血清preS1水平与慢性乙型肝炎患者肝纤维化的关系及对癌变的诊断价值

目的分析血清乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)前S1蛋白(precursor S1 protein,preS1)与慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)肝纤维化及癌变进展的相关性。方法对2019年10月—2021年10月期间在青海红十字医院接受检查的228例乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性慢性HBV感染者进行回顾性分析,其中CHB患者75例、肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者93例(LC组)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者60例(HCC组)。根据LC和HCC组肝组织活检分析肝脏炎症活动及肝纤维化程度。结果HCC组血清preS1水平[496.32(457.63,988.0)ng/mL]和LC组[338.72(247.93,554.61)ng/mL]血清preS1水平均显著高于CHB组[113.69(87.09,177.40)ng/mL],且差异具有统计学意义(P均<0.05)。HCC组血清preS1水平亦高于LC组(P=0.002)。经受试者工作特征曲线分析,血清preS1水平鉴别诊断CHB与LC的曲线下面积(area under the curve,AUC)是0.881(95%CI:0.830~0.932),鉴别诊断CHB/LC与HCC的AUC是0.861(95%CI:0.815~0.908)。3组患者的血清preS1水平与HBsAg(rs=0.799,P<0.001)呈强正相关和Log HBV DNA(rs=0.262,P<0.001)呈弱正相关。此外LC组和HCC组血清preS1水平与肝脏炎症活动分级(rs=0.201,P=0.009)及肝纤维化分期也呈弱正相关性(rs=0.295,P<0.001)。结论血清preS1水平与血清HBsAg、HBV DNA水平和肝脏炎症和纤维化进展呈正相关,有可能成为鉴别诊断HBV相关慢性肝病肝硬化或癌变的候选标志物。

HBV-DNA含量升高患者血清PreS1抗原和其他标志物相关性分析

目的探讨乙肝病毒前S1抗原(PreS1)与HBV-DNA、HBV血清标志物(HBV-M)和ALT之间的相关性和临床应用价值。方法收集380例荧光定量PCR法检测HBV-DNA含量升高患者血清,用酶联免疫法(ELISA)检测乙肝病毒前S1抗原和HBV血清标志物、用速率法检测ALT。结果380例HBV-DNA含量升高乙肝患者中,PreS1的阳性率为84.6%,HBeAg阳性率为67.8%,两者比较差异有统计学意义(P<0.005);在各种模式HBV血清标志物中,HBeAg阳性组PreS1阳性率和ALT异常升高与HBeAg阴性组比较,差异有统计学意义(P<0.05);随着HBV-DNA含量的增加,HBeAg和PreS1的阳性率也增加,HBV-DNA拷贝数为5×102～1×105范围时,PreS1的阳性率高于HBeAg阳性率(P<0.005),当HBV-DNA拷贝数高于1×105时,HBeAg阳性率与PreS1阳性率相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论乙肝病毒前S1抗原和HBeAg两者阳性率与HBV-DNA含量密切关联,乙肝病毒前S1抗原检测可作为乙肝病毒复制、传染性及肝细胞损伤的指标,同时也可用于指导临床由于病毒变异和其他原因造成HBeAg阴性乙肝患者的诊断和治疗。

HBV Pre-S1蛋白及HBV-DNA含量检测在诊断乙肝病毒复制中的临床意义

目的:探讨乙肝患者不同血清学标志物模式(HBV-M)与乙肝病毒DNA含量及乙肝病毒前S1蛋白的关系,为预测乙型肝炎病毒的传染程度、预防、诊断及治疗提供实验室依据。方法:采用ELISA法对1385例携带不同血清学标志物的乙肝患者进行HBVPre-S1和乙肝5项指标检测,并用聚合酶链反应定量检测血清HBV-DNA含量。结果:不同HBV免疫模式中HBsAg、HBeAg和HBcAb同时阳性,其HBV-DNA和HBVPre-S1的检出率分别为90.7%和71.1%;HBsAg、HBeAb和HBcAb阳性组的检出率分别为35.8%和27.3%;其他不同血清学模式组也有不同的阳性率。结论:HBV-DNA、乙肝病毒5项标志和HBVPre-S1联合检测,对HBV感染早期诊断,了解病毒的复制情况,疗效观察和预后判断均具有重要意义。

