广谱抗性基因Pi9导入改良水稻“大粒香”稻瘟病抗性的研究

水稻品种大粒香以米质优、香味浓郁连续5次获“中国优质稻米博览交易会金奖”,但因高感稻瘟病,严重限制了其在生产上的应用。本研究以含有广谱抗性基因Pi9的空育131为父本,通过常规杂交、连续回交和分子标记辅助选择将Pi9导入大粒香中,创制株叶形态、千粒重、米质及香味等重要性状上与大粒香基本一致的改良株系。大粒香改良株系抗性鉴定结果表明,其稻瘟病抗性与大粒香相比显著提升,达到品种生产应用的抗性标准,实现对大粒香稻瘟病抗性的定向改良。

利用Pi9基因序列标记辅助选择改良籼稻稻瘟病抗性

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9基因序列设计的特异分子标记Pi9–a,通过回交育种和分子标记辅助选择技术,改良8份受体水稻材料(丰源B、Ⅱ32B、天龙香103、香丰187、明恢63、轮回422、R747、25H003)的稻瘟病抗性。结果表明:分子标记Pi9–a对8份受体亲本与Pi9供体亲本75–1–127间进行的多态性检测中,除香丰187外,其余7个组合间均存在稳定明显的多态;对4个BC1F1群体进行随机取样的基因型和表型鉴定中,Pi9–a对抗稻瘟病表型选择的效率均为100%。

广谱抗性基因Pi9在黑龙江省水稻品种中的分布

2014年利用显性标记p B8对黑龙江省96份水稻主栽品种筛选Pi9基因,对供试材料作苗期和分蘖期抗病鉴定,明确Pi9基因在黑龙江省水稻品种中分布情况及应用价值。结果表明,供试材料中,有早熟青森、垦粳1等44个品种含有Pi9基因,苗期和分蘖期平均发病级别均为2.4级;青森5号、长白9号等52个品种不含Pi9基因,苗期和分蘖期平均发病级别分别为5.1和5.4级。研究结果可为黑龙江省水稻品种改良以及抗病资源合理利用奠定基础。

聚合抗褐飞虱基因bph20(t)和bph21(t)及抗稻瘟病基因Pi9水稻株系筛选

【目的】筛选聚合抗褐飞虱和抗稻瘟病基因水稻材料,为培育新型抗褐飞虱兼抗稻瘟病的水稻新种质提供参考。【方法】利用常规育种、分子标记辅助育种和抗病虫鉴定相结合的手段,将抗稻褐飞虱基因bph20(t)和bph21(t)以及广谱高抗稻瘟病基因Pi9聚合到优良保持系博ⅢB的遗传背景中。【结果】bph20(t)的分子标记RM540和BYL7、bph21(t)的分子标记RM5348和RM222未在稻褐飞虱抗、感亲本间扩增出特异条带,无明显的多态性,不能用于该育种群体抗褐飞虱基因bph20(t)和bph21(t)的检测。Pi9的显性分子标记pB8以及共显性分子标记PB9-1在稻瘟病抗、感亲本之间可扩增获得特异条带,具有多态性,可用于Pi9基因的检测。经抗虫鉴定并利用标记PB9-1对BC6F2群体的22株材料进行PCR扩增,含有Pi9基因杂合体的有10株,纯合体有6株,不含Pi9基因的有7株。用源自广西南宁田间感褐飞虱和稻瘟病菌株进行多次抗病虫鉴定,筛选获得一批抗褐飞虱材料,其中抗性与抗虫亲本BPH54相当的材料有6份,在这6份材料中含有Pi9基因且抗稻瘟病的材料有5份,对稻褐飞虱的抗性与供体亲本BPH54水平相当。【结论】通过常规育种、分子检测和抗虫鉴定相结合的办法,筛选获得5份聚合褐飞虱抗性基因(bph20和bph21)和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中间材料,为选育新的双抗保持系和不育系提供种质材料。

抗稻瘟病基因Piz-t和Pi9连锁标记开发及在云南粳稻中的应用

云粳优5号、云资粳41号和楚粳28号是农艺性状优良但对稻瘟病抗性弱的粳稻品种,采用回交的方法将2个广谱抗稻瘟病的基因Piz-t和Pi9导入这些品种以改良这3个品种的抗稻瘟病特性。为提高后代抗病材料选择的准确性和效率,本研究开发获得5个与Piz-t和Pi9基因紧密连锁并且在供体亲本和受体亲本间具有多态性的分子标记。利用分子标记跟踪检测来源于供体亲本与受体亲本回交获得的BC1F1单株中Piz-t和Pi9基因,并进一步利用对受体亲本云粳优5号、云资粳41号和楚粳28号致病,但对持有Piz-t和Pi9基因的供体亲本不致病的稻瘟病菌09BSH-10-5A进行接种分析。结果显示,携带有供体亲本和受体亲本DNA片段的杂合单株均表现抗病,而仅携带受体亲本DNA片段的个体均表现为感病。表明所开发的5个分子标记可用于抗病育种的分子标记辅助选择,有效提高抗病材料选拔的准确性与效率,创制新的抗源材料。

