及血清TC、TG、LDL-C含量明显升高(P<0.01),HDL-C含量明显降低(P<0.01);iWAT脂肪细胞出现大空泡、直径明显增大,部分细胞挤压变形,边缘不清晰,iWAT UCP1、PRDM16、PGC-1α、p62蛋白表达降低(P<0.01),PINK1、Parkin、Beclin-1蛋白表达升高(P<0.01)。与模型组比较,益糖康组及利拉鲁肽组小鼠体质量及肝脏、白色脂肪质量明显减少(P<0.01),FBG及血清TC、TG、LDL-C含量明显降低(P<0.05,P<0.01),HDL-C含量明显升高(P<0.01);iWAT脂肪细胞直径减小、数目增多、形态规则,iWAT UCP1、PRDM16、PGC-1α、p62蛋白表达升高(P<0.01),PINK1、Parkin、Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论益糖康能改善db/db小鼠糖脂代谢,促进白色脂肪棕色化,可能通过影响PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬发挥作用。

健肝消脂方调控PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬治疗非酒精性脂肪肝

[目的]探究健肝消脂方(Jian’gan Xiaozhi Decoction,JGXZ)对非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型小鼠的药效作用,并从人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素-蛋白连接酶(Parkin)信号通路介导的线粒体自噬角度探究其作用机制。[方法]60只C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后,随机分为6组,包括正常组(Control),模型组(NAFLD),多烯磷脂酰胆碱胶囊组(polyene phosphatidyl choline,PPC)和JGXZ低、中、高剂量组。除正常组外,另外5组均给予高脂饮食。治疗过程持续8周,每周统计小鼠体质量,8周后采集小鼠血液,分离血清,测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平;小鼠肝脏称重后固定,取同一部位进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)与油红O染色,观察肝组织病理学变化;采用试剂盒检测肝组织中的甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,以评估JGXZ对NAFLD小鼠炎症反应及氧化应激的影响;免疫印迹法检测电压依赖性阴离子通道蛋白1(voltage dependent anion channel 1,VDAC1)、线粒体外膜转位酶20(translocase of outer mitochondrial membrane 20,TOM20)、细胞色素C氧化酶Ⅳ亚型(cytochrome c oxidase subunitⅣ,COXⅣ)、PINK1、Parkin、苄氯素1(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3)以及选择性自噬接头蛋白P62(prostacyclin 62,P62)蛋白表达,以评估JGXZ对NAFLD模型小鼠线粒体自噬的影响。[结果]与模型组比较,JGXZ干预明显提升NAFLD模型小鼠体质量,降低肝指数,缓解NAFLD模型小鼠肝组织病变,降低TC、TG、ALT、AST水平,降低IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA的水平,提高了GSH-Px、SOD活性,下调VDAC1、TOM20、COXⅣ以及P62蛋白表达,上调PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达。[结论]JGXZ可以通过促进PINK1/Parkin信号通路,介导线粒体自噬激活,缓解NAFLD小鼠肝损伤。

左、右归丸干预PINK1/Parkin信号通路调控绝经后骨质疏松症自噬的机制

目的:观察左、右归丸对绝经后骨质疏松症(PMOP)大鼠骨髓组织磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)诱导激酶1(PINK1)/Parkin信号通路介导自噬的影响,以此探索左、右归丸防治PMOP的机制。方法:将100只2月龄未生育雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、左归丸组、右归丸组和补佳乐组,每组20只。除假手术组,其余组均摘除双侧卵巢,连续给药12周后取材,检测骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、血清骨钙素(BGP)含量以及PINK1、Parkin、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达等指标。结果:与假手术组比较,模型组BMD、BV/TV、Tb.Th显著降低(P<0.01),Tb.Sp显著升高(P<0.01),血清BG P含量显著增加(P<0.01),PINK1、Parkin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达均显著上调(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著下调(P<0.01)。与模型组比较,各给药组BMD、BV/TV、Tb.Th显著升高(P<0.05,P<0.01),Tb.Sp显著降低(P<0.05,P<0.01),血清BGP含量显著降低(P<0.01),PINK1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达均显著下调(P<0.01);左归丸组、右归丸组Parkin蛋白表达下调(P<0.01);各给药组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著上调(P<0.01)。结论:左、右归丸提高BMD、降低血清BGP含量,可能与调控PINK1/Parkin信号通路有关,这可能是左、右归丸防治PMOP的机制之一。

温针灸干预慢性疲劳综合征大鼠骨骼肌PINK1/Parkin通路的变化

背景:研究发现慢性疲劳综合征患者线粒体的功能异常,给予辅酶后可改善症状,温针灸是治疗该病的重要方法之一,但其作用机制尚不明确。目的:采用温针灸干预慢性疲劳综合征大鼠骨骼肌PINK1/Parkin通路,明确温针灸对慢性疲劳综合征的治疗机制。方法:将32只雄性SD大鼠适应性喂养3 d后随机分为正常组、模型组、温针灸组和辅酶组,每组各8只,除正常组外,其余各组大鼠以游泳力竭、慢性束缚及禁食多因素方法制备慢性疲劳综合征模型。造模成功后正常组、模型组大鼠采取相同固定及灌胃操作,温针灸组大鼠选用关元、中脘、足三里(双)穴进行治疗,1次/d,进针后将艾柱置于针柄点燃,每次治疗3壮,共15 min;辅酶组按照1 mg/kg进行灌胃,1次/d,共治疗14 d。记录实验期间各组大鼠体质量、力竭游泳时间及治疗期间的食物利用率。治疗结束后,取各组大鼠双侧腓肠肌,苏木精-伊红染色法观察各组大鼠腓肠肌病理形态,透射电镜观察各组大鼠腓肠肌线粒体形态结构及自噬体,免疫组化法检测各组大鼠骨骼肌中微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅱ蛋白表达水平,Western blot法检测各组骨骼肌中PINK1、Parkin、LC3蛋白的表达。结果与结论:①与正常组相比,模型组腓肠肌细胞核固缩、凝聚,数目增多,细胞排列紊乱,腓肠肌纤维排列紧密;温针灸组和辅酶组腓肠肌纤维排列间隙较模型组增加,细胞核减少,细胞排列较模型组整齐。②与正常组比较,模型组骨骼肌线粒体肿胀、融合及空泡化,线粒体膜断裂,基质较多溶解,嵴断裂、消失;存在自噬现象。与模型组比较,温针灸组及辅酶组线粒体数量增多,排列相对整齐,线粒体空泡化及线粒体嵴断裂情况改善,膜结构相对完整;存在自噬现象。③与正常组相比,模型组骨骼肌中PINK1蛋白表达上调(P<0.05)、而Parkin、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达稍有上调(P>0.05);与模型组相比,温针灸组和辅酶组骨骼肌中PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显上调(P<0.05),温针灸组蛋白表达上调更为显著。④结果说明,温针灸可能通过激活PINK1/Parkin通路,上调LC3Ⅱ表达,形成线粒体自噬体,促进降解受损线粒体的相关内容物,改善线粒体质量,从而发挥治疗慢性疲劳综合征的作用。