Pre-S1Ag和Pre-S2Ag及HBV-LP在乙肝病毒筛查中的价值

目的:探讨乙肝病毒(HBV)前S1抗原(Pre-S1 Ag)、前S2抗原(Pre-S2 Ag)及乙肝大蛋白(HBV-LP)在乙肝病毒(HBV)筛查中的价值。方法:258例乙肝患者分为乙肝表面抗原(HBs Ag)携带组(n=182)及HBV DNA阳性组(n=76),另选100例健康体检者作为对照组;采用双抗体夹心(ELISA)法检测受检者血清Pre-S1Ag、Pre-S2 Ag及HBV-LP水平,比较Pre-S1 Ag、Pre-S2 Ag及HBV-LP筛查HBV的灵敏度和特异度,分析Pre-S1Ag、Pre-S2 Ag及HBV-LP对HBs Ag携带组3种血清学模式患者的HBV检出能力;采用线性回归法分析Pre-S1Ag、Pre-S2 Ag、HBV-LP与HBV DNA的相关性,推算3个指标的ABV病毒检出限。结果:Pre-S1 Ag、Pre-S2 Ag及HBV-LP应用于HBV筛查的特异度为99%～100%,但Pre-S2 Ag和HBV-LP筛查HBV的灵敏度显著高于Pre-S1 Ag(P <0. 01); HBe Ag阴性人群中(HBs Ag-HBeAb-HBcAb阳性和HBs Ag-HBcAb阳性模式)的Pre-S2 Ag、HBV-LP检出率均显著高于Pre-S1 Ag (P <0. 01); Pre-S1 Ag、Pre-S2 Ag及HBV-LP与HBV DNA正相关(r=0. 82、0. 76、0. 70,P <0. 01),Pre-S2 Ag、HBV-LP对HBV的检出限接近106IU/L,Pre-S1 Ag对HBV的检出限≥108IU/L。结论:Pre-S2 Ag、HBV-LP相较于Pre-S1 Ag具有更高的灵敏度和更低的检出限,更适合作为HBV筛查的血清标志物。

慢性乙肝患者血清HBV-LP和Pre S1-Ag与病毒复制状态的相关性

目的分析慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)患者乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)、前S1抗原(Pre S1-Ag)与病毒复制状态的相关性。方法采用回顾性研究,收集78例CHB患者血清标本,应用实时荧光定量聚合酶链反应测定血清乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA),根据样品定量水平计算阳性率;应用酶联免疫吸附试验法测定Pre S1-Ag、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗体(HBcAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(HBeAb)和HBV-LP阳性情况;分析HBV-DNA与HBV-LP、Pre S1-Ag的相关性。结果78例CHB患者Pre S1-Ag、HBV-LP和HBV-DNA阳性率分别为34.62%、70.51%、65.38%,差异有统计学意义(χ2=23.97,P<0.05)。比较CHB患者测定的二对半指标不同组合,HBeAg阴、阳性患者的Pre S1-Ag、HBV-LP和HBV-DNA阳性率差异均有统计学意义(P值均<0.05);HBcAb+HBsAg阳性、HBcAb+HBeAb+HBsAg阳性、HBcAb+HBeAg+HBsAg阳性患者的Pre S1-Ag和HBV-DNA阳性率比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05);HBeAg+HBsAg阳性、HBeAb+HBsAg阳性患者的Pre S1-Ag、HBV-LP和HBV-DNA阳性率比较,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。随着HBV-DNA载量的升高,HBV-LP和Pre S1-Ag吸光度值亦随之升高(P值均<0.05)。相关性分析显示,HBV-DNA载量与HBV-LP吸光度值呈现正相关关系(r=0.83,P<0.05),与Pre S1-Ag吸光度值呈现正相关关系(r=0.65,P<0.05)。结论CHB患者血清HBV-DNA、HBV-LP和Pre S1-Ag阳性率比较,存在显著差异,并且患者血清HBV-DNA载量与HBV-LP存在显著相关性,HBV-LP可作为HBV标志物的重要补充,用于评价患者病毒复制状态。

