烤烟不育系F1代PVY遗传性状初探

为探究烤烟马铃薯Y病毒(Potato VIRUS Y,PVY)遗传性状规律,通过对烟草种质资源田间PVY自然感病调查及分析,杂交不育系育种F1代对PVY的表现介于父母本之间的组合占50%~57.14%,平均为53.85%,差于父本的组合占42.86%~71.43%,平均为57.69%。烤烟不育系抗PVY杂交育种,F1代多表现为趋中遗传,趋近于父本的比例较多。综上,父本选择要尽量选用抗本PVY较好的品种(系),其不育系F1代才有更多的机会育出抗PVY的品种(系)。

抗烟草PVY生防细菌D3-1的筛选鉴定及活性物质分析

由马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的病毒病在烟草种植地区大面积发生,对烟草品质和产量产生重大影响。采用半叶枯斑法筛选出对烟草PVY防治效果优良的生防细菌D3-1,对PVY的枯斑抑制率达99.71%,经形态学、生理生化特性以及16Sr DNA序列鉴定其为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。菌株D3-1具有广谱的抑菌能力,可抑制病原真菌和细菌生长,菌株D3-1发酵液(1×10^(9)CFU/m L)对烟草PVY的田间防治效果为63.67%。全基因组测序分析发现菌株D3-1基因组含有表面活性素surfactin、丰原素fengycin、嗜铁素bacillibactin等12种具有抑菌作用的次生代谢产物合成基因簇,经HPLC-MS定性分析确定了表面活性素surfactin和丰原素fengycin等32个脂肽类提取物。菌株D3-1对PVY有良好防治效果,具有作为防治烟草PVY生防菌剂的潜力。

一株突破va基因型烟草抗性的PVY病毒分离物的鉴定

【背景和目的】近来,能突破va基因型抗性的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)毒株在烟草上不断出现。2016年,我们分离到一株抗性突破的毒株PVY-CJ,本文对该病毒分离物进行了验证和鉴定。【方法】采用病毒重新接种、多重RT-PCR、RT-PCR分段扩增病毒全长基因组、PVY病毒分子进化分析及病毒蛋白VPg蛋白序列比对等方法对PVY-CJ毒株进行了验证和鉴定。【结果】三种重新接种了PVY-CJ的va基因型烟草品种均发病。多重RT-PCR结果将PVY-CJ鉴定为PVYNTN株系。序列分析表明,PVY-CJ全长基因组包含一个全长9180 nt的开放读框,其编码一个3060 AA的多聚蛋白。分子进化分析进一步验证了其归类于PVYNTN株系。相比其他PVYNTN株系毒株,PVY-CJ的VPg蛋白105位氨基酸出现了一个由赖氨酸到谷氨酸的替换,而这一氨基酸替换导致了其对va基因来源抗性的突破。【结论】我们首次报道并鉴定了国内一株能突破va基因型烟草抗性的PVY毒株—PVY-CJ。这为进一步研制PVY抗病烟草品种提供了材料。

抗PVY云烟87定向改良新品种“云烟301”的选育及特征特性

抗PVY云烟87新品种"云烟301"是云南省烟草农业科学研究院、国家烟草基因工程中心在克隆烟草隐性抗PVY基因eif4e1(又称为感PVY基因eIF4E1)、开发功能性分子标记、分析国内外抗PVY品种和种质资源基因型过程中,以云烟87为母本、Y85×RY2/F2为父本(携带eif4e1)杂交,以定向改良云烟87的PVY抗性为主要目标,通过连续回交、分子标记辅助选择、全基因组基因芯片背景检测等技术培育而成(非转基因)。云烟301的遗传背景恢复为云烟87的比率为99.43%,云烟301的PVY抗性显著提高,保留了云烟87的栽培烘烤特性、原烟风格特征和感官质量。在打顶后PVY发病率达到1%的云烟87种植区,种植云烟301可挽回病害损失,具有良好的推广价值。

