温针灸干预慢性疲劳综合征大鼠骨骼肌PINK1/Parkin通路的变化

背景:研究发现慢性疲劳综合征患者线粒体的功能异常,给予辅酶后可改善症状,温针灸是治疗该病的重要方法之一,但其作用机制尚不明确。目的:采用温针灸干预慢性疲劳综合征大鼠骨骼肌PINK1/Parkin通路,明确温针灸对慢性疲劳综合征的治疗机制。方法:将32只雄性SD大鼠适应性喂养3 d后随机分为正常组、模型组、温针灸组和辅酶组,每组各8只,除正常组外,其余各组大鼠以游泳力竭、慢性束缚及禁食多因素方法制备慢性疲劳综合征模型。造模成功后正常组、模型组大鼠采取相同固定及灌胃操作,温针灸组大鼠选用关元、中脘、足三里(双)穴进行治疗,1次/d,进针后将艾柱置于针柄点燃,每次治疗3壮,共15 min;辅酶组按照1 mg/kg进行灌胃,1次/d,共治疗14 d。记录实验期间各组大鼠体质量、力竭游泳时间及治疗期间的食物利用率。治疗结束后,取各组大鼠双侧腓肠肌,苏木精-伊红染色法观察各组大鼠腓肠肌病理形态,透射电镜观察各组大鼠腓肠肌线粒体形态结构及自噬体,免疫组化法检测各组大鼠骨骼肌中微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅱ蛋白表达水平,Western blot法检测各组骨骼肌中PINK1、Parkin、LC3蛋白的表达。结果与结论:①与正常组相比,模型组腓肠肌细胞核固缩、凝聚,数目增多,细胞排列紊乱,腓肠肌纤维排列紧密;温针灸组和辅酶组腓肠肌纤维排列间隙较模型组增加,细胞核减少,细胞排列较模型组整齐。②与正常组比较,模型组骨骼肌线粒体肿胀、融合及空泡化,线粒体膜断裂,基质较多溶解,嵴断裂、消失;存在自噬现象。与模型组比较,温针灸组及辅酶组线粒体数量增多,排列相对整齐,线粒体空泡化及线粒体嵴断裂情况改善,膜结构相对完整;存在自噬现象。③与正常组相比,模型组骨骼肌中PINK1蛋白表达上调(P<0.05)、而Parkin、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达稍有上调(P>0.05);与模型组相比,温针灸组和辅酶组骨骼肌中PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显上调(P<0.05),温针灸组蛋白表达上调更为显著。④结果说明,温针灸可能通过激活PINK1/Parkin通路,上调LC3Ⅱ表达,形成线粒体自噬体,促进降解受损线粒体的相关内容物,改善线粒体质量,从而发挥治疗慢性疲劳综合征的作用。

益糖康对db/db小鼠白色脂肪棕色化及PINK1/Parkin通路的影响

目的观察益糖康对db/db小鼠白色脂肪棕色化及脂肪组织PINK1/Parkin通路的影响。方法将30只6周龄db/db小鼠随机分为模型组、益糖康组(30 g/kg)和利拉鲁肽组(200μg/kg),另将10只同周龄C57BL/6小鼠作为正常组,分别予相应药物或生理盐水灌胃5周。给药期间定时检测小鼠体质量及空腹血糖(FBG),对小鼠肝脏、白色及棕色脂肪进行称重,生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量,HE染色观察腹股沟白色脂肪组织(iWAT)形态,免疫组化染色检测iWAT棕色化标志性蛋白解偶联蛋白-1(UCP1)表达,Western blot检测iWAT棕色化相关蛋白UCP1、PR结构域蛋白16(PRDM16)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)及线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、Beclin-1、p62蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠体质量及肝脏、白色脂肪、棕色脂肪质量明显增加(P<0.01),FBG及血清TC、TG、LDL-C含量明显升高(P<0.01),HDL-C含量明显降低(P<0.01);iWAT脂肪细胞出现大空泡、直径明显增大,部分细胞挤压变形,边缘不清晰,iWAT UCP1、PRDM16、PGC-1α、p62蛋白表达降低(P<0.01),PINK1、Parkin、Beclin-1蛋白表达升高(P<0.01)。与模型组比较,益糖康组及利拉鲁肽组小鼠体质量及肝脏、白色脂肪质量明显减少(P<0.01),FBG及血清TC、TG、LDL-C含量明显降低(P<0.05,P<0.01),HDL-C含量明显升高(P<0.01);iWAT脂肪细胞直径减小、数目增多、形态规则,iWAT UCP1、PRDM16、PGC-1α、p62蛋白表达升高(P<0.01),PINK1、Parkin、Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论益糖康能改善db/db小鼠糖脂代谢,促进白色脂肪棕色化,可能通过影响PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬发挥作用。