籼稻1701转Pi9基因株系的遗传分析及抗瘟性鉴定

利用农杆菌介导法将广谱抗稻瘟病基因Pi9导入籼稻品种1701中,得到了大量的T1代和T2代转基因植株.对T2代植株进行遗传分析和稻瘟病抗性鉴定,结果表明,外源基因Pi9已转入到受体基因组中,并在T2代植株中得到表达.

广谱抗稻瘟病基因Pi9对籼稻的转化研究

通过农杆菌介导法,将由CaMv35s启动子启动的广谱抗稻瘟病基因Pi9转入5个籼稻品种(丰源B、湘晚籼13号、R996、527、1701)的愈伤组织中,所用质粒为pCAMBIA1301,pCAMBIA1301的T-DNA区含有潮霉素(hygmycin)抗性基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因。以潮霉素作为筛选剂对籼稻愈伤组织进行筛选,结果表明,不同品种在转化过程中抗性愈伤率在73.9%￣83.3%之间,获得的部分抗性苗经PCR检测为阳性,阳性植株的转化率差异显著,其转化率为5.7%￣25.9%之间,对获得的抗性苗和T2代幼苗的根和叶进行GUS组织化学染色分析,有些抗性苗和T2代幼苗的根和叶呈蓝色反应,表明广谱抗稻瘟病基因Pi9基因已整合到水稻基因组并能正常表达。对T2代进行稻瘟病小种接种试验,结果显示了抗性分离。并且建立了一套较为有效的水稻遗传转化体系。

陕西省水稻种质资源中Pi9基因的分布状况

【目的】明确陕西省主要稻种资源中Pi9基因的分布状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。【方法】利用抗稻瘟病抗性基因Pi9的显性标记PB8和共显性标记PB9-1对2012年长江上游国家水稻区域试验材料62份、陕西省水稻区域试验材料99份及陕西省水稻研究所原始材料圃331份材料进行Pi9基因位点检测。【结果】在161份区试材料中,13份为抗性基因纯合体,18份为抗性基因杂合体,其余为感性基因纯合体。331份材料原始材料中,18份为抗性基因纯合体,15份材料未检测出条带,其余均为感性基因纯合体。【结论】陕西省主要水稻种质资源中Pi9基因所占比例较少。

用分子标记对部分高代育种材料抗稻瘟基因Pi9(t)的检测

用分子标记PB8对课题组新育成的部分高代育种材料进行抗稻瘟病基因Pi9(t)的检测,检测到27份材料中含Pi9(t)基因1、1份材料含Pi9(t)纯合基因。对含Pi9(t)纯合基因的材料进行了四川主要稻瘟病生理小种的接种鉴定,其抗性频率达78.13%～87.50%,表明Pi9(t)基因是四川稻区稻瘟病的主效抗病基因,对四川主要稻瘟病生理小种表现出较高的抗性。

利用分子标记辅助选择聚合Xa4、Xa23和Pi9基因

利用常规回交育种结合分子标记辅助选择技术,将高抗水稻白叶枯病Xa4和Xa23基因、广谱高抗稻瘟病Pi9基因聚合到同一株系中,获得了三基因聚合的纯合株系。选用广西具有代表性的13个稻瘟病菌株、白叶枯病广致病型菌系P6和中国7个流行菌系对杂交后代进行人工接种鉴定,结果表明,聚合了Xa4、Xa23和Pi9基因的株系09-371、09-375能同时抗白叶枯病和稻瘟病,对白叶枯病抗谱和抗性水平与供体材料W7相当,对稻瘟病的抗性与供体亲本75-1-127水平相当。Xa4、Xa23和Pi9三基因纯合株系可以作为水稻育种的多抗供体材料。

