猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性

为研究猪圆环病毒型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性,通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段,与真核表达载体pCI-neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h,通过RT-PCR可检测到PCV2RepmRNA的转录;用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验,可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中,PCV2Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆,在表达量高的细胞中,细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白,表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P<0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P>0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P<0.01),脂质体方法显著低于对照组(P<0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P>0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。

猪传染性胃肠炎病毒感染PK15细胞抗病毒相关因子转录变化分析

为研究猪传染性胃肠炎病毒感染与固有免疫之间关系,研究构建含有巴马猪IFN-α1,IFN-β和NF-κB启动子的报告基因载体,将转染上述报告基因的PK15细胞接种TGEV和灭活TGEV后发现,与灭活TGEV相比,TGEV能够诱导IFN-α1、IFN-β和NF-κB报告基因低水平表达;其次,利用荧光定量RT-PCR方法检测接种病毒0、2、6和10 h后PK15细胞中IFN-α1、IFN-β、IL6、TNF-α、ISG56和IRF7转录量,结果表明,TGEV对IL6转录没有影响,而诱导IFN-α1、IFN-β、TNF-α、ISG56和IRF7低水平转录,分别为对照组1.49、1.5、2.2、2.5和1.8倍。

黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA在PK15细胞中的分泌表达

通过RT-PCR方法,从黑曲霉总RNA中克隆出β-甘露聚糖酶基因manA的成熟肽编码序列。将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽序列通过重叠延伸PCR方法得到拼接片段,并插入到真核表达载体pcD-NA6.0/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSmanA。重组质粒经过PCR、酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且读码框完全正确。在脂质体介导下将pcDNA-PSmanA转染猪肾(PK15)细胞进行分泌表达,通过RT-PCR方法证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测酶活性得到β-甘露聚糖酶基因酶活性为14.5 IU/mL。

PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库的构建及鉴定

【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库，为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA，先后合成第一链和第二链cDNA，经平末端修饰后，定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头，再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化，与噬菌体载体臂相连，然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装，形成初级cDNAT7噬菌体展示文库，并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定，初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL，扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示，文库的重组率为95．83％，且插入片段主要分布于500-2000bp，其中500～750bp的占21．73％，750～100bp的占21．73％，1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序，发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率，质量良好，符合后续文库筛选的要求，可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。

不同培养基对PK15细胞增殖影响的研究

采用无血清液体培养基、DMEM培养基和MEM培养基进行PK15细胞的培养,观察细胞增殖及传代效果,确定无血清液体培养基的营养功能。结果表明:无血清液体培养基只能维持第一代细胞的生长,不能用于第二代后的培养,效果不如DMEM、MEM培养基,且差异显著。

不同种属H1启动子驱动miR-1在PK15细胞中的表达情况

【目的】筛选出能高效表达外源性成熟miR-1的真核表达载体,为揭示miR-1参与猪肌肉发育及肉质性状形成的分子机制奠定基础。【方法】分别克隆巴马小型猪miR-1前体序列、H1启动子序列及人类H1启动子序列,并构建不同种属H1启动子驱动其表达的真核表达载体,利用脂质体法转染PK15细胞后,采用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测不同种属H1启动子表达载体驱动miR-1表达效率。【结果】经酶切鉴定和测序分析证实,成功构建了3个miR-1过表达载体(pEGFP-miR-1、pEGFP-hH1-miR-1和pEGFP-pH1-miR-1),以其转染PK15细胞24和48 h后,荧光显微镜观察发现绝大部分细胞都发出绿色荧光,且含有H1启动子细胞的荧光强于无H1启动子细胞。转染pEGFP-pH1-miR-1细胞、转染pEGFP-hH1-miR-1细胞、转染pEGFP-miR-1细胞的miR-1相对表达量分别为105.02、99.00和79.65,其miR-1表达水平均极显著高于转染pEGFP-C 1细胞和空白对照组细胞(P<0.01)。【结论】重组质粒pEGFP-miR-1、pEGFP-hH1-miR-1和pEGFP-pH1-miR-1均能在PK15细胞中高效表达miR-1,即猪源与人源的H1启动子均能提高外源性miR-1表达,可用于后续的miR-1功能研究。