清肾颗粒对大鼠NRK-52E细胞转分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影响

目的 探讨TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型中miR-23b对PINK1/Parkin通路的靶向调节机制,并阐明清肾颗粒含药血清对NRK-52E细胞转分化的干预机理。方法 采用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱法对清肾颗粒进行全指纹图谱分析。构建TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型,转染siRNA后分为模拟物空载对照组、miR-23b-5p模拟物组、抑制剂空载对照组、miR-23b-5p抑制剂组,观察miR-23b-5p对PINK1表达量的影响。再将NRK-52E细胞分组为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组,Western blot法检测NRK-52E细胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表达,RT-qPCR法检测NRK-52E细胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与PINK1的靶向关系。结果 UPLC指纹图谱法鉴定出清肾颗粒中11个活性成分。miR-23b-5p过表达后,PINK1 mRNA表达量也显著增加(P<0.05);而miR-23b-5p表达沉默后,PINK1 mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-PINK1-WT荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-PINK1-mut荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清干预实验发现,TGF-β1组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显低于正常组,P62和α-SMA表达明显高于正常组(P<0.05)。清肾颗粒组和miR-23b-mimic组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显高于TGF-β1组,P62和α-SMA表达明显低于TGF-β1组(P<0.05)。miR-23b-mimic+清肾颗粒组的表现更优于miR-23b-mimic组(P<0.05)。结论 清肾颗粒能够上调NRK-52E细胞内miR-23b-5p表达,并通过增强PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬活性,抑制NRK-52E细胞转分化进程。

健肝消脂方调控PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬治疗非酒精性脂肪肝

[目的]探究健肝消脂方(Jian’gan Xiaozhi Decoction,JGXZ)对非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型小鼠的药效作用,并从人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素-蛋白连接酶(Parkin)信号通路介导的线粒体自噬角度探究其作用机制。[方法]60只C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后,随机分为6组,包括正常组(Control),模型组(NAFLD),多烯磷脂酰胆碱胶囊组(polyene phosphatidyl choline,PPC)和JGXZ低、中、高剂量组。除正常组外,另外5组均给予高脂饮食。治疗过程持续8周,每周统计小鼠体质量,8周后采集小鼠血液,分离血清,测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平;小鼠肝脏称重后固定,取同一部位进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)与油红O染色,观察肝组织病理学变化;采用试剂盒检测肝组织中的甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,以评估JGXZ对NAFLD小鼠炎症反应及氧化应激的影响;免疫印迹法检测电压依赖性阴离子通道蛋白1(voltage dependent anion channel 1,VDAC1)、线粒体外膜转位酶20(translocase of outer mitochondrial membrane 20,TOM20)、细胞色素C氧化酶Ⅳ亚型(cytochrome c oxidase subunitⅣ,COXⅣ)、PINK1、Parkin、苄氯素1(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3)以及选择性自噬接头蛋白P62(prostacyclin 62,P62)蛋白表达,以评估JGXZ对NAFLD模型小鼠线粒体自噬的影响。[结果]与模型组比较,JGXZ干预明显提升NAFLD模型小鼠体质量,降低肝指数,缓解NAFLD模型小鼠肝组织病变,降低TC、TG、ALT、AST水平,降低IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA的水平,提高了GSH-Px、SOD活性,下调VDAC1、TOM20、COXⅣ以及P62蛋白表达,上调PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达。[结论]JGXZ可以通过促进PINK1/Parkin信号通路,介导线粒体自噬激活,缓解NAFLD小鼠肝损伤。

基于PINK1/Parkin通路研究天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠线粒体自噬的影响