抗PVY烟草种质的遗传多样性分析

利用SSR标记对78份抗PVY烟草种质进行遗传多样性分析,根据类型将78份材料分为烤烟、晒晾烟和黄花烟3个群体。结果表明：（1）从960对引物组合中筛选出45对扩增带型清晰、重复性和多态性好的引物用于78份烟草种质资源遗传多样性研究,共检测到108个位点,其中96个位点具有多态性,多态性比例为88.89%。遗传多样性指数（Nei’s）为0.3766,Shannon’s指数为0.5821,种质间遗传相似系数变异范围在0.0454～0.9973之间,说明我国抗PVY烟草种质资源存在着丰富的遗传变异。（2）3个群体内遗传差异由大到小分别为：晒晾烟〉黄花烟〉烤烟。3个群体间遗传距离比较分析,晒晾烟与烤烟的遗传相似度达到0.9840。（3）聚类分析可将78份种质材料划分为黄花烟草和普通烟草2大类群,烤烟、晒晾烟之间没有明确的界线。聚类分析结果也表明,黄花烟与其他群体的遗传距离较远。

利用母本来源的单倍体技术获得双抗TMV和PVY烟草株系

为选育双抗烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的烟草材料,采用Coker176与NC55杂交后代F1与非洲烟杂交获得单倍体苗,经过苗期抗性鉴定、分子标记辅助选择和叶脉培养加倍,获得母本来源的双抗TMV和PVY的双单倍体。通过人工接种抗性鉴定、标记检测和田间株系比较,获得抗性、植物学性状稳定的双单倍体第三代种子。与常规杂交系统选育相比较,双单倍体方法的获得后代变异更大、性状更容易稳定。

河南PVY高致病性株系的发现及其分子特征研究

建立了依据cp基因或p1基因序列联合分析的PVY株系鉴定方法.分别克隆了河南省郑州市、信阳市、卢氏县等3个PVY分离物的p1基因和cp基因,采用上述方法并结合生物学和血清学方法对各分离物的株系种类进行了鉴定.结果表明,郑州市、信阳市的PVY分离物为PVYN∶O株系;卢氏县分离物为PVYNW株系.同时证明中国PVYN∶O株系和PVYNW株系的基因序列具有一定的地域特征.

PVY^N与PVY^O病毒RT-PCR快速检测体系研究

马铃薯Y病毒(PVY)是侵染马铃薯的重要病毒之一,严重影响马铃薯的生产。本文通过对PVY病毒N株系(PVYN)与O株系(PVYO)的基因序列进行比较,在其外壳蛋白同源区设计一对通用引物,建立了PVY病毒的RT-PCR检测体系。另外在N株系与O株系同源区设计一条3′引物,选择N株系与O株系差异区设计两条5′端引物,建立了可鉴定PVYN与PVYO的复合RT-PCR体系。这个体系的建立,对于马铃薯脱毒苗的检测与PVY病毒的调查及病理研究都具有一定的应用价值。

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。

马铃薯Y病毒蚜传辅助成分介导PVX/PVY协生作用

构建了马铃薯Y病毒中国株系 (PVY C)蚜传辅助成分 (HC Pro)基因的正义、反义和缺失三种植物表达载体 ,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89。Southernblot分析表明 ,HC Pro基因及其突变体已经整合到烟草染色体中 ,Westernblot分析证明 ,正义HC Pro基因及其缺失突变体在转基因烟草中有表达产物。攻毒试验结果证明 ,转正义HC Pro基因及其缺失突变体不仅能够提高T1转基因烟草中PVY C的病毒积累和致病性 ,而且对异源病毒PVX具有同样的作用 ,而转反义HC Pro基因烟草对PVY C和PVX的致病性无影响。因此PVY CHC

TMV、PVY福建分离物分子鉴定及末端区域变异分析

为及时准确地鉴定出病毒病原和追踪了解病毒病流行变异趋势,使用特异性引物对福建烟区病毒烟叶样品进行RT-PCR分析,分别鉴定出病毒病原为TMV和PVY。序列测定结果表明PCR扩增产物为预期的TMV 5’末端和PVY 3’末端序列,大小分别为959和646个核苷酸,均包含末端非编码区和部分病毒功能基因蛋白编码区。将所获得的病毒末端序列与国内外报道的主要病毒分离物的同一区域进行比较,分析结果显示TMV 5’端非编码区保守性极强,不同分离物之间部分126 kDa或183 kDa编码蛋白N端编码区表现出一定程度的变异(突变),PVY外壳蛋白编码区与3’末端非编码区变异数量差异不大,变异(突变)均主要为碱基转换,环境自然选择压力对病毒基因组变异(突变)具有一定的影响。