NR2F2基因调控猪PK15细胞增殖和凋亡的研究

旨在探究NR2F2基因对猪PK15细胞增殖和凋亡的影响。本研究在猪PK15细胞中过表达NR2F2基因,通过qRT-PCR、Western blot、CCK-8、EdU、流式细胞术、划痕试验等方法检测了过表达NR2F2基因对细胞增殖的影响;采用CO-IP技术验证NR2F2与Smad4蛋白结合能力;用qRT-PCR方法检测了NR2F2基因对Smad 4基因表达以及下游基因Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D 1表达的影响;挽救试验过表达NR2F2基因且干扰Smad 4基因检测下游基因及增殖基因Ki67、PCNA的表达。结果发现,过表达NR2F2基因极显著上调了Ki 67基因的表达(P<0.01),显著上调了PCNA的表达(P<0.05),促进了细胞周期的进程,抑制了细胞凋亡,促进了细胞的增殖。CO-IP结果证明了NR2F2与Smad4蛋白物理性结合,且发现过表达NR2F2基因后,Smad 4基因表达显著上升(P<0.01),Smad 4基因调控的下游基因Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D 1表达显著升高(P<0.01);干扰NR2F2基因后,Smad 4基因表达显著下降(P<0.01),Smad 4基因调控的下游基因表达显著降低(P<0.01)。挽救试验发现,过表达NR2F2基因后,干扰Smad 4基因的表达,能显著降低Cyclin D1、Cyclin B、CDK 1以及Ki67、PCNA的表达(P<0.01,P<0.05)。本研究结果表明,过表达NR2F2基因后促进了细胞的增殖,抑制凋亡,且NR2F2蛋白能与Smad4蛋白结合并影响Smad 4基因的表达,进而影响下游基因的表达。

类猪圆环病毒P1诱导PK15细胞自噬的研究

旨在探讨类猪圆环病毒P1感染对PK15细胞自噬的影响。将同一批PK15细胞分成对照组和感染组,感染组在类猪圆环病毒P1感染PK15细胞后14,24,48 h分别收集细胞,对照组也在同样时间收获,用透射电镜观察自噬现象的发生。结果表明,与对照组相比,感染组PK15细胞内出现典型自噬形态学变化。揭示类猪圆环病毒P1能诱导PK15细胞发生自噬,但细胞发生自噬的相关信号传导通路还有待进一步研究。

猪肾细胞(PK15细胞)ABCA1基因与miRNA-758关系的研究

为了研究猪肾细胞(PK15细胞)中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ABCA1)mRNA与miRNA-758表达量之间的关系,试验利用miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照分别转染PK15细胞,利用Real-time qPCR技术检测转染24 h后细胞内ABCA1 mRNA与miR-758相对表达量并讨论其之间的关系。结果表明:在PK15细胞中转染miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照后,ABCA1 mRNA表达量均极显著升高(P<0.01)。转染miR-758模拟物的PK15细胞miRNA-758表达量高于对照组30 000多倍,差异极显著(P<0.01);而其他转染组miR-758表达量均低于对照组,但差异不显著(P>0.05)。说明miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照均可导致PK15细胞内ABCA1 mRNA表达量升高;miR-758模拟物可促进PK15细胞miR-758表达量上升30 000多倍,而对ABCA1 mRNA表达量并未表现出抑制作用,PK15细胞中ABCA1mRNA的表达量不受miR-758模拟物影响或受影响小;miR-758抑制物确实能够抑制miR-758表达量,并使ABCA1 mRNA表达量升高。

猪SAP基因对PK15细胞凋亡的影响

为了研究不同浓度的血清淀粉样P物质(serum amyloid P component,SAP)对猪PK15细胞凋亡的影响,试验采用不同浓度的pEGFP-N1-SAP转染细胞及RT-PCR检测的方法,观察细胞形态、数量的变化,研究细胞中SAP基因的表达情况。结果表明:SAP基因能够在PK15细胞中表达,转染后的细胞变扁平,随着pEGFP-N1-SAP浓度的增加,细胞凋亡数目增加,细胞总DNA降解越多,说明SAP能够促进猪PK15细胞的凋亡。

肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响

本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调(P<0.01);细胞外基质中纤连蛋白(FN)和层连接蛋白(LN)含量均极显著增加(P<0.01)。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞(P<0.01);Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。