目的观察天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠线粒体自噬的影响,探讨其作用机制。方法将30只自发性高血压大鼠随机分为模型组、西药组和中药组,每组10只,将10只正常血压大鼠(Wistar-Kyoto)作为正常组。中药组予天麻芎苓止眩片1.0 g/kg灌胃,西药组予卡托普利7.6 mg/kg灌胃,正常组和模型组灌胃蒸馏水(10 mL/kg),每日1次,连续6周。给药前及给药各周测量大鼠收缩压,HE染色观察胸主动脉组织病理变化,透射电镜观察线粒体结构及自噬体形成,ELISA检测血清活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量,免疫组化染色、Western blot、RT-qPCR分别检测胸主动脉组织PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、E3泛素连接酶(Parkin)、Beclin1蛋白及mRNA表达。结果与正常组比较,模型组大鼠收缩压显著升高(P<0.05),血清ROS、MDA含量显著升高(P<0.05),CAT、SOD、GSH含量显著降低(P<0.05),胸主动脉平滑肌细胞增生、血管壁增厚,线粒体结构破坏,出现大量自噬泡和自噬体,胸主动脉组织PINK1、Parkin、Beclin1蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,西药组和中药组大鼠收缩压显著降低(P<0.05),血清ROS、MDA含量显著降低(P<0.05),CAT、SOD、GSH含量显著升高(P<0.05),胸主动脉平滑肌细胞增生减少,血管壁增厚不明显,自噬泡和自噬体数目显著减少,胸主动脉组织PINK1、Parkin、Beclin1蛋白和m RNA表达显著降低(P<0.05)。结论天麻芎苓止眩片可能通过调节PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬逆转血管内皮氧化应激损伤,维持血管内皮功能稳态,从而发挥降压作用。

基于PINK1/Parkin通路探讨小续命汤调控急性脑缺血再灌注后线粒体自噬的分子机制及神经细胞凋亡的影响

目的:探讨小续命汤对大鼠急性脑缺血再灌注后线粒体自噬中PINK1/Parkin通路及神经细胞凋亡的影响。方法:将120只大鼠随机分为假手术组、模型组、小续命汤组、小续命汤+线粒体自噬抑制剂组。采用线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型,栓塞1 h后恢复灌注24 h,再灌注24 h后各组均选取20只。各组大鼠均于造模前连续灌胃给药5 d,术后24 h观察各组大鼠神经行为学评分、损伤部位海马区神经元病理变化、脑梗死体积,采用透射电镜观察脑损伤部位线粒体自噬情况,通过Western blotting法检测自噬相关蛋白P62、LC3以及PINK1、Parkin蛋白表达情况。结果:与模型组比较,小续命汤组大鼠海马区神经元及脑组织超微结构病变均明显减轻,Longa评分明显降低(P<0.05),大脑梗死比例明显缩小(P<0.05),P62表达水平明显下调(P<0.05),PINK1蛋白表达水平、Parkin蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高(P<0.05);与小续命汤组比较,小续命汤+线粒体自噬抑制剂组大鼠海马区神经元及脑组织超微结构病变均明显加重,Longa评分明显升高(P<0.05),大脑梗死比例明显增大(P<0.05),P62表达水平明显上调(P<0.05),PINK1蛋白表达水平、Parkin蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显降低(P<0.05)。结论:线粒体自噬可以缓解急性脑缺血再灌注后脑损伤程度,小续命汤可以通过PINK1/Parkin通路适度上调线粒体自噬,及时清除受损线粒体,减少大鼠神经细胞凋亡。

栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠自噬及PINK1/Parkin通路作用研究

目的:观察栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠心肌自噬的影响,并研究PINK1/Parkin通路在其中可能发挥的作用。方法:将60只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、MI/RI模型组、3-MA(3-Methyladenine,3-甲基腺嘌呤)抑制剂组、栝楼薤白半夏汤高剂量组、栝楼薤白半夏汤低剂量组,采用可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min、再灌注2 h复制MI/RI模型,透射电镜下观察心肌组织超微结构,全自动生化仪检测血清中肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量,Western Blot法测定心肌组织自噬相关蛋白Beclin-1、选择性自噬接头蛋白P62、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、PTEN诱导假定激酶1(Pink1)、Parkin蛋白的表达。结果:假手术组大鼠心肌肌丝致密排列,线粒体结构正常;MI/RI模型组大鼠心肌肌丝断裂,心肌线粒体增大变形,自噬体形成;3-MA抑制剂组、栝楼薤白半夏汤高、低剂量组心肌肌丝及线粒体结构基本保持相对完整,自噬体较少。与假手术组比较,MI/RI模型组大鼠血清CK-MB、LDH含量及心肌组织Beclin-1、P62、Pink1、Parkin蛋白表达均显著升高而Mfn2蛋白表达显著降低;与MI/RI模型组比较,3-MA抑制剂组、栝楼薤白半夏汤高、低剂量组大鼠血清CK-MB、LDH含量及心肌Beclin-1、P62、Pink1、Parkin蛋白表达显著下降而Mfn2蛋白表达显著上升。结论:MI/RI可激活Pink1/Parkin线粒体自噬通路,导致过度自噬而加重心肌损伤,栝楼薤白半夏汤可通过抑制Pink1/Parkin通路活化,减轻线粒体自噬而发挥心肌保护作用。

PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬在十溴联苯醚诱导肉鸡肾脏损伤中的作用

[目的]本试验旨在研究十溴联苯醚(BDE-209)暴露对肉鸡肾脏组织损伤的影响,探讨潜在的肾脏毒性作用及相关机制。[方法]选取150只1日龄雄性AA白羽肉鸡,随机分为5组,每组6个重复,每个重复5只,在5组的基础日粮中分别添加0、0.004、0.04、0.4和4.0 g·kg^(-1) BDE-209,试验期42 d。试验结束后测定血清尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)浓度及肾脏氧化应激指标,观察肾脏组织形态结构及线粒体膜电位变化,用免疫荧光、qPCR及Western blot分析自噬相关蛋白p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及PINK1/Parkin mRNA水平及蛋白表达变化。[结果]与对照组相比,不同剂量BDE-209处理导致肾脏损伤,引起肾小球增大,内容物增多,肾小管水肿及胞质疏松,线粒体膜电位下降。当BDE-209剂量高于0.04 g·kg^(-1)时,血清BUN和CRE浓度均显著升高(P<0.05);0.4和4.0 g·kg^(-1) BDE-209组肾脏SOD和GSH-Px活性均显著降低(P<0.05),0.04、0.4和4.0 g·kg^(-1) BDE-209组MDA浓度均显著升高(P<0.05)。免疫荧光、qPCR及Western blot结果均显示:日粮添加BDE-209后p62表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值显著增大(P<0.05),PINK1蛋白表达量也显著上升(P<0.05)。[结论]BDE-209暴露诱导肉鸡肾脏氧化应激,激活PINK1/Parkin通路介导的线粒体损伤,促进自噬蛋白LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ,p62蛋白增加,阻碍自噬体的降解,最终导致肉鸡肾脏组织损伤的发生。

基于PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬探讨泛酸对糖尿病肾病小鼠的影响

目的探讨泛酸是否通过PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬延缓糖尿病肾病(Diabatic kidney disease,DKD)的发展。方法12只雄性糖尿病肾病db/db小鼠适应性喂养2周后,随机分为模型组和泛酸组,各6只;同周龄近交式C57BL/6J小鼠为对照组。泛酸组按照130 mg·kg^(-1)·d^(-1)给予泛酸灌胃,对照组和模型组给予等体积蒸馏水,连续给药8周。实验结束后,采集各组血清、尿液进行生化检测。HE染色和PAS染色观察肾脏病理变化。RT-qPCR和Western-blot分别检测叉头框转录因子O1(FoxO1)、磷酸化叉头框转录因子O1(p-FoxO1)、同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)、帕金蛋白(Parkin)mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组空腹血糖、尿微量白蛋白肌酐比值(ACR)水平显著升高,肾小球扩张,糖原沉积;p-FoxO1蛋白表达水平显著升高,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,泛酸组空腹血糖、尿ACR水平显著降低,肾小球扩张、糖原沉积减轻,p-FoxO1蛋白表达水平显著降低,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。结论泛酸有助于降低DKD db/db小鼠尿ACR水平,改善肾脏病理变化,可能是通过调控PINK1/Parkin通路,激活线粒体保护性自噬,延缓糖尿病肾病进展。

