基于HPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS整合网络药理学研究衢枳壳降糖的物质基础及作用机制

目的以入血成分为研究对象,基于网络药理学探究衢枳壳对糖尿病起效的物质基础及作用机制。方法采用高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(high-performance liquid chromatography tandem quadrupole-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry,HPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS)对衢枳壳入血成分进行鉴定,在此基础上通过Swiss Target Prediction与SuperPred数据库预测入血成分作用靶点,同时在OMIM,GeneCards等数据库获取糖尿病靶点。采用Cytoscape 3.9.1绘制中药衢枳壳“活性成分-靶点-疾病”网络关系图,利用String数据分析平台进行蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络分析,筛选关键靶点。通过DAVID数据库对关键靶点进行基因本体功能(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。应用Autodock 1.5.7软件进行分子对接验证。结果共鉴定衢枳壳入血成分20个,筛选出潜在靶点170个,核心靶点32个。GO功能富集和KEGG信号通路分析结果显示缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1信号通路、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)-晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信号通路、表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路、癌症蛋白聚糖通路等为衢枳壳降糖的关键通路,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC serine/threonine-protein kinase,AKT)1、白蛋白(albumin,ALB)、细胞肿瘤抗原p53(cellular tumor antigenp 53,TP53)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、EGFR为其中关键靶点,且衢枳壳中5个活性成分与核心靶点经分子对接后的结合活性较好。结论衢枳壳中的芦丁、新橙皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素等可能为衢枳壳降糖的物质基础,可能是通过调控HIF-1、AGE-RAGE、EGFR等信号通路及AKT1、ALB、TP53等核心基因发挥降糖作用。

气相色谱-串联质谱法同时测定衢枳壳中多种农药残留

采用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)建立了一种快速测定衢枳壳中224种农药残留的方法。样品经乙腈提取和分散固相萃取净化后,在多反应监测(MRM)模式下进行GC-MS/MS分析,内标法定量。在优化实验条件下,224种农药均在0.01~0.50 mg/L范围内线性关系良好,方法检出限(LOD)为0.01 mg/kg;在0.02 mg/kg、0.05 mg/kg和0.10 mg/kg 3个水平下进行加标试验,在0.10 mg/kg添加水平,224种农药的回收率为53.06%~100.56%,相对标准偏差(RSD)在5.03%~16.79%;在0.05 mg/kg添加水平,除禾草敌等12种农药外,其余212种农药的回收率为50.56%~104.44%,RSD在3.90%~19.17%;在0.02 mg/kg添加水平,除敌敌畏等41种农药外,其余183种农药的回收率为34.72%~112.50%,RSD在6.27%~26.70%。该方法适用于衢枳壳中多种农药残留的快速筛查和确证。

HPLC法同时测定不同采集地衢枳壳中12种黄酮类成分的含量

目的:建立同时测定衢枳壳中12种黄酮类成分含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent Extend C18,流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液(梯度洗脱),流速为1.0 mL/min,柱温为35℃,检测波长为330 nm,进样量为10μL。测定不同采集地的10批衢枳壳样品中12种黄酮类成分(圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、木犀草素、橙皮内酯、川陈皮素、桔皮素、橙皮油内酯)的含量。结果:圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、木犀草素、橙皮内酯、川陈皮素、桔皮素、橙皮油内酯检测的质量浓度线性范围分别为1.65~16.51、4.50~45.02、35.41~354.12、4.11~41.12、2.29~22.86、34.96~349.56、1.42~14.15、1.50~15.04、1.83~18.28、1.51~15.08、1.61~16.12、1.28~12.84μg/mL(r均大于0.999 7);检测限分别为0.165 1、0.450 2、3.541 2、0.411 2、0.228 6、3.495 6、0.141 5、0.150 4、0.182 8、0.150 8、0.161 2、0.128 4μg/mL;定量限分别为0.547 8、1.487 4、11.663 3、1.360 3、0.758 3、11.594 9、0.466 3、0.497 1、0.601 2、0.499 9、0.532 3、0.424 6μg/mL;精密度(n=6)、重复性(n=6)、稳定性(24 h,n=7)试验的RSD均小于3%;平均加样回收率分别为99.50%、99.61%、98.18%、98.85%、98.48%、98.50%、98.25%、99.91%、103.13%、98.82%、98.44%、100.29%(RSD=1.49%~2.38%,n=6)。10批不同采集地衢枳壳样品中,上述12个成分的含量分别为1.995 5~2.648 8、4.317 7~5.005 1、33.215 5~34.054 6、3.140 4~3.471 5、3.221 2~3.748 8、42.746 6~44.026 6、0.202 7~0.239 4、0.191 2~0.208 8、0.080 3~0.097 9、0.291 9~0.307 1、0.119 9~0.149 1、0.082 7~0.089 8 mg/g。结论:建立的含量测定方法准确、可靠、简便、高效,可用于同时测定衢枳壳中12个黄酮类成分的含量,并为衢枳壳质量控制标准的建立提供了参考依据。

