基于Pyk2通路探讨加味四君子汤对阿霉素肾病大鼠的作用

目的基于Pyk2通路探讨加味四君子汤对阿霉素肾病大鼠的作用。方法将实验用SD大鼠30只采用随机数字表法分为正常组、模型组及中药组,诱导阿霉素肾病大鼠模型。中药组在阿霉素注射后第7天予中药灌胃,正常组和模型组予等量生理盐水灌胃。实验的第7、21、35天分别检测各组24 h尿蛋白定量及电镜下观察大鼠肾组织;检测各组肾组织中Nephrin、Nephrin m RNA、Pyk2 m RNA、Pyk2、Pyk2磷酸化蛋白水平(p Pyk2)及p Pyk2/Pyk2比值。结果 (1)24 h尿蛋白定量:模型组较正常组明显升高(P<0.01),中药组较模型组降低(P<0.05)。(2)Nephrin及Nephrin m RNA水平:第21、35天,模型组较正常组均明显减少(P<0.01),中药组较模型组增高(P<0.05)。(3)Pyk2 m RNA水平:第21、35天,模型组和中药组比正常组均升高(P<0.05),但第35天,中药组比模型组明显减少(P<0.01)。(4)p Pyk2、p Pyk2/Pyk2比值:第21、35天,模型组较正常组均有上升(P<0.05和<0.01),而中药组比模型组均有降低(P<0.01)。结论阿霉素可通过损伤足细胞,抑制Nephrin蛋白,激活Pyk2蛋白磷酸化引起肾病综合症的发生;加味四君子汤可抑制阿霉素肾病大鼠肾组织中Pyk2激活,上调Nephrin蛋白水平,改善肾组织足突病变,减少尿蛋白,进而保护肾小球的滤过屏障作用。

Pyk2在胃癌组织中的表达及其意义

目的:研究Pyk2(proline richtyrosinekinase 2)在正常胃黏膜组织与胃癌组织中表达的差异, 探讨其意义。方法:应用免疫组织化学的方法检测59例正常胃黏膜组织标本和52例胃癌组织标本中Pyk2的表达情况。结果:免疫组织化学结果显示,Pyk2在正常胃黏膜组织中的表达阳性率为86. 44% (51 /59),在胃癌组织中表达阳性率为19. 23% (10 /52),两者差异具有统计学意义(P<0. 05);在高分化胃癌中表达阳性率为47. 37% (9 /19),而在中、低分化胃癌中表达阳性率为3. 03% (1 /33),两者差异具有统计学意义(P<0. 05 )。Pyk2表达阳性率在不同TNM分期胃癌中分别为:Ⅰ期66. 67% (6 /9),Ⅱ期30% (3 /10),Ⅲ期3. 45% (1 /29),Ⅳ期0% (0 /4),差异具有统计学意义[ (Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)νⅠ,χ2 =15 767,P<0. 05) ]。结论:本研究观察到Pyk2在正常胃黏膜组织中有表达,在胃癌组织中低表达或几乎无表达,并且其表达随着胃癌恶性度和TNM分期的增加而逐渐降低。提示Pyk2可能在胃癌的发生、发展过程中起重要作用。

连续性血液净化对重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤患者PYK2信号转导途径的影响

目的观察连续性血液净化(continuous blood purification,CBP)治疗对重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤患者外周血单个核细胞富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase2,PYK2)信号通路活化的影响,探讨CBP治疗重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤的作用机制。方法选取深圳市宝安区人民医院肾内科、风湿免疫科和重症医学科2012年1月~2016年4月收治的重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤48例,将其随机分为观察组和对照组各24例,2组均给予常规治疗,观察组在常规治疗基础上给予CBP治疗,对照组在常规治疗基础上给予间歇性血液净化(intermittent hemodialysis,IHD)治疗。比较2组患者治疗前后系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)、血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(serum creatinine,SCr)水平及治疗有效率。Western-blotting测定治疗前、治疗后7天、14天、30天患者外周血单个核细胞磷酸化PYK2蛋白(phosphorylation-PYK2,p-PYK2)的表达,流式细胞术测定共刺激分子CD40L和CTLA4蛋白的表达。结果治疗30天后,与对照组相比,观察组患者SLEDAI(3.4±2.8比7.7±2.3,t=2.334,P=0.023)、BUN(6.4±3.8比16.7±5.3,t=3.930,P<0.001)、SCr(86.2±17.3比127.1±31.2,t=2.482,P=0.016)明显降低,差异有统计学意义;治疗后观察组有效率为91.7%,高于对照组的58.3%,差异有统计学意义(χ~2=4.552,P=0.013);治疗30天后,与对照组比较,观察组p-PYK2(0.732±0.206比1.110±0.152,t=3.196,P=0.007)、CD40L(9.4%比18.6%,χ~2=3.516,P=0.027)、CTLA4(7.2%比6.3%,χ~2=3.950,P=0.018)蛋白的表达明显降低,差异有统计学意义。结论 CBP对重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤治疗效果明显,可以抑制患者外周血单个核细胞PYK2信号通路活化,重建机体免疫系统内稳状态,阻止肾脏病变的进一步发展,及时逆转肾功能。