马铃薯Y病毒(PVY)对晚疫病(Phytophthora infestans)的影响

在温室条件下，以脱毒马铃薯为试材，研究了PVY对晚疫病的影响。结果表明：PVY汁液接种脱毒马铃薯28d后，用晚疫病菌接种，其孢子囊悬浮液浓度为1．0×104个·mL-1时，PVY对晚疫病的抑制作用最明显；马铃薯植株体内PVY的浓度与晚疫病的发病率、病斑大小及病情指数呈负相关。说明马铃薯感染PVY后诱导了植株对晚疫病的抗性，不同因子影响降低了马铃薯感Y病毒叶片对晚疫病菌的感病性。

利用qRT-PCR技术对PVY重组株系的鉴定

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)作为制约马铃薯生产的重要病毒之一,株系分化繁杂。近年被科学家研究分离的PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系而言,其基因组结构极为相似但致病性差异较大。【方法】本研究利用qRT-PCR方法,方便快捷的检测出马铃薯Y病毒的这2种不同株系,同时并使之可成功且稳定的应用于马铃薯生产中。通过查找Gen Bank已公布的PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系的全基因组序列,设计用于qRT-PCR检测,扩增目的片段大小为150 bp左右的特异性引物,应用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)进行检测。【结果】通过设计的引物对保存的试管苗毒源进行检测,可以成功的精准鉴别出PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系;同时对100份田间采集的叶片样品进行检测,成功的检测出100份样品中32份样品,受到PVY^(N-Wi)株系侵染;27份样品,受到PVY^(NTN-NW)株系侵染;同时存在9份样品,可能同时受到PVY^(N-Wi)、PVY^(NTN-NW)株系的侵染。【结论】实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)可适用于马铃薯叶片样品的检测,为株系的快速鉴定提供了可靠的方法,可用于生产中大规模样品的检测,有利于及时采取防控措施,降低损失。

抗PVY^N药剂-KY1号的研制及其作用机理的研究

本文对自主开发的抗 PVYN药剂—KY1号的防治效果及其作用机理做了初步探讨。室内试验表明 ,KY1号对烟草 PVYN的防治效果高达 88.34% ;大田试验表明喷施 KY1号对烟草 PVYN的防治效果为 84 .8% ,明显优于目前常用农药病毒 A、菌克毒克等。对 KY1号抗病毒的作用机理进行了研究。结果表明 KY1号对 PVYN有强烈的体外钝化作用 ,且钝化作用是不可逆的。KY1号体外能将病毒粒子破坏成小碎段 ,使其失去侵染能力 ;对 POD活性的研究表明 ,KY1号的处理酶活性普遍提高 ,明显高于对照 ,且高峰期延后 2～ 3d,与症状发展一致。POD同工酶谱带分析表明 KY1号处理出现对照没有的一条新谱带 ;KY1号还能抑制烟草赤星病菌。

铜元素诱导烟草抗PVY^N相关生理生化及信号物质的研究

通过气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)及生理生化指标的测定,研究了铜(Cu)元素诱导感染PVYN的烟株信号物质的积累及对系统抗性的影响。结果表明:喷施Cu元素能延迟烟株显症和叶脉出现褐色坏死时间,降低发病程度,病毒增殖受到抑制,烟株体内的与抗性相关物质如脯氨酸及可溶性糖含量升高,电解质的外渗减少。此外,Cu元素处理能诱导信号物质水杨酸和乙烯的积累,水杨酸含量在接种后15d达到最大量3.93μg·g-1,为接种对照的1.3倍;而乙烯释放量在3～9d内均高于接种对照,在12d时乙烯释放量显著低于接种对照,分析认为前期Cu元素处理后诱导了乙烯释放的增强,进行抗性信号的传递。因此,喷施Cu元素后可以诱导烟草植株产生抗病性,增强烟草对PVYN侵染的抵抗力,并且诱导了相关抗性信号的传递。