持有Pi9基因的水稻单基因系IRBL9-W对稻瘟病菌苗期和成株期抗性差异

【目的】Pi9是一个广谱稻瘟病抗性基因,田间病圃监测发现持有Pi9的水稻单基因系IRBL9-W在苗期高抗稻瘟病,但却感穗瘟。探明水稻单基因系IRBL9-W在苗期抗病而孕穗末期感染穗颈瘟的原因,为Pi9基因在水稻抗病育种中的有效利用提供参考。【方法】利用从IRBL9-W穗颈瘟病斑上分离的8个单孢菌株以及实验室保存的单孢菌株Y363,在温室分别对单基因系IRBL9-W苗期和孕穗末期进行接种鉴定;并利用病原菌AvrPi9基因的特异引物对9个单孢菌株进行PCR扩增及产物测序;提取水稻单基因系IRBL9-W苗期叶片和抽穗期穗部的总RNA,通过半定量RT-PCR以及实时qRT-PCR分析Pi9基因在苗期和穗期的表达。【结果】在温室人工喷雾接种条件下,IRBL9-W在苗期对从穗颈瘟上分离的8个单孢及对照菌株Y363均表现为抗病;随机选取的2个从IRBL9-W穗颈瘟病样分离的单孢菌株(YX2-7-1和YX2-15-1)及对照菌株Y363对孕穗末期IRBL9-W注射接种,接种的植株表现出典型的穗颈瘟症状;AvrPi9的等位基因分析结果表明,与AvrPi9相比,Y363中的等位基因与AvrPi9完全相同,而从IRBL9-W穗瘟分离的8个单孢菌株中编码区与AvrPi9基因完全相同,但在编码起始位置上游−264 bp处缺失16 bp的一段序列。由于IRBL9-W苗期对这些菌株均表现抗病,推测这段序列的缺失并不影响AvrPi9基因的功能;实时qRT-PCR分析结果表明,Pi9基因在穗部的表达量为苗期叶片表达量的47.3%。【结论】在水稻单基因系IRBL9-W中,与苗期叶片中Pi9基因的表达量相比,Pi9基因在穗部表达量的明显降低可能是造成IRBL9-W穗期感稻瘟病的原因。

宁夏水稻品种抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的检测分析

为明确宁夏水稻品种中抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的分布情况,为宁夏水稻抗穗颈瘟病的分子标记辅助选择育种奠定基础。利用Pi-ta、Pi-b和Pi9 3个与抗稻瘟病基因紧密连锁的功能标记,对94份宁夏水稻品种进行抗稻瘟病基因的分子检测。结果表明,宁夏水稻品种中含Pi-ta抗性基因的占46.8%,含Pi-b抗性基因的占93.6%,含Pi9抗性基因的占27.7%,同时含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的占44.7%,同时含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的占12.8%。根据报道,Pi-ta、Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性正相关系数为0.71,表明从宁夏水稻品种中选育抗穗颈瘟品种是有基因基础的。

水稻Pi9基因序列标记的开发及其抗瘟育种应用

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9的3'UTR序列设计特异DNA标记pi9utr,通过分子标记辅助选择和连续回交育种实践,改良7份籼稻亲本(316B、金23B、R207、R228、R288、R389、明恢86)的稻瘟病抗性。结果表明:pi9utr是一个高效显性分子标记,除R207外,在其余6份受体亲本与Pi9供体亲本75-1-127间均存在明显而稳定的多态;在室内接种后的316B×75-1-127 BC4F1群体和R288×775-1-127 BC6F1群体中随机取样,进行稻瘟病抗性表型和基因型鉴定及Pi9基因表达分析,证明pi9utr对两个组合回交后代个体的抗病性辅助选择效率均为100%,且在所有抗病单株中均能检测到Pi9基因的高效表达,在所有感病单株中均没有检测到Pi9基因的表达。利用pi9utr在回交世代中的连续辅助选择,获得了3个组合的BC4F1及3个组合的BC6F2代群体,为选育抗稻瘟病新品种打下了基础。

分子标记辅助选择聚合Xa23,Pi9和Bt基因

利用分子标记辅助选择将高抗水稻白叶枯病的Xa23基因、广谱高抗稻瘟病的Pi9基因、抗水稻螟虫和稻纵卷叶螟的Bt基因聚合到同一株系中,获得了三基因聚合的纯合株系。病、虫抗性鉴定结果显示:聚合了Xa23、Pi9和Bt基因的株系HB1471、HB1473能同时抗白叶枯病、稻瘟病和稻纵卷叶螟;与Xa23、Pi9基因的供体材料L10相比,对白叶枯病和稻瘟病的抗谱相同、抗性水平相当;对稻纵卷叶螟抗性与Bt基因的供体亲本MH63-Bt水平相当。Xa23、Pi9和Bt三基因纯合株系可以作为水稻育种的多抗供体材料。