Pyk2、CXCR_1在COPD大鼠气道炎症反应中的表达及意义

目的:探讨脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)、化学趋化因子受体1 (CXCR_1)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气道炎症反应中的表达及意义.方法:SD大鼠随机分为正常组和模型组,模型组以气管内注入内毒素脂多糖(LPS)联合烟熏构建COPD大鼠模型,利用光学显微镜观察模型组与正常组大鼠肺组织病理结构差别;ARMS-实时荧光定量PCR检测Pyk2、CXCR_1m RNA表达水平; Western blot检测肺组织中Pyk2、CXCR_1蛋白水平.结果:(1)与模型组比较,正常组大鼠肺组织炎症细胞浸润较少,肺泡壁结构正常.模型组肺组织部分纤维化,大量炎症细胞尤以巨噬细胞为主,充斥于肺泡腔.(2)正常组Pyk2、CXCR_1m RNA表达水平较模型组低,其表达丰度分别为模型组的0. 099、0. 614.(3)正常组Pyk2、CXCR_1蛋白表达较模型组减少.结论:Pyk2、CXCR_1在COPD大鼠中呈高表达状态,提示两者在COPD大鼠气道炎症反应机制中扮演重要角色.

CRISPR/Cas9敲除pyk2基因对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

为了探讨富含脯氨酸的酪氨酸激酶(proline rich tyrosine kinase2,Pyk2)对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响,设计了2对以pyk2为靶基因的sgRNA片段,以px335质粒为载体,构建CRISPR/Cas9重组质粒,转染至人脑胶质瘤U251细胞中,同时设置野生型U251细胞作为对照组。通过酶切鉴定及Western blot分析筛选阳性单克隆细胞,并测序揭示突变位点。筛选出的阳性单克隆细胞作为实验组,经RTCA法比较后,发现实验组细胞的增殖能力较对照组明显下降,且具有统计学意义(P<0.05);Transwell小室法及划痕实验的结果均证实,较对照组,实验组细胞的体外侵袭及迁移能力受到明显的抑制,差异显著(P<0.05)。作为验证侵袭能力的代表,基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)在Western blot实验中表达量较对照组也明显下降。通过上述方法成功得到目的基因敲除的稳定细胞株,并证实敲除pyk2基因能明显的抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

PYK2靶向短发夹RNA干扰重组体的构建及鉴定

目的:本研究利用RNA干扰技术,以PYK2为靶基因,设计构建重组体,并对重组体进行鉴定,为下一步探索心肌纤维化机制的新途径奠定基础。方法:设计有小发夹结构的8条DNA序列,经退火成互补4对双链,再克隆到载体PAVU6+27中构建重组体,转化入JM109菌株,提取质粒进行酶切鉴定、测序分析。结果:酶切鉴定和测序分析均提示PYK2靶向RNA干扰重组体的构建成功。结论:PYK2靶向RNA干扰重组体的成功构建,为下一步利用该重组体沉默心脏成纤维细胞中PYK2基因的表达,探索心肌纤维化机制打下基础。

Pyk2介导的细胞信号转导在两肾一夹肾性高血压大鼠心肌肥大时的变化

目的 以两肾一夹肾性高血压大鼠为模型,研究心肌中富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2 )介导的细胞信号转导的变化及其意义。方法 ①制备两肾一夹肾性高血压大鼠模型(RHR) ;②分别于术后第1、4、8和12周测动脉血压和心肌肥厚指数;③免疫印迹法检测心肌组织中Pyk2及其磷酸化表达。结果 大鼠肾动脉狭窄术后4周心肌肥大已发生,8周至12周心肌肥大进一步加重;术后4周、8周、12周大鼠心肌组织Pyk2活性逐渐增加,心肌Pyk2活性与心肌肥大程度呈显著正相关。结论 Pyk2及磷酸化在RHR心肌组织内表达增高,且与心肌肥厚同步,提示其参与心肌肥厚的发生及发展。