荷包猪SLA-2-HB01真核表达载体的构建及在PK15细胞中的表达

为构建荷包猪SLA-2-HB01真核细胞表达载体,观察其在PK15细胞中的表达情况。首先参考SLA-2-HB01基因编码区序列设计了引物对,以SLA-2-HB01-pMD 18-T为模板PCR扩增获得SLA-2-HB01编码区基因片段,经TA克隆及菌落PCR筛选得到阳性克隆菌。测序正确后大量双酶切回收目的基因片段并与真核表达载体pEGFP N3相连接获得重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,重组质粒转化至大肠杆菌经大量克隆后,抽提阳性重组质粒并通过脂质体介导转染至PK15细胞,通过荧光显微镜观察转染后PK15细胞的荧光强度,进一步通过Western Blotting检测PK15细胞中SLA-2-HB01蛋白的表达情况。结果显示PCR成功扩增得到SLA-2-HB01,大小为1 104 bp,并成功构建重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,酶切鉴定证实插入片段大小为1 092 bp。SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒转染PK15细胞后具有绿色荧光,Western Blotting显示SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白分子量大小为70 kD,与理论值相符。成功构建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒,并初步确认SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白成功在PK15细胞中表达,为下一步进行SLA-2-HB01递呈多肽表位的研究奠定基础。

猪NLRC5对PK15细胞中SLA Ⅰ类分子表达的调控研究

为探究猪核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族端酶募集(CARD)结构域-5(NLRC5)在PK15细胞中的表达情况及其对猪白细胞抗原I类分子(SLA I)表达的调控作用,本研究利用不同终浓度(1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL)Poly I:C刺激PK15细胞后24 h,通过荧光定量PCR(qPCR)和western blot方法分别检测NLRC5 mRNA转录水平和蛋白的表达水平;设计NLRC5的3条siRNA和对照siRNA分别转染PK15细胞48 h后,分别采用qPCR和western blot检测PK15细胞中NLRC5 mRNA转录水平和蛋白表达水平,从而筛选出最优敲低NLRC5表达的siRNA;将筛选出的最优siRNA和对照siRNA分别转染PK15细胞48 h后,采用qPCR分别检测PK15细胞中NLRC5和SLA I类分子mRNA的转录水平,采用western blot检测PK15细胞中NLRC5蛋白表达水平,通过流式细胞术检测PK15细胞表面SLA I类分子的表达。构建重组质粒pCAGGS-HA-NLRC5并鉴定正确后转染PK15细胞,48 h后,采用qPCR分别检测PK15细胞中NLRC5和SLA I类分子mRNA的转录水平,采用western blot检测PK15细胞中NLRC蛋白表达水平,通过流式细胞术检测PK15细胞表面SLA I类分子表达水平。结果显示,与正常PK15细胞相比,经不同浓度Poly I:C刺激后PK15细胞中NLRC5 mRNA转录水平和蛋白水平均显著升高(p<0.01)。siRNA的筛选结果显示,NLRC5-sus-3为最优siRNA;将其转染PK15细胞后的qPCR和流式细胞术检测结果显示,与转染对照siRNA的PK15细胞相比,敲低NLRC5的PK15细胞中SLA I类分子的mRNA转录水平(p<0.01)和细胞表面SLA I类分子的表达水平均显著降低(p<0.01);重组质粒pCAGGS-HA-NLRC5转染PK15细胞后的结果显示,NLRC5 mRNA转录水平和蛋白水平均显著增高(p<0.01),表明NLRC5在PK15细胞中获得了过表达。qPCR和流式细胞术结果显示,过表达NLRC5后的PK15细胞中SLA I类分子mRNA的转录水平(p<0.01)和其在细胞表面的表达量均升高(p<0.05)。综上所述,经Poly I:C刺激可促进PK15细胞中NLRC5的表达,且NLRC5对SLA I类分子的表达具有正调控作用。本实验是首次在猪源细胞中进行了NLRC5对SLA I类分子表达的调控研究,为进一步探究机体在病原感染过程中的免疫防御机制提供了新思路。

猪细小病毒在PK15细胞中增殖规律的研究

猪细小病毒毒株在不同细胞系上的生长情况不尽相同,如不能掌握其规律,将难以生产出优质的疫苗。对PPV(长春株)在PK15和ST细胞上生长情况进行了研究,在PK15细胞系中重点比较了不同的病毒接种方法、病毒接种量和病毒收获时间等因素对病毒产量的影响。研究结果显示:本毒株在PK15和ST两种细胞系上的病变特征不同,但生长规模相似。在PK15细胞上按2%接种量、分步接种、80 h时收获病毒,最终得到的病毒滴度(TCID50)最高。提示这是一种比较好的生产方案。然而,进一步的大规模培养试验是有必要的。