黄淮稻区推广水稻品种稻瘟病抗性基因Pi9和Pi-ta的分子鉴定

为明确Pi9和Pi-ta 2个稻瘟病抗性主效基因在黄淮稻区种植水稻品种中的分布状况,利用分子标记对60个水稻品种进行Pi9和Pi-ta抗稻瘟病基因的分子鉴定。结果表明,60个检测品种中31个含有Pi9抗性基因,9个含有Pi-ta抗性基因,郑稻18、豫农粳12号、豫稻16、泰香2号、武香粳14号和武运粳21号等6个品种携带2个抗病基因。黄淮稻区水稻育种Pi9基因利用广泛,Pi-ta基因利用较少,今后应加强Pi-ta及更多主效广谱抗稻瘟病基因的聚合利用。

稻瘟菌T-DNA插入所致Pi9致病突变体的获得

利用自建稻瘟菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库,筛选获得2个对水稻品种P i9致病的突变体P i9-2-8T940017401和P i9-1-2 T940032801.以T-DNA侧翼序列为探针筛选该菌株的BAC文库,得到阳性BAC克隆.

稻瘟病抗性基因Pi9的功能标记的开发

Pi9基因来源于小粒野生稻,是迄今为止已报道的83个稻瘟病主效抗性基因之一,对稻瘟病具有广谱抗性。对‘WHD75-1-127’的Pi9基因序列和感病对照材料‘Nipponbare’及‘93-11’进行同源性比较,根据不同Pi9基因型水稻的序列差异,构建与Pi9基因紧密连锁的SNP共显性标记,对试验条件进行了探索优化,并与已经报道的显性标记PB8和共显性标记PB9-1比较。结果显示:在Pi9基因区域开发的SNP标记比已经报道的Pi9基因标记简单、有效、准确。

籼稻R996转Pi9基因纯系的筛选及稻瘟病抗性鉴定

采用农杆菌介导法将抗稻瘟病Pi9基因导入籼稻品种R996,获得转基因植株,并对这些转基因植株进行遗传分析。结果表明:Pi9基因已经整合到受体细胞基因组中,并在转录水平上得到了有效表达;对转基因植株后代进行潮霉素抗性、GUS染色和PCR检测分析,鉴定出Pi9基因阳性转化子;经稻瘟病抗性鉴定,从T1代符合孟德尔分离比(1∶2∶1)的分离群体中,成功筛选出转Pi9基因的籼稻R996纯系。

Pi9基因分子标记辅助选择改良水稻不育系丰源A的稻瘟病抗性

为改良水稻不育系丰源A的稻瘟病抗性,以籼稻品系75-1-127作为广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的供体亲本,先后以三系保持系丰源B和不育系丰源A为受体亲本,利用Pi9基因内共显性标记ClonDF_(1) R_(1)开展MAS连续回交育种。利用来自国内外不同稻区的33份稻瘟菌菌株进行温室内人工接种,分析丰源A、丰源B、75-1-127的抗菌谱,75-1-127的抗性频率为87.9%;而丰源A和丰源B的抗性频率均仅为33.3%。田间病圃抗性鉴定表明,75-1-127高抗苗瘟,而丰源B和丰源A高感苗瘟。结果表明,含有Pi9基因的75-1-127抗谱广、抗性水平高,在稻瘟病抗性育种中具有很大的应用前景;而丰源A和丰源B抗谱窄、抗性水平低,需要改良。根据Pi9基因序列信息开发了一个共显性分子标记ClonDF_(1) R_(1),它从75-1-127基因组中扩增出一条320 bp的条带,而丰源B和丰源A基因组的扩增产物约450 bp。利用ClonDF_(1) R_(1)先后开展丰源B、丰源A稻瘟病抗性改良的MAS育种实践,获得了13个含Pi9纯合等位基因的改良抗病保持系丰源B-Pi9,以及11个含Pi9纯合等位基因的改良抗病不育系丰源A-Pi9。经过连续11 a的MAS回交育种实践,育成1个高抗稻瘟病、不育性稳定、柱头外露率高、农艺性状和产量性状优良的新三系不育系丰源A-Pi9-5,实现了丰源A和丰源B稻瘟病抗性的定向改良,为三系杂交水稻育种应用创制了新的亲本材料。

分子标记辅助选择Pi9基因改良R288的稻瘟病抗性

根据已克隆的广谱持久抗瘟基因Pi9的DNA序列设计功能标记Clon2-1,通过分子标记辅助选择开展回交育种实践,定向改良水稻恢复系R288的稻瘟病抗性。获得如下结果:Clon2-1为共显性标记,在Pi9基因供体亲本75-1-127和受体亲本R288之间多态性明显且稳定;Clon2-1标记基因型对稻瘟病抗性表型的选择效率达100%。通过分子标记辅助选择和连续回交自交,获得了含Pi9基因的BC6F3群体,在此基础上筛选鉴定出1个高抗稻瘟病水稻新品系‘R288-Pi9’,用其与培矮64S配组获得的杂交组合同样表现出高水平稻瘟病抗性。