蛇床子素通过PINK1/Parkin通路诱导HeLa细胞自噬

目的探讨蛇床子素促进宫颈癌HeLa细胞发生自噬的潜在作用机制。方法不同浓度蛇床子素(0、10、20、40、80、160、240、320 mg·L^(-1))作用于HeLa细胞,MTT法检测蛇床子素对HeLa细胞增殖的抑制作用;透射电镜观察经蛇床子素干预的HeLa细胞形态;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色检测自噬水平;流式细胞术检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;Western blot分析线粒体相关蛋白MFN1、DPR1表达水平;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化;建立裸鼠宫颈癌体内移植瘤模型探讨蛇床子素对宫颈癌的抑制作用;Western blot检测PINK1、Parkin和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平。结果蛇床子素能明显抑制HeLa细胞增殖;通过透射电镜观察,经蛇床子素干预的HeLa细胞有典型的自噬小体形成;MDC染色荧光强度增强,细胞发生自噬;线粒体融合蛋白MFN1表达下调,分裂蛋白DRP1表达上调;JC-1显示线粒体膜电位下降;流式细胞术检测结果显示细胞内ROS水平升高,且能被自噬抑制剂3-MA逆转;裸鼠瘤质量被蛇床子素明显抑制;Western blot结果显示,线粒体自噬关键因子PINK1、Parkin蛋白表达增加,LC3Ⅱ/Ⅰ的比值也增加。结论蛇床子素能诱导HeLa细胞发生自噬,其机制可能与促进HeLa细胞ROS产生和PINK1/Parkin通路有关。

通心络胶囊对热射病大鼠心肌细胞线粒体自噬及PINK1/Parkin通路的影响

目的:探讨通心络胶囊对热射病大鼠心肌细胞线粒体自噬及PTEN诱导假定激酶1(PINK1)/Parkin通路的影响。方法:制备经典型热射病大鼠模型,随机分为模型组、通心络低剂量组(0.1 g/kg)、通心络中剂量组(0.3 g/kg)、通心络高剂量组(0.9 g/kg),另取正常大鼠作为对照,记为正常组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;苏木精—伊红(HE)染色观察心肌组织病理改变;透射电子显微镜观察心肌细胞线粒体自噬;TUNEL法检测心肌细胞凋亡;Western blotting法检测心肌组织PINK1/Parkin通路蛋白以及微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、Beclin1自噬相关蛋白水平。结果:正常组心肌组织结构、线粒体结构均正常,自噬极少;模型组心肌细胞排列紊乱,形态不规则,线粒体肿胀,结构紊乱,出现自噬;通心络各剂量组心肌细胞排列较为整齐,线粒体形态结构相对完好,自噬现象明显。与正常组比较,模型组心肌细胞凋亡率,血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62、PINK1、Parkin蛋白表达量均显著升高(P<0.05);与模型组比较,通心络各剂量组心肌细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及p62蛋白表达均显著降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、PINK1、Parkin蛋白表达均显著升高(P<0.05)。结论:通心络胶囊可能通过进一步激活PINK1/Parkin通路,加强热射病大鼠心肌细胞线粒体自噬水平,抑制心肌组织炎症反应,对心肌细胞起到保护作用。

饥饿条件下活性氧通过PINK1/Parkin通路调控人牙周膜细胞的线粒体自噬

目的探究人牙周膜细胞(hPDLC)在饥饿条件下活性氧(ROS)与PINK1/Parkin通路介导hPDLC线粒体自噬的具体机制。方法分离培养正常牙周组织的hPDLSC,利用Earle’s平衡盐溶液(EBSS)模拟饥饿环境诱导hPDLC线粒体自噬,利用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)抑制ROS生成以探讨ROS在hPDLC线粒体自噬的作用,利用环孢素A(CsA)抑制PINK1/Parkin通路以研究ROS与PINK1/Parkin通路在饥饿条件下激活hPDLC中的作用。采用流式细胞术及JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,检测线粒体膜电位;采用透射电镜观察线粒体自噬体的生成及线粒体形态变化;采用线粒体红色荧光探针定位线粒体,溶酶体绿色荧光探针定位溶酶体;采用DCFH-DA ROS荧光探针检测ROS生成强度;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中线粒体自噬基因(Tomm20、Timm23)及PINK1/Parkin通路的表达水平,采用蛋白质印迹(Western blot)检测细胞中线粒体自噬蛋白(Tomm20、Timm23)及PINK1/Parkin通路蛋白表达水平。结果EBSS饥饿作用30 min后,诱导激活hPDLC线粒体自噬的作用最强,ROS表达增加,且线粒体自噬相关基因(Tomm20、Timm23)下调(P<0.001),PINK1/Parkin通路表达上调(P<0.001)。NAC抑制ROS的产生后,自噬被抑制,同时Tomm20、Timm23表达上调(P<0.001,P<0.05),PINK1/Parkin通路表达下调(P<0.001,P<0.05)。而当CsA抑制PINK1/Parkin通路表达时(P<0.05,P<0.05),自噬被逆转,同时Tomm20、Timm23表达上调(P<0.001,P<0.01)。结论ROS在饥饿条件下主要通过PINK1/Parkin通路增强hPDLC线粒体自噬。