PK15细胞的无血清全悬浮驯化研究

目前PK15细胞主要用于生产猪圆环病毒2型,传统的培养工艺为滚瓶系统或微载体系统,该两种培养系统都存在各自的劣势。驯化一株全悬浮的PK15细胞可推进工艺的进一步升级,降低成本的同时也简化了培养工艺且更易于产业化。经贴壁降血清培养、低血清悬浮优化传代、无血清悬浮传代培养,对一株贴壁的PK15细胞进行了无血清的全悬浮驯化。传代23次后,该株细胞无血清全悬浮培养初始密度为0. 5×106/m L,在72 h密度可增殖到4. 0×106/m L左右,形态良好,倍增时间稳定,且细胞活率达到95%以上,命名为PK15-S,为大规模培养PK15细胞提供了理论依据。

乙型脑炎病毒感染PK15细胞的lncRNA差异表达谱分析

旨在分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染猪肾上皮细胞PK15后的lncRNA差异表达谱,探究宿主lncRNA在JEV感染和宿主防御中的潜在功能。本研究中利用JEV感染PK15细胞,感染36 h,收集细胞,同时设立未感染对照组,每组3个生物学重复。提取细胞总RNA,构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选出差异表达lncRNA。通过对差异表达lncRNA与mRNA的位置关系以及序列相似性预测顺式和反式作用的靶基因,将预测的靶基因进行GO和KEGG分析。最后随机选出9个差异表达lncRNAs,利用实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)技术进行表达验证。结果表明,本研究中共鉴定出856个差异表达lncRNAs,其中452个lncRNAs显著上调表达,404个lncRNAs显著下调表达。GO分析发现,lncRNA的靶基因主要富集于先天性免疫反应;KEGG通路分析发现lncRNA的靶基因显著富集于肿瘤坏死因子、Toll样受体和NF-κB等信号通路。通过qRT-PCR验证发现,定量结果和测序结果基本一致。本研究为进一步探究lncRNA参与宿主免疫反应调控JEV复制奠定了理论基础。

猪RPL36A基因对PK15细胞增殖过程的影响

【目的】探究核糖体蛋白L36A(ribosomal protein L36A,RPL36A)基因对PK15细胞增殖过程的影响,为解析马身猪和大白猪生长速度差异的生理机制奠定基础。【方法】采用脂质体法将RPL 36 A基因干扰和过表达载体转染至PK15细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测RPL 36 A基因表达效率及细胞增殖标志基因(PCNA、Ki67、Cyclin B、CDK4)的表达变化,并通过划痕试验、CCK-8和EdU法检测细胞增殖情况。【结果】过表达RPL 36 A基因后,PK15细胞中PCNA、Ki 67、CDK 4基因mRNA表达量均极显著升高(P<0.01),Cyclin B基因mRNA表达量显著升高(P<0.05);PCNA蛋白表达量显著升高(P<0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量极显著高于空载组(P<0.01),细胞增殖速度升高;阳性细胞数极显著升高(P<0.01)。干扰RPL 36 A基因后,PK15细胞中PCNA、Cyclin B基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),Ki 67、CDK 4基因mRNA表达量均显著降低(P<0.05);PCNA蛋白表达量显著降低(P<0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量显著低于对照组(P<0.05),细胞增殖速度降低;阳性细胞数极显著降低(P<0.01)。【结论】在PK15细胞中过表达和干扰RPL 36 A基因后,细胞增殖关键基因PCNA、Ki 67、Cyclin B、CDK 4的表达量及48 h的细胞数量和阳性细胞数均有显著变化,RPL 36 A基因可影响PK15细胞的增殖过程。

基于PK15细胞的猪圆环病毒2型全悬浮培养工艺

【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺(病毒种毒来源、MOI及收获时间),为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆(PK15-1C8、2F11、1E5)按照1×10^(6)细胞/m L的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒(来源于贴壁细胞或悬浮细胞),摸索感染MOI(0.1、0.2、0.5)及收获时间(48、72、96、120h),确定PCV2最佳生产工艺。【结果】(1)贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×10^(6)/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×10^(6)/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;(2)3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到10^(6.4)TCID_(50)/mL,克隆PK15-2F11(10^(5.5)TCID_(50)/mL)、PK15-1E5(10^(5.6)TCID_(50)/mL),3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆(10^(4.7)TCID_(50)/mL),但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;(3)使用贴壁细胞来源的种毒(10^(6.4)TCID_(50)/mL)感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×10^(6)/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为10^(6.5)TCID_(50)/mL。以来源于悬浮细胞的种毒(10^(6.3)TCID_(50)/mL)感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达10^(7.3)TCID_(50)/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×10^(6)/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达10^(7.3)TCID_(50)/mL,可用于工厂化疫苗生产。