HBV Pre S1蛋白质在酵母细胞中具有转录激活功能

为探讨应用双杂交体系统克隆与HBVPreS1蛋白质结合的肝细胞受体的可行性，我们构建了HBVPreS1蛋白质与酵母GAL4DNAbindingdomain融合蛋白质酵母表达质粒。通过应用该质粒转化酵母菌株SFY526，检测报道基因产物五半乳糖苷酶活性，结果表明HBVPreS1蛋白质在酵母细胞中具有转录激活功能。能否去除PreS1蛋白质转录激活功能区域但却保留其与肝细胞受体的结合区域用于酵母双杂交体系统筛选肝细胞cDNA文库、克隆与PreS1蛋白质结合的肝细胞受体尚需进一步实验探讨。

慢性乙型肝炎患者血清HBV-LP、PreS1、HMGB1水平与HBV-DNA水平的相关性

目的:探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清病毒外膜大蛋白(HBV-LP)、前S1抗原(Pre S1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1水平与乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)水平的相关性。方法:选取2019年1月至2020年1月该院收治的519例CHB患者进行前瞻性研究,按照HBV-DNA载量不同分为低水平(HBV-DNA<10^(3)拷贝/mL)组185例、中水平(10^(3)~10^(7)拷贝/mL)组206例、高水平(>10^(7)拷贝/mL)组128例。比较三组肝功能指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)]、HBV-LP、PreS1、HMGB1水平,采用Pearson相关性分析ALT、AST、HBV-LP、PreS1、HMGB1水平与HBV-DNA水平的相关性。结果:低水平组ALT、AST水平低于中水平组、高水平组,且中水平组低于高水平组,差异均有统计学意义(P<0.05);三组HMGB1水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);低水平组HBV-LP、PreS1水平低于中水平组、高水平组,且中水平组低于高水平组,差异有统计学意义(P<0.05);Pearson相关分析结果显示,ALT、AST、HBV-LP、PreS1水平与HBV-DNA水平均呈正相关性(r>0,P<0.05)。结论:CHB患者HBV-LP、PreS1和HMGB1水平与HBV-DNA水平均呈正相关性。

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前 S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒 (HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376 7(GenBank号 :AF384 371)作为模板 ,应用PCR扩增前 S1蛋白编码基因片段 ,以常规的分子生物学技术构建表达载体 pcDNA3 1(- ) preS1,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空白表达载体pcDNA3 1(- )的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在 115 2个基因表达谱的筛选中 ,发现有 30个基因表达水平显著上调 ,38个基因表达水平显著下调。结论 前 S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活的相关基因

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白 (pre S1)反式激活的相关基因cDNA消减文库 ,克隆前 S1反式激活相关基因 ,以期发现前 S1蛋白反式激活作用的靶位点 ,为阐明前 S1蛋白的反式激活作用的分子生物学机制 ,以及HBV相关肝细胞癌 (HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向。方法 以HBV前 S1表达质粒pcDNA3 .1(-) preS1转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与pGEM Teasy载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌DH5α进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 67个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 5 1个 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。对所得片段测序 ,并进行同源性分析 ,获得 3 2种编码基因 ,其中 2 6个为已知功能基因 ,另外 6个为未知功能序列 ,可能是前 S1蛋白反式激活新的靶基因。结论 成功构建HBV前 S1反式激活的相关基因cDNA消减文库 ,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。为进一步阐明前

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白l基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白(pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法 以HBV前 S1蛋白表达质粒pcDNA3 .1(-) PreSl转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 Sl反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前Sl反式激活蛋白 1(PSlTPl) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6672。PSlTPl基因的编码序列全长为64 2个核苷酸 (nt) ,编码产物由 2 13个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HBV前 Sl蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明前 Sl蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的应答水平 ,引起病变。HBV前 Sl反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究

目的 :应用抑制性消减杂交 (SSH )技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前 S1蛋白 (pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 :以HBV前 S1蛋白表达质粒 pcDNA3 1( -) pre S1转染HepG2细胞 ,以空载体 pcDNA3 1( -)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 S1反式激活作用的新的靶基因。结果 :对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前 S1反式激活蛋白 2 (PS1TP2 ) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6673。PS1TP2基因的编码序列全长为 5 73个核苷酸 (nt) ,编码产物由 190个氨基酸残基 (aa)组成。结论 :HBV前 S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用 ,最近的研究表明前 S1蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。HBV前 S1反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前