雄蚕益肾方通过PINK1/Parkin通路介导LOH大鼠睾丸间质细胞线粒体自噬研究

目的:探讨雄蚕益肾方介导PINK1/Parkin通路对迟发性性腺功能减退症(LOH)大鼠睾丸间质细胞(LC)线粒体自噬的影响。方法:20只18月龄雄性SD大鼠随机均分为LOH模型组,雄蚕益肾方低、中、高剂量组,2月龄雄性SD大鼠5只设为正常对照组。雄蚕益肾方低、中、高剂量组分别给予10.4、20.8、41.6 g/kg体重剂量的雄蚕益肾方配方颗粒剂灌胃;正常对照组和LOH模型组给予相同体积的蒸馏水灌胃,均连续28 d。实验结束后电镜观察睾丸组织LC超微结构,Western印迹检测PINK1、Parkin和p62蛋白表达。结果:正常对照组LC线粒体形态基本正常,存在明显自噬现象,LOH模型组线粒体自噬少,雄蚕益肾方低、中、高剂量组线粒体有自噬发生。LOH模型组大鼠睾丸组织PINK1、Parkin蛋白表达均显著低于正常对照组(P<0.05),p62蛋白表达显著高于正常对照组(P<0.05);与LOH模型组比较,雄蚕益肾方干预后大鼠睾丸组织PINK1蛋白(低、中、高剂量组)、Parkin蛋白(中、高剂量组)表达显著升高(P<0.05),p62蛋白(低、中、高剂量组)表达显著降低(P<0.05)。结论:LOH大鼠睾丸组织线粒体自噬水平下降,雄蚕益肾方干预后线粒体自噬水平增加,可能与提高睾丸组织PINK1、Parkin蛋白表达,降低p62蛋白表达,影响LC超微结构等有关。

PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬对大鼠急性心肌梗死细胞的影响研究

目的 探讨大鼠急性心肌梗死发生后3、6 h内通过激动PINK1/Parkin通路对心肌细胞的影响。方法 将36只大鼠随机分为假手术组、模型组、PINK1激动组,每组12只;建模后按第3、6 h分为2个亚组,每组6只。模型组、PINK1激动组采用冠状动脉结扎法制备大鼠心肌梗死模型,动物模型实验结束后,摘取大鼠心脏制成切片,光镜下观察各组急性心肌梗死大鼠组织细胞的病理结构。结果 假手术组大鼠心肌细胞排列整齐,未见明显炎性细胞浸润。模型组大鼠在3、6 h时间点均观察到大量心肌细胞坏死。在3 h时间点PINK1激动组与3 h时间点模型组相比,炎性细胞减少,心肌细胞排列相对整齐,症状有所改善;6 h时间点PINK1激动组与6 h时间点模型组相比无明显差别。3 h时间点的PINK1激动组损伤程度小于同时间点模型组(P<0.05),而6 h时间点的PINK1激动组损伤程度与同时间点模型组比较无显著性差异(P>0.05)结论 大鼠发生急性心肌梗死后3 h内激动PINK1/Parkin通路可减轻大鼠心肌细胞损伤。