高效液相色谱法测定衢枳壳中新橙皮苷及柚皮苷

采用高效液相色谱法测定衢枳壳中新橙皮苷及柚皮苷含量。色谱柱为Waters Symmetry C18 (250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(体积比为20∶80);检测波长为283 nm;流速:1.0 m L/min。新橙皮苷和柚皮苷分别在0.191μg/mL～3.056μg/mL和0.195μg/mL～3.120μg/mL范围内呈良好的线性关系,其平均回收率分别为95.8%和96.1%,RSD分别为2.1%和2.0%。新橙皮苷和柚皮苷的平均回收率分别为95.8%和96.1%。

衢枳壳黄酮组分抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症反应的作用机制研究

目的:研究衢枳壳黄酮组分(the flavonoids from Quzhiqiao,TFQ)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的RAW264. 7细胞的抗炎作用机制。方法:LPS(1 mg·L^-1)诱导RAW264. 7细胞建立细胞炎症模型。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度TFQ对RAW264.7细胞活性的影响,RT-PCR法检测细胞炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1β(IL-1β) mRNA表达情况,Western blot法和免疫荧光法分别检测细胞核因子-κB(NF-κB p65)表达情况和入核情况。结果:TFQ在10~100 mg·L^-1时,对RAW264. 7细胞活性无影响。RT-PCR结果表明,TFQ能够降低LPS诱导的RAW264. 7细胞炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达,以TFQ 100 mg·L^-1作用显著(P <0. 05);Western blot法和免疫荧光结果表明,TFQ能够显著抑制p65蛋白表达与入核。结论:TFQ具有抑制LPS诱导的RAW264. 7细胞炎症反应的作用,其机制可能与抑制p65活化减少炎性因子表达有关。

衢枳壳与其他三大主产区枳壳对功能性消化不良大鼠理气作用的比较研究

目的:比较衢枳壳与其他三大主产区枳壳对功能性消化不良(FD)模型大鼠理气作用的差异。方法:56只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组、衢枳壳组、江枳壳组、川枳壳组、湘枳壳组,每组8只。“不规则喂养法结合夹尾刺激法”复制FD模型,连续给药14 d,观察记录各组大鼠一般状态、24 h代谢值变化;末次给药后禁食12 h,用半固体营养糊法检测各组大鼠小肠推进率和胃残留率;酶联免疫法(ELISA)检测血浆胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、生长抑素(SS)含量。HE染色观察胃窦组织病理学改变。结果:与正常组比较,模型组大鼠的体质量、24 h饮水量与摄食量、胃排空率及小肠推进率、血浆GAS、MTL含量明显降低,SS含量明显升高。与模型组比较,经4组枳壳干预后,各给组大鼠的体质量、24 h饮水量与摄食量、胃排空率及小肠推进率、血浆GAS、MTL含量明显升高,SS含量明显降低。与衢枳壳组相比,江枳壳组、川枳壳组与湘枳壳组大鼠胃排空率与小肠推进率显著降低(P<0.05或P<0.01),其他指标比较均无显著性差异(P>0.05)。结论:四个主产区枳壳对FD模型大鼠均有理气作用,衢枳壳对FD模型大鼠的理气作用优于江枳壳、川枳壳和湘枳壳,江枳壳、川枳壳和湘枳壳对FD模型大鼠的理气作用无显著性差异。

常山县不同区域衢枳壳中柚皮苷、新橙皮苷含量分析

利用高效液相色谱法检测衢枳壳中柚皮苷、新橙皮苷的含量,并对常山县4个乡镇衢枳壳中的柚皮苷、新橙皮苷含量进行了对比研究。结果表明,整个7月期间果皮尚绿时采摘制成的的衢枳壳中柚皮苷、新橙皮苷均能达到《浙江省中药炮制规范》的要求,且7月中上旬采收、干燥后果径小于4.5 cm的衢枳壳质量更佳,常山4个衢枳壳产地的药材质量均较好,无明显差异。