乙型肝炎病毒前S1抗原/抗体检测及其临床意义

目的 探讨乙型肝炎病毒前S1蛋白与乙型肝炎病毒复制的关系及其在临床上的应用。方法 通过对 10 1例乙型肝炎患者血清进行“两对半”、HBV DNA和前S1蛋白的检测分析。结果 10 1例HBsAg阳性与HBV DNA同时阳性的血清 ,Presl检出率为 94 .1% ,HBeAg/Ab的阳性率分别为 5 8.4 %和 30 .7% ;78例preS1Ab阳性血清中 ,抗HBs阳性率为 4 7.4 % ,抗HBe阳性率为 2 8.2 %。结论 乙型肝炎病毒前S1蛋白表达主要在HBVDNA复制期 。

前S1蛋白在HBV指标中的重要意义

前S1蛋白是HBV衣壳蛋白的一部分 ,存在于大分子表面抗原蛋白之中 ,它是乙肝早期诊断的敏感指标 ,也反映了乙肝病毒的复制和乙肝病情的活动。本文研究显示 ,1 62例非乙肝病人血清中前S1蛋白全部阴性 ;31 1例乙肝患者中 ,前S1蛋白阳性率为 38 9% ,其中急性乙肝 93 8% ,慢性活动性肝炎 51 2 % ,在乙肝二对半检测模式中 ,大三阳中该指标阳性率 87 1 % ,小三阳为 32 1 %。以HBVDNA检测为标准 ,前S1蛋白的灵敏度为 94 1 % ,假阴性 5 9% ,总符合率 93 9%。

HBV前S1抗原与乙肝e系统及HBVDNA之间相关性探讨

目的探讨乙型肝炎病毒前S1抗原与乙肝e系统、HBVDNA之间的关系,评价其临床诊断意义。方法采用双抗体夹心ELISA法检测251例HBsAg阳性,61例HBsAg阴性的血清标本的前S1抗原,并和HBVDNA与HBV标志物检测结果作比较分析。结果HBsAg、HBeAg和Anti-HBc阳性者151例中,HBVDNA与前S1抗原的检出率分别为96.7%和87.4%,较好地反映病毒存在或复制情况;在HBsAg、Anti-HBe和Anti-HBc阳性者70例中,HBVDNA与前S1抗原的检出率分别为64.2%和58.6%,HBsAg和Anti-HBc阳性者30例,HBVDNA和前S1抗原的检出率分别为56.6%和30%,说明部分HBeAg阴性而Anti-HBe阳性或阴性患者仍存在着病毒复制。结论前S1抗原与HBeAg密切相关,前S1抗原检测可反映其体内HBV病毒的复制情况,具有一定的临床价值。

乙肝病毒外膜大蛋白、前S1抗原、HBV-DNA与血清标志物之间相关性分析

目的通过对乙型肝炎患者HBV-LP、Pre-S1抗原、HBV-DNA载量和乙型肝炎血清标志物的检测,探讨反映不同血清学类型患者体内病毒复制及抗病毒疗效监测的最佳指标以及分析各指标之间的关系。方法对864例HBV感染者及100例健康体检者血清采用ELISA法定性检测HBV-M;ELISA双抗体夹心法检测HBV-LP、Pre-S1;荧光定量PCR法检测HBV-DNA。结果 HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性模式组(大三阳)HBV-LP、Pre-S1及HBVDNA阳性率显著高于其它HBV-M模式组(P<0.05);HBV-LP与HBV-DNA的阳性率无显著差异(P>0.05),PreS1的阳性率明显低于HBV-LP与HBV-DNA的阳性率(P<0.05);HBV-DNA拷贝数与HBV-LP、Pre-S1平均A值具有明显的相关性(相关系数r=0.926),而与HBsAg定量值无明显相关性。结论 HBV-LP比Pre-S1试剂效果大大提高,且大蛋白的检出率与血液中病毒DNA的检出高度符合,对于判断病毒复制具有重要意义,可作为HBeAg及HBV-DNA的补充检测指标。