黄芩汤对UC模型大鼠PINK1/Parkin通路的作用研究

目的:探究黄芩汤对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠组织中PTEN诱导假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和E3泛素连接酶(E3ubinquitin ligases, Parkin)表达的影响及对PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬水平的作用。方法:采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic, TNBS)复合造模法制备UC大鼠模型,将大鼠按照体质量随机分为正常对照组、模型组、阳性药柳氮磺胺吡啶组(SASP,0.5 g/kg)和黄芩汤(HQT)高、中、低剂量组(20、10、5 g/kg),连续给药7 d,眼眶取血后处死,取结肠组织。HE染色法检测大鼠结肠组织的病变程度,透射电镜观察结肠黏膜组织线粒体形态结构及线粒体自噬现象,Western Blot法检测大鼠结肠中PINK1、Parkin的蛋白表达。结果:造模后模型组大鼠精神倦怠,体质量与进食量明显下降,DAI评分和组织病理评分与正常组相比有显著性差异(P<0.01),电镜观察结果显示线粒体结构被破坏,组织中Parkin蛋白表达量显著降低(P<0.01)。各给药组大鼠给药后DAI评分与组织病理评分较模型组均有不同程度的降低,电镜观察到线粒体自噬现象,组织中PINK1和Parkin的表达量升高,其中,阳性药组与黄芩汤高剂量组最为明显,具有显著性差异(P<0.01)。结论:黄芩汤能够明显改善溃疡性结肠炎大鼠的行为体征与病理评分,其机制可能与促进PINK1与Parkin蛋白的表达,激活线粒体自噬有关。

基于PINK1/Parkin通路探讨灵芝孢子对糖尿病肾病模型大鼠肾脏细胞凋亡的影响

目的基于PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)通路研究灵芝孢子对糖尿病肾病(DN)模型大鼠的肾脏细胞凋亡的影响。方法32只SPF级雄性SD大鼠(180~200 g),随机分成正常对照(NC)组、高脂高糖(HF)组、DN模型(DN)组和灵芝孢子(GLSP)组。除NC组外,其余各组均采用高脂、高糖饲养,同时DN组和GLSP组均联合腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ,50 mg/kg)。GLSP组每日灌胃给予灵芝孢子〔300 mg/(kg•d)〕持续3个月,其余组均灌胃给予等量生理盐水〔10 ml/(kg•d)〕。每周测定各组空腹血糖。12 w后评估肾脏功能,用试剂盒检测尿素氮、血清肌酐、24 h尿蛋白等生化指标。苏木素-伊红(HE)、过碘酸希未反应(PAS)和Masson染色用于检查肾脏病理学。通过TUNEL法观察大鼠肾脏组织凋亡细胞的分布及凋亡率情况。通过免疫组化检测肾脏组织中P62、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。Western印迹检测PINK1/Parkin通路涉及的关键蛋白PINK1、Parkin及微管相关蛋白1轻链(LC)3、P62、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved)-Caspase3、Bax、Bcl-2表达水平。结果与NC组相比,DN组尿中出现大量尿蛋白,血清肌酐及尿素氮水平明显升高(P<0.01),肾小体直径增大、肾小囊腔变小、肾小球内细胞数增多并有糖原累积、肾小球内含有大量的胶原纤维,肾组织中PINK1、Parkin、LC3的蛋白表达显著降低、P62表达显著升高,凋亡相关蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3表达明显升高,Bcl-2/Bax表达明显降低(P<0.01),肾脏凋亡荧光强度明显增加(P<0.01)。与DN组相比,GLSP组肾脏滤过功能明显改善(P<0.01),肾脏病理损伤缓解,肾小球体积有明显减小、肾组织胶原纤维覆盖面积明显降低、糖原明显减少;肾组织中PINK1、Parkin表达明显升高、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显增加,P62表达明显下降,且凋亡相关蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3表达明显下降,Bcl-2/Bax表达明显升高(P<0.01),肾脏凋亡荧光强度明显降低(P<0.01)。结论灵芝孢子可能调控PINK1/Parkin途径,激活肾脏细胞自噬有关,抑制重要的促凋亡蛋白的表达,减轻高糖水平对肾脏的损害,抑制细胞凋亡。

PINK1/parkin通路调控线粒体自噬机制的研究进展

线粒体自噬指细胞通过自噬机制选择性除去损伤或多余的线粒体。真核生物通过线粒体自噬调控线粒体质量,维持供能细胞器的功能。大量研究表明,帕金森病相关基因PINK1和parkin可通过线粒体自噬参与并维持线粒体功能。PINK1与parkin能协同特异性识别损伤的线粒体,PINK1作为线粒体质量调控的探测器被活化,此过程中泛素化酶和去泛素化酶对维持parkin活性及线粒体自噬的效率有重要作用。本文主要总结PINK1/parkin通路在线粒体自噬中的功能与作用。