大鼠脑缺血后神经元中PYK2及p38MAPK的活化及其意义

目的 观察大鼠局部脑缺血后缺血区神经元中PYK2及p38MAPK的表达并探讨其意义。方法 建立大鼠局部脑缺血模型,在缺血后15、30和60min时处死大鼠,采用免疫组化方法观察大鼠缺血区神经元中PYK2及p38MAPK的表达变化。结果 正常大鼠皮层仅有微量活化型PYK2和活化型p38MAPK表达。缺血15min后,皮层神经元可见活化型PYK2强免疫阳性标记,这些有活化型PYK2表达的神经元亦呈p38MAPK免疫阳性。缺血区神经元中活化型PYK2和活化型p38MAPK免疫标记在缺血30min时达到最强,60min时开始减退。结论 缺血可以诱发神经元中PYK2活化,既而通过p38MAPK信号转导通路介导神经元对缺血的应急反应。

Pyk2在破骨细胞发挥功能活性中的作用及其机制研究进展

Pyk2（Proline—rich tyrosine kinase2）是一种富含脯氨酸的非受体酪氨酸蛋白激酶；又称细胞粘附激酶β（Cellad—hesion kinase β，CAKβ），相关粘着斑酪氨酸激酶（Relatedad—hesion focal tyrosine kinase，RAFTK），Ca^2＋依赖性酪氨酸激酶（Calcium-dependent tyrosine kinase，CADTK）或粘着斑激酶2（Focal Adhesion kinase 2，FAK2），是粘着斑激酶家族的成员，在破骨细胞高表达，参与细胞和基质成分粘附介导的信号转导。

Pyk2介导的细胞信号通路

酪氨酸蛋白激酶在细胞信号传递过程中起重要作用,由酪氨酸蛋白磷酸酶和酪氨酸蛋白激酶协同控制的酪氨酸的磷酸化是细胞生长、分化、凋亡、黏附和迁移等生理过程的重要调节机制。酪氨酸蛋白激酶Pyk2是黏着斑激酶家族成员,能被包括整合素在内的多种细胞外信号激活,参与多条信号通路的传递,在细胞信号转导过程中发挥重要作用。

两性绵霉线粒体中存在丙酮酸激酶?另一种丙酮酸激酶基因(pyk2)的克隆及序列分析

在藻状菌纲两性绵霉 (Achlyabisexualis)的cDNA文库中筛选并克隆了另外一种类型的丙酮酸激酶基因pyk2 ,完成了这种基因的全序列测定 .将这种这种基因编码的丙酮酸激酶PYK2与前文报道的两性绵霉丙酮酸激酶PYK1氨基酸序列进行比较 ,显示二者有 4 0 8%同源性 .用PSORTII计算机程序分析表明 ,与存在于细胞质中的PYK1不同 ,PYK2的N端带有线粒体的导肽序列 ,因而可能位于线粒体中 .结合有关光合生物硅藻一些糖酵解酶位于线粒体的报道 ,认为不论是光合还是非光合的原生生物的线粒体中都可能存在有糖酵解酶 .

脑星形细胞肿瘤中FAK、Pyk2表达及其与血管生成的关系

背景与目的:非受体酪氨酸蛋白激酶家族成员FAK和Pyk2具有高度同源性,对肿瘤细胞增殖和侵袭具有重要的调控作用,但其是否参与肿瘤血管生成过程尚不明确。本研究旨在探讨FAK和Pyk2在脑星形细胞肿瘤中表达与血管生成的关系。方法:应用免疫组化法检测58例脑星形细胞肿瘤中FAK、Pyk2和血管内皮生长因子(VEGF)表达,并用CD31标记计数瘤内微血管密度。结果:FAK、Pyk2蛋白主要表达于肿瘤细胞胞浆,Pyk2阳性表达也见于肿瘤血管内皮细胞。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级星形细胞肿瘤中,FAK阳性率分别为20.0%(1/5)、26.7%(4/15)、44.4%(8/18)、50.0%(10/20),Pyk2阳性率分别为40.0%(2/5)、60.0%(9/15)、77.8%(14/18)、85.0%(17/20);FAK和Pyk2阳性表达强度评分在Ⅱ级星形细胞肿瘤与Ⅲ、Ⅳ级星形细胞肿瘤中具有显著差异性(P<0.05)。FAK、Pyk2表达与VEGF和微血管密度呈正相关,相关系数分别为rs=0.423(P=0.001)和rs=0.729(P<0.005)。结论:FAK、Pyk2可能通过与VEGF的相互作用而参与脑星形细胞肿瘤的血管生成过程。