乙型肝炎患者血清前S1抗原与HBV的血清标志物的关系

目的分析前S1抗原与其他HBV血清标志物的关系,探讨其临床意义。方法收集HBsAg(+)血清标本214例,HBsAg(-)血清标本159例,采用ELISA和PCR方法对其标本373例进行血清前S1抗原、HBV-DNA和HBV血清标志物的检测,分析前S1抗原与HBeAg等血清标志物的关系。结果不同HBV血清标志物的标本前S1抗原和HBV-DNA的阳性率无显著差异(P>0.05)。在98例前S1抗原阳性标本中有91例HBV-DNA检测为阳性,而前S1抗原检测阴性的275例中,有209例HBV-DNA呈阴性。两种方法的符合率达79.6%。经卡方检验两种方法检测的结果存在显著相关性(P<0.01)。对前S1抗原和HBeAg检测结果的分析,HBeAg(+)标本中前S1抗原阳性率为85.2%,而HBeAg(-)标本中,前S1抗原阳性率仅为32.5%,前S1抗原与HBeAg也具有相关性。结论前S1抗原能够敏感地反映HBV复制情况,与HBeAg和HBV-DNA有很好的相关性。

化学发光技术检测乙肝前S1蛋白的临床价值

目的:采用化学发光技术检测乙肝前S1蛋白(pre-S1)和乙肝两对半,探讨乙肝pre-S1作为反映乙肝病毒感染、复制、传染性及肝细胞损伤指标的临床意义。方法:采用化学发光技术检测337例乙肝表面抗原阳性患者的血清乙肝两对半和pre-S1,比较不同乙肝两对半模式患者pre-S1的阳性率。结果:乙肝表面抗原的S/CO值高低与pre-S1有关,乙肝表面抗原S/CO值越高,pre-S1的阳性率越高,不同两对半模式pre-S1阳性率不同,其中以"大三阳"[HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)]的阳性率最高(93.3%)。乙肝e抗原与pre-S1结果差异有显著性(P<0.01)。结论:化学发光技术检测前S蛋白能较早以及较准确地反映乙肝病毒复制的情况,对于条件不适合做乙肝病毒DNA的实验室,pre-S1是乙肝两对半的补充。

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究

目的克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5的cDNA,并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术以HepG2细胞的cDNA为模板扩增PS1TP5,以pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA,通过PCR、限制性酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学技术初步分析其物理化学性质、蛋白质结构和功能。结果PCR成功扩增出PS1TP5基因,并将其分别克隆进pGEM-T和pcDNATM3.1/myc-HisA载体,经PCR、限制性酶切鉴定后测序证实。因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白5(PS1TP5),已在GenBank中注册,注册号AY427953。生物信息学分析确定其ORF为438个核苷酸(nt),编码产物为145个氨基酸残基(aa)。结论发现了HBV前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5,构建了pcDNATM3.1/myc-HisA真核表达载体,为进一步研究其生物学功能及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5的筛选克隆与重组蛋白诱导表达

目的克隆人类乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因PS1TP5。构建其原核表达载体,并诱导其在大肠埃希菌中表达。方法以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)作为平行对照,提取mRNA进行抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术分析,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选得到人类新基因PS1TP5。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得PS1TP5基因片段,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化进BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得了PS1TP5重组蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析证实表达蛋白的特异性。结果成功扩增出PS1TP5基因。并将其插入pET-32a(+)原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了PS1TP5重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论应用SSH、RT-PCR与生物信息学技术筛选克隆出PS1TP5基因,构建了pET-32a(+)-PS1TP5原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a(+)-PS1TP5重组蛋白的表达。为进一步研究PS1TP5免疫原性及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选PS1TP5反式激活相关基因

目的构建乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5(PS1TP5)的反式激活相关基因差异表达的cDNA,克隆PS1TP5蛋白反式激活相关基因。方法以PS1TP5表达质粒pcDNA3.1(-)-myc-his(A)-PS1TP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建人PS1TP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到70个200～1 000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得24种编码基因,其中1个为未知功能的新基因,电子拼接后命名为HBV PS1TP5TP1(乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5反式激活蛋白1),GenBank注册号DQ487761。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。PS1TP5与人类免疫调节、物质代谢、信号转导、肝纤维化形成、肿瘤发生发展有密切关系。为进一步研究HBV前-S1蛋白的功能提供了新的线索。