基于PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬探讨中药丹黄散对糖尿病溃疡的促愈机制

目的:以PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬为靶向,探讨丹黄散对糖尿病溃疡创面的促愈机制。方法:选择雄性无特定病原体(SPF)级db/db小鼠18只,同遗传背景的雄性SPF级db/m小鼠6只,按随机数字表法将18只db/db小鼠分为模型组、生长因子组、丹黄散组,每组6只;6只db/m小鼠作为空白组。使用4%水合氯醛麻醉,用无菌打孔器在小鼠背部建立直径为0.8 cm的皮肤缺损,制备糖尿病溃疡模型。空白组和模型组不予药物干预,对照组和丹黄散组分别给予重组人表皮生长因子凝胶和丹黄散外敷,每天换药1次,连续21 d。于造模后第7天、第14天取创面组织分析。通过苏木精-伊红染色法(HE)、Masson染色观察创面病理情况;透射电镜观察创面组织线粒体及自噬小体情况;Western-Blot检测创面组织LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表达。结果:造模后的第7天、第14天、第21天空白组、生长因子组、丹黄散组创面愈合率均高于模型组(P<0.05);第7天、第14天的小鼠创面组织HE染色、Masson染色后发现,与模型组相比,空白组、生长因子组、丹黄散组的炎症反应较轻,新生血管数量明显增加,创面中细胞排列紧密,创面基质形成丰富胶原纤维,创面表皮组织恢复佳;第7天创面组织透射电镜观察发现,空白组、生长因子组和丹黄散组创面组织中线粒体肿胀情况较模型组轻,可见自噬小体数量高于模型组;Western-Blot检测发现,空白组、生长因子组、丹黄散组小鼠创面组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达均高于模型组(P<0.05)。结论:丹黄散通过上调PINK1/Parkin通路,激活线粒体自噬,保护创面细胞线粒体正常结构和功能,促进血管新生和肉芽组织的生长,有效地促进糖尿病小鼠溃疡创面愈合。

PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬在神经系统损伤中的研究进展

PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)/帕金蛋白(Parkin)通路是线粒体自噬经典的信号转导通路。在神经系统损伤中,PINK1/Parkin信号转导通路受多种蛋白因子及药物的调节,参与疾病损伤中的细胞凋亡和氧化应激,并对损伤后的神经发挥保护作用。本文分别从PINK1、Parkin的结构与组成、PINK1/Parkin信号通路的激活、PINK1/Parkin信号通路与细胞凋亡和神经系统损伤性疾病的关系等方面展开论述,希望为神经系统疾病的基础实验研究及其临床治疗提供新的思路。

川芎嗪通过PINK1/Parkin通路调控自噬对新生大鼠缺氧缺血性脑病的影响

目的研究川芎嗪注射液对缺氧缺血性脑病新生大鼠自噬的影响及其分子机制。方法将7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组(n=8)、模型组(n=12)、川芎嗪组(n=12)。模型组和川芎嗪组行左侧颈总动脉结扎后再缺氧处理,制备新生大鼠缺氧缺血性脑病模型。假手术组只暴露血管不做其他处理。川芎嗪组在缺氧缺血后每日腹腔注射川芎嗪注射液20 mg/kg,假手术组与模型组每日腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。在治疗7 d后取材,采用苏木精-伊红染色及尼氏染色观察脑组织神经元病理变化情况。采用免疫组织化学染色观察各组新生大鼠大脑海马及皮质区域PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)、Parkin表达。采用TUNEL染色检测神经元凋亡情况。通过免疫印迹法检测PINK1、Parkin、自噬特异性基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和泛素结合蛋白(Protein 62,P62)的表达。结果与假手术组相比,模型组新生大鼠神经元数量减少,细胞间隙增大,排列疏松,胞质空泡化,尼氏小体减少;PINK1、Parkin阳性表达增加,神经元凋亡率升高(均P<0.05);PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达增加,P62蛋白表达减少(均P<0.05)。与模型组相比,川芎嗪组新生大鼠神经元数量增多,细胞排列整齐,尼氏小体增加;PINK1、Parkin阳性表达减少,神经元凋亡率降低(均P<0.05);PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达减少,P62蛋白表达增加(均P<0.05)。结论川芎嗪在一定程度上缓解了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤,抑制神经元凋亡,其机制可能与抑制PINK1/Parkin介导的自噬相关。