PVY抗性基因eif4E-pvr2转化烟草的初步研究

eif4E-pvr2基因是辣椒中的一种PVY抗性基因,与感病辣椒品种的eif4E基因只有两个碱基的差异。实验采用RT-PCR从感病材料中克隆得到感病的eif4E基因,再经过定点突变得到eif4E-pvr2基因,构建了抗性表达栽体pMEIF2301,并利用叶盘法转化烟草,经GUS和PCR检测,初步明确eif4E-pvr2基因已整合到烟草基因组中。

TMV和PVY外壳蛋白双基因融合干涉及烟草转化

为了降低烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)和马铃薯Y病毒(potato virusY,PVY)复合侵染对烟草带来的危害,本实验找到TMV-CP和PVY-CP基因部分保守序列,将保守序列进行双基因融合,此双基因即为RNAi的靶序列,用限制性内切酶将双基因从pMD18-T载体上切下,正反向连接到pUCCRNAi载体后,经酶切鉴定后定向连接到含超强启动子的pC2300-35S-OCS表达载体上,利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,构建含靶序列反向重复结构的RNAi双元载体系统,提取转化质粒,经酶切验证鉴定表明TMV和PVY外壳蛋白基因植物表达双元载体构建成功。并转化烟草,获得了3株对TMV和PVY抗性显著提高的转基因烟草。

amiRNA介导的兼抗PVX、PVY、PSTVd马铃薯植株获得及抗性鉴定

为获得兼抗多种病毒(类病毒)的马铃薯植株,分别克隆了靶向PVX、PVY和PSTVd蛋白的P25、HC-Pro和Virp1基因,以拟南芥pre-miR159a为骨架设计了针对P25、HC-Pro和Virp1基因的amiRNA序列,通过Overlapping PCR将3个amiRNA片段连接,并导入植物双元表达载体pCAMBIA1300-221,构建植物表达载体p1300-221-pre-amiR-P25-HCPro-Virp1,经PCR及酶切验证,表达载体构建正确。农杆菌介导法将含目的基因质粒菌液侵染马铃薯品种费乌瑞它脱毒微型薯片,经再生、压力筛选,抗性植株分化及植株壮苗共获得转化株系15株,PCR检测结果表明,其中10株检测到与目的基因大小一致的片段(729 bp)。qRT-PCR结果显示,外源amiR-P25-HCPro-Virp1基因在10个转化植株中均有表达,相对表达量在7.68~21.37。对T0阳性转化植株的攻毒试验,将PVX、PVY和PSTVd病毒等量混合液摩擦接种至6~8叶期的植株叶片,20 d后观察发现,对照植株感病严重,出现植株矮小、叶片斑驳等症状,而转化植株未表现出感病症状,生长正常。RT-PCR进行病毒特异性检测,结果显示,转化植株中也未检测到病毒序列,这表明转amiR-P25-HCPro-Virp在转化植株中能稳定表达,转化植株能够兼抗PVX、PVY和PVSTd 3种病毒(类病毒)。得到了同时兼抗PVX、PVY和PVSTd转化植株,且抗性显著,为马铃薯抗病毒育种提供了新的遗传资源。

抗PVY马铃薯品种遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD技术分析了国内外37种抗PVY马铃薯资源。提取马铃薯(Solanumtuberosum)新鲜叶片的总DNA,用17种RAPD引物进行随机多态性扩增,利用遗传多样性信息,进行亲源关系的分子鉴定。试验表明:平均每10个碱基引物扩增出6￣21条谱带,共获得164条特异性谱带,平均每个引物扩增获得9.8条多态性谱带,多态性比率平均为76.3%。RAPD分析表明37种抗PVY马铃薯资源之间的遗传距离介于0.06￣0.68之间,平均值为0.35,平均遗传距离介于0.27￣0.50之间,聚类分析将37种抗PVY材料划分为三个类,聚类结果同材料的血缘关系密切,并且表现出一定的地域特性。根据扩增的特异性谱带可进行抗PVY马铃薯资源的分子鉴定,为抗PVY育种亲本选配提供了依据。