Pyk2激酶区基因重组杆状病毒表达载体的构建及表达

采用PT-PCR扩增Pyk2-kinase基因,定向克隆至转移载体pFastBac HTB,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,转座后利用抗性及蓝白斑筛选阳性克隆获得重组Bacmid/Pyk2-kinase;提取重组杆粒,PCR法鉴定后转染昆虫细胞Sf9包装重组杆状病毒;利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot检测表达情况。最终获得了重组杆状病毒rBac-Pyk2-kinase,实现了Pyk2-kinase在Sf9细胞中的重组表达,其相对分子质量为32 ku,IFA、SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致。

PYK2在海人酸癫痫大鼠海马神经元及小胶质细胞中的表达变化

目的观察海人酸癫痫大鼠海马内神经元和小胶质细胞中PYK2的表达并探讨其意义。方法建立海人酸大鼠癫痫模型,大鼠癫痫发作后8、24、72h后处死大鼠,采用免疫组化方法观察大鼠海马内小胶质细胞的活化状况,以及海马神经元和活化后小胶质细胞中PYK2的表达变化。结果与正常大鼠相比,癫痫大鼠中PYK2的表达在癫痫发作8h后急剧下降,并随时间推移继续下降。癫痫发作24h后,海马中出现大量呈阿米巴形状、强烈表达活化型PYK2的活化型小胶质细胞;癫痫后72h,海马中出现大量有活化型PYK2强表达的“杆”状活化型小胶质细胞。结论癫痫可致海马神经元及小胶质细胞PYK2表达变化;小胶质细胞中活化型PYK2的表达可能与小胶质细胞活化有关。

RNA干扰抑制pyk2表达对大肠癌细胞凋亡和增殖的影响

目的探讨富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2(proline-rich tyrosin kinase-2,pyk2)对Lovo大肠癌细胞凋亡和增殖的影响。方法利用两组构建有pyk2 shRNA(短发夹RNA,会在细胞内顺序反应而产生siRNAs)的质粒载体瞬时转染Lovo细胞系,设立空白对照组和阴性对照组,应用PCR和western blot方法检测转染组和对照组细胞中pyk2 mRNA与蛋白表达水平的变化,通过细胞计数法来绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术(FCM)检测转染组与对照组细胞在凋亡和细胞周期S期分布的差异。结果转染pyk2shRNA质粒的Lovo细胞凋亡水平明显低于对照组,S期细胞数显著增多,细胞绝对数增加,生长更加活跃。结论 pyk2能够升高Lovo大肠癌细胞的凋亡水平,降低其增殖水平。

Pyk2在细胞功能活性调控中的作用

Pyk2,即粘着斑激酶家族新成员,与FAK具有高度同源性,广泛表达于多种组织和细胞,主要通过受外界一系列因素的刺激并依赖于Ca2＋浓度的变化将胞外信号传导到胞内,从而发挥生物学效应。同时催化多种含SH2和SH3结构域的底物磷酸化,进一步参与细胞骨架的重组、细胞粘附、生长、迁移、增殖、分化、细胞凋亡及基因转录等各项功能活性的调控。

富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）介导离子霉素诱导的神经递质释放

目的富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2,Pyk2）属于非受体型酪氨酸蛋白激酶,其虽在中枢神经系统中高表达,但甚少见其功能的相关报道.Pyk2可被细胞内升高的Ca2＋激活,而细胞内Ca2＋浓度升高可触发突触前膜的神经递质释放,但Pyk2是否参与中枢神经系统中突触前膜的神经递质释放过程并不清楚.因此本研究旨在探索Pyk2在神经递质释放中的作用.方法该研究采用钙离子载体离子霉素诱导大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12细胞）Ca2＋浓度升高,进而触发多巴胺（DA）释放及Pyk2的激活.并采用Pyk2siRNA干扰内源性Pyk2表达,构建Pyk2各磷酸化位点的突变体观察其对递质释放的影响.结果Ca2＋引起的Pyk2磷酸化与PC12细胞释放多巴胺具有时间同步性,提示其可能参与了神经递质释放过程.采用Pyk2siRNA干扰内源性Pyk2表达后可明显抑制Ca2＋诱发的PC12细胞DA释放,表明Pyk2在Ca2＋介导的DA释放过程中具有重要的作用.进一步的研究发现Pyk2的磷酸化改变具有位点特异性,即仅402位酪氨酸发生明显磷酸化改变,我们采用Y402位点特异性磷酸化抗体发现Pyk2时间依赖性的改变来源于其Y402位点的磷酸化改变,而过表达Pyk2Y402F突变体可明显抑制Ca2＋浓度升高诱导的DA释放.结论上述实验结果表明Pyk2Y402位点磷酸化在离子霉素诱导的多巴胺释放中发挥了重要作用.提示我们对其有效调控可能是治疗神经递质释放紊乱的有效途径.