QuEChERS-气相色谱-串联质谱法快速测定衢枳壳中33种农药和代谢物残留

目的建立气相色谱-串联质谱法(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)同时测定衢枳壳中33种农药和代谢物残留的分析方法。方法样品经改良的QuEChERS方法提取净化后,在多反应监测模式下进行GC-MS/MS分析,内标法定量。结果在优化实验条件下,33种测定物质均在0.01~0.50 mg/L范围内线性关系良好,方法定量限为0.01~0.10 mg/kg;在1.0倍、2.5倍和5.0倍定量限加标水平下,除内吸磷-O和内吸磷-S之外,其他农药和代谢物平均回收率均大于63%,相对标准偏差小于16%。结论该方法样品前处理简单、快速,检测结果准确,适用于衢枳壳中多种禁用农药残留的快速筛查和确证。

衢枳壳不同组分体外降糖活性研究及4种黄酮组分含量分析

目的研究衢枳壳不同极性组分体外降糖活性,并明确各组分中4种黄酮类化合物的含量。方法采用系统溶剂法提取与分离衢枳壳中不同极性的黄酮组分,通过体外试验明确各组分对α-葡萄糖苷酶活性和HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。采用Agilent Zorbax SB C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.02%磷酸水溶液(20︰80)为流动相,流速1.0 mL·min^(-1),检测波长280 nm,柱温35℃,外标法测定衢枳壳各组分中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。结果衢枳壳各组分均具有α-葡萄糖苷酶抑制作用,抑制强弱顺序为正丁醇组分[IC_(50):(0.033±0.010)mg·mL^(-1)]>甲醇组分[IC_(50):(0.092±0.006)mg·mL^(-1)]>乙酸乙酯组分[IC_(50):(0.170±0.014)mg·mL^(-1)]>氯仿组分[IC_(50):(0.509±0.070)mg·mL^(-1)];衢枳壳甲醇组分和正丁醇组分能够显著促进HepG2细胞葡萄糖的消耗,差异具有统计学意义(P<0.05)。含量测定方法经方法学认证,各项参数均符合要求。经分析发现:衢枳壳各组分中均含有芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等黄酮类化合物,且正丁醇组分中各黄酮成分含量最高。结论衢枳壳各组分均具有α-葡萄糖苷酶抑制作用,且随着各组分中黄酮类化合物含量增高作用增强。同时,含有较高黄酮类组分含量的衢枳壳组分具有促进HepG2细胞葡萄糖消耗的作用,如甲醇、正丁醇和乙酸乙酯组分。

衢枳壳总黄酮通过NF-κB信号通路对RSV感染哮喘小鼠肺损伤的保护作用

目的探讨衢枳壳总黄酮通过核因子-κB(NF-κB)信号通路对呼吸道合胞病毒(RSV)感染哮喘小鼠肺损伤的保护作用。方法雌性BALB/c小鼠36只,随机分成正常组、模型组、阳性组和衢枳壳总黄酮低、中、高剂量组,每组6只。采用卵清蛋白(VOA)、RSV液建立哮喘模型;观察气道反应性;酶联免疫吸附法检测血清中白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13表达;生化法检测肺组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),肺组织进行苏木精-伊红(HE)染色,蛋白免疫印迹法(WB)检测NF-κB P65、核因子抑制蛋白(IκB)、IκB激酶(IκK)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白-3(Caspase-3)蛋白表达。结果与模型组比,衢枳壳总黄酮不同剂量组肺组织SOD、GSH-Px水平均升高,MDA水平降低,小鼠血清IL-4、IL-5及IL-13表达水平均降低(均P<0.05)。衢枳壳总黄酮不同剂量组及阳性组Caspase-3及细胞质IκBα、NF-κB P65蛋白表达均升高(均P<0.05)。结论衢枳壳总黄酮对RSV感染哮喘小鼠有抗炎、抗氧化应激作用,机制可能与NF-κB信号通路有关。

ICP-MS法分析衢枳壳中的无机元素

目的测定衢枳壳中无机元素的含量,并分析其特征。方法采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定衢枳壳中的无机元素,建立无机元素的指纹图谱,运用SPSS统计软件对结果进行主成分分析和相关性分析,并对重金属及有害元素进行安全性评价。结果检测了衢枳壳中26种元素,主成分分析选出了6个主成分,Mg、K、Ca、Na、Al、Cr、Mn、Cu、Rb、Sr、Ba是衢枳壳的特征无机元素;元素之间有一定的相关性,Mg、K、Ca的含量较高,重金属及有害元素的含量符合安全性相关标准。结论文中结果为衢枳壳的质量控制及安全性评价提供了依据,为衢枳壳药效研究和深层次开发提供了理论基础。