携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达

目的:构建重组质粒PGCsi-Pyk2shRNA,并检测所引起的Pyk2mRNA和蛋白在Lovo结肠癌细胞系中的表达.方法:设计合成3对Pky2基因shRNA序列,形成双链后将其依次连入带有U6启动子并含有潮霉素B的pGCsi空载体,构建成能产生Pyk2短发卡RNA的质粒;采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列;脂质体介导重组质粒pGCsi-Pyk2shRNA稳定转染Lovo细胞系并通过潮霉素B筛选,获得比较单一的转染细胞;分别采用RT-PCR、Westernblot等检测转染前后Pyk2的水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pGCsi-Pyk2shRNA构建无误;绿色荧光照相及PCR表明质粒转染成功;RT-PCR和Westernblot均表明,与转染空质粒PGCsi组和转染仅含免疫荧光基因组细胞相比,转染重组表达质粒pGCsi-Pyk2shRNA细胞中Pyk2mRNA及蛋白表达水平均明显降低.结论:成功构建重组质粒pGCsi-Pyk2shRNA,并证明他能降低Pyk2在Lovo细胞株系中的表达,为进一步研究Pyk2如何调控Hic-5/ARA55,Paxillion等下游靶基因的表达和参与结肠癌表观遗传学发生机制奠定了基础.

非肌层浸润性膀胱癌患者Pyk2蛋白阳性表达情况与其预后的关系探讨

目的分析富含脯氨酸蛋白酪氨酸激酶2(Pyk2)蛋白在非肌层浸润性膀胱癌患者中阳性表达情况及对预后评估能力。方法将我院于2017年9月至2019年6月收治的78例膀胱癌患者列为研究对象,以回顾性研究方式分析其临床资料,统计Pyk2阳性占比,分析Pyk2与临床常规资料之间的相关性,随访2年后分析Pyk2与预后转归间的相关性。结果75.64%患者检出Pyk2蛋白阳性,Pyk2高表达与肿瘤分期、分化程度有密切关联(P<0.05);Pyk2阳性组患者肿瘤复发率高于阴性组,且总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)等预后指标均低于阴性组(P<0.05)。结论非肌层浸润性膀胱癌患者Pyk2蛋白呈阳性,该蛋白表达情况与肿瘤恶变程度、分化程度等存在关联,且对预后有一定指导意义,有较大的临床应用意义。

Pyk2促进血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌细胞肥大

目的探讨富含脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠心肌细胞肥大的作用及其机制。方法提取大鼠乳鼠原代心肌细胞,随机分为对照组、AngⅡ诱导组(AngⅡ剂量为100 nmol/L,将其加入心肌细胞培养皿中刺激24 h)、Pyk2抑制剂PF-431396组(PF-431396剂量为10μmol/L,在AngⅡ刺激前30 min加入心肌细胞培养皿中)以及PF-431396干预AngⅡ诱导组(AngⅡ剂量为100 nmol/L,PF-431396剂量为10μmol/L)。用细胞骨架蛋白(α-actinin)免疫荧光染色检测心肌细胞表面积大小;real-time PCR检测心肌细胞中肥大指标(ANP和β-MHC) mRNA表达;Western blot检测心肌细胞p-Pyk2、Pyk2以及p53的蛋白表达。结果在AngⅡ刺激下,心肌细胞表面积增大(P<0. 05)、肥大指标的mRNA水平升高(P<0. 05)、p-Pyk2和p53的蛋白水平增加(P<0. 05);而加入Pyk2抑制剂PF-431396后,心肌肥大指标明显改善,p-Pyk2和p53的蛋白表达降低(P<0. 05)。结论 Pyk2通过p53信号通